Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Trypanosoma cruzi, un protozoo hemoflagelado, es el agente causal de la enfermedad de Chagas, patología endémica de Latinoamérica que se ha extendido al resto del mundo. Este parásito presenta un ciclo de vida indirecto y se transmite principalmente mediante insectos hematófagos triatominos a distintos hospederos mamíferos, incluyendo el ser humano. Dentro de los mecanismos no vectoriales de transmisión de la enfermedad, los más importantes son la transfusión sanguínea y la infección transplacentaria. La enfermedad cursa en tres fases progresivas: aguda, indeterminada y crónica, pudiendo causar discapacidad e incluso la muerte. Las drogas utilizadas como tratamiento de esta patología son poco eficaces en el tratamiento de la fase crónica, además de generar numerosos efectos colaterales indeseados, siendo necesario desarrollar nuevas drogas más eficientes en la eliminación del parásito y más inocuas para el paciente. Para que se establezca una infección crónica, T. cruzi debe resistir el daño oxidativo al DNA generado por las células del hospedero. La sobrevida de los parásitos se relacionaría con la capacidad de reparación del DNA, donde en el caso de mamíferos la fosforilación de la histona H2AX en el residuo Ser139 sería fundamental. En tripanosomátidos no se han identificado genes ortólogos para H2AX, pero en T. brucei se detectó que la histona H2A canónica es fosforilada en el residuo Thr130 como consecuencia de daño al DNA, residuo que se conserva en otros tripanosomátidos y que en el caso de T. cruzi corresponde a Thr131. La participación de este último en la respuesta al daño del DNA aún no se ha comprobado. Se realizaron tres mutaciones sitio-dirigidas diferentes en la secuencia nucleotídica que codifica para el residuo Thr131 de H2A de T. cruzi, reemplazándolo por alanina (incapaz de ser fosforilada), ácido glutámico y ácido aspártico (que simulan una fosforilación permanente del sitio). Las secuencias nucleotídicas silvestres y mutantes fueron insertadas en el vector pTREX-HIS8-GFP y expresadas como proteínas de fusión con GFP en epimastigotes de T. cruzi. Se comprobó la expresión exitosa de las proteínas en T. cruzi mediante visualización directa por microscopía de fluorescencia, inmunofluorescencia y mediante ensayos de vi Western blot. Las histonas marcadas con GFP se localizan a nivel de núcleo, lo cual sugiere una asociación con la cromatina del parásito, debiendo confirmarse su incorporación efectiva al nucleosoma mediante estudios posteriores. Otra tarea a futuro consiste en determinar si efectivamente el residuo Thr131 de H2A de T. cruzi se fosforila como respuesta al daño del DNA. Los resultados permiten concluir que es posible generar líneas de epimastigotes de T. cruzi que expresen de manera estable la histona H2A tanto de fenotipo silvestre como de fenotipos mutantes para el residuo Thr131, utilizando el vector pTREX-HIS8-GFP. Los epimastigotes que expresan estas proteínas se encuentran disponibles para realizar ensayos de viabilidad comparativa frente a la exposición con agentes genotóxicos, lo que podría determinar un posible nuevo blanco terapéutico para la enfermedad de Chagas. / Proyectos Fondecyt 11100053 y 1130113

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Las especies reactivas de oxígeno (ROS) y nitrógeno (RNS) generadas por los hospederos mamíferos y vectores triatominos inducen daño oxidativo en el DNA de Trypanosoma cruzi, disminuyendo la viabilidad parasitaria. Para reparar este tipo de daño, este protozoario activa el mecanismo de reparación de escisión de bases del DNA (vía BER). En este proceso juegan un rol fundamental las endonucleasas apurínicas/apirimidínicas (AP). En esta Memoria de Título se determinó la viabilidad de epimastigotes de T. cruzi que sobreexpresan la AP endonucleasa TcAP1 frente a una exposición sostenida a estrés oxidativo, utilizando el sistema glucosa/glucosa oxidasa que origina H2O2. Usando un kit comercial se establecieron las concentraciones de glucosa y glucosa oxidasa necesarias para producir niveles sostenidos y conocidos de H2O2, simulando la exposición sostenida de T. cruzi a agentes oxidantes en ambos hospederos. Este sistema permitió establecer que los epimastigotes que sobreexpresan TcAP1 presentan una mayor viabilidad que parásitos controles, sometidos a estrés oxidativo sostenido. En conclusión, en esta memoria de título se determinó que la endonucleasa TcAP1 participa en la sobrevida de T. cruzi en condiciones que simulan la exposición fisiológica sostenida a agentes oxidantes en ambos hospederos. Estos resultados confirman la participación de la vía BER en la persistencia parasitaria en sus hospederos / Financiemiento: Proyecto Bicentenario Anillo ACT 112, Conicyt, Proyecto Fondecyt 1090124, y Proyecto Fondecyt 11100053