In this thesis we have investigated the effect of NFAT (Nuclear Factor of Activated T Cell) transcription factors on the expression of Rag-(Recombination Activating Genes) genes in murine thymus. The protein products of Rag genes, RAG1 and RAG2, are critical for the recombination and generation of the TCR (T Cell Receptor) repertoire during thymocyte development, and their expression can be suppressed by the activity of NFAT factors. In thymus, the expression of Rag1 and Rag2 genes is induced at the double-negative (DN, CD4-8-) 3 stage, down-regulated at the DN4 stage, re-induced at the double-positive (DP, CD4+8+) stage, and suppressed again at the single-positive (SP, CD4+8- or CD4-8+) stage. Although it is known that TCR signaling suppresses the expression of Rag1 and Rag2 at the SP stage, the signals that mediate the Rag gene down-reulation remain elusive. Here we report that both the calcineurin-NFAT-signaling and MAPKinase signaling pathways, which are activated by TCR signaling during positive selection, mediate the Rag gene down-regulation in DP thymocytes. The calcineurin-NFAT pathway suppresses both the Rag1 and the Rag2 gene expression. This pathway has a stronger suppressive effect on the Rag1 than the Rag2 gene. A synergistic activity between the two NFAT factors NFATc2 and NFATc3 is essential for calcineurin-NFAT signaling to efficiently suppress the Rag gene expression in DP thymocytes. It is likely that the calcineurin-NFAT signaling down-regulates Rag gene expression by suppressing both the Rag anti-silencer element (ASE) activity and the Rag promoter activity. Similarly, MEK-ERK signaling of MAPK signaling pathway mediates the Rag gene suppression in DP thymocytes although the mechanism through which MEK-ERK mediates the Rag gene down-regulation has to be elucidated. In DN thymocytes, it appears that neither the calcineurin-NFAT signaling nor MAPK signaling is involved in the Rag gene down-regulation. However, a role for these two signaling pathways in the Rag gene up-regulation in DN thymocytes is not excluded. In DN thymocytes, pre-TCR signaling stimulates the expression both Nfatc1 and Nfatc2 genes but has no effect on Nfatc3 gene expression. In DN thymocytes, pre-TCR signaling activates Nfatc1α expression but not Nfatc1ß expression, i.e. the two promoters controling Nfatc1 gene xpression are differently controled by pre-TCR signals. Nfatc1α gene expression in DN thymocytes is mainly regulated by the MAPK signaling pathway because activation of Nfatc1α is mediated by MEK-ERK signaling but opposed by JNK signaling. Calcineuirn-NFAT and p38 signaling pathways are not involved in Nfatc1α promoter regulation in DN thymocytes. In DP thymocytes, TCR signaling up-regulates Nfatc1 and Nfatc2 expression but down-regulates Nfatc3 expression. In DP thymocytes, TCR signaling activates Nfatc1α expression. The activation of Nfatc1α in DP thymocytes is mediated by NFATc1, but not or to a less degree by NFATc2 and NFATc3. MEK-ERK, JNK, and p38 signaling pathways are involved in Nfatc1α gene activation in DP thymocytes, probably by activating NFAT trans-activation activity. All these findings illustrate that in thymocytes the expression of NFAT transcription factors – which are essential for thymic development - is controled at multiple levels. / Wir haben in den experimentellen Arbeiten zu dieser Dissertation den Effekt der NFAT (Nuclear Factor of Activated T Cell)-Transkriptionsfaktoren auf die Expression der Rag (Recombination Activating)-Gene im Thymus der Maus untersucht. Die Proteine der beiden Rag-Gene, RAG1 und RAG2, sind entscheidend für die Bildung des TCR (T Zell-Rezeptor)-Repertoires, und ihre Expression wird durch die NFATs supprimiert. Während der Thymozyten-Entwicklung wird die Expression der Rag1- und Rag2-Gene in DN (double negative, CD4-8-) 3-Thymozyten induziert, in DN4-Thymozyten „herunterreguliert“, re-induziert in DP (double positive, CD4+8+)-Thymozyten und supprimiert in SP (single positive, CD4+8- oder CD4-8+) Thymozyten. Obwohl bekannt ist, dass der TCR-Signalweg die Expression von Rag1 und Rag2 in SP-Thymozyten supprimiert, sind die daran beteiligten Signale weitgehend unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass sowohl der Calcineurin-NFAT-Signalweg als auch der MAP Kinase-Signalweg die Rag-Gen- „Herunterregulierung“ in DP-Thymozyten vermitteln. Beide Wege werden über TCR-Signale während der positiven Selektion aktiviert. Der Calcineurin-NFAT-Signalweg supprimiert die Genexpression von Rag1 und Rag2, wobei Rag1 stärker betroffen ist. Dabei ist eine synergistische Aktiviät zwischen den beiden NFAT-Transkriptionsfaktoren NFATc2 und NFATc3 im Calcineurin-NFAT-Signalweg notwendig, um die Rag Genexpression in DP Thymozyten „herunterzuregulieren“. Der Calcineurin-NFAT-Signalweg reguliert offensichtlich die Rag-Genexpression durch eine Unterdrückung der Rag anti-silencer-element-(ASE)-Aktivität und der Rag-Promotoraktivität. Auch die MEK-ERK-Signalkaskade des MAPK-Signalwegs ist an der Suppression des Rag- Gens in DP Thymozyten beteiligt, wobei der Mechanismus zu untersuchen bleibt. In DN-Thymozyten hingegen scheinen weder der Calcineurin-NFAT-Signalweg noch der MAPK-Signalweg an der Hemmung der Rag-Genaktivität beteiligt zu sein. Eine Beteiligung dieser beiden Signalwege bei der Rag-Gen-Aktivierung in DN-Thymozyten kann hingegen nicht ausgeschlossen werden. In DN-Thymozyten regulieren Prä-TCR-Signale eine stärkere Expression der beiden NFAT-Faktoren Nfatc1 und Nfatc2, wohingegen Nfatc3 unbeeinflusst bleibt. In DN-Thymozyten aktivieren die Prä-TCR-Signale die Expression von Nfatc1α, aber nicht von Nfatc1ß. Die Nfatc1α Genexpression wird vermutlich hauptsächlich über den MAPK-Signalweg reguliert, da eine Aktivierung von Nfatc1α über MEK-ERK Signale vermittelt wird und JNK Signale gegensätzlich wirken. Der Calcineurin-NFAT- und der p38-Signalweg spielen keine Rolle bei der Regulation von Nfatc1α in DN-Thymozyten. In DP-Thymozyten erfolgt durch TCR-Signale eine Aktivierung der Nfatc1- und Nfatc2- sowie eine Represson der Nfatc3-Genexpression. In DP-Thymozyten aktivieren die TCR-Signale die Nfatc1α Expression. Die Aktivierung von Nfatc1α in DP Thymozyten wird über NFATc1 autoreguliert. NFATc2 und NFATc3 sind daran wenig oder gar nicht beteiligt. Hingegen sind MEK-ERK-, JNK- und p38-Signalwege bei der Nfatc1α−Genaktivierung in DP-Thymozyten - wahrscheinlich durch die Aktivierung der NFAT Transaktivierungsaktivität - beteiligt. All diese Daten zeigen, dass die NFAT-Transkriptonsfaktoren einer komplexen Regulation in Thymozyten unterzogen sind, deren Entwicklung sie andererseits – wie z.B. durch die Suppression der Rag-Gene – maßgeblich beeinflussen.

Die karzinogene Aktivität von Östradiol wurde bereits in mehreren Studien nachgewiesen und scheint das Ergebnis einer Kombination von hormonellen und genotoxischen Mechanismen zu sein. In der vorliegenden Arbeit konnte ein weiterer Mechanismus der Induktion chromosomaler Schäden durch Östradiol festgestellt werden. Es kam in der östrogenrezeptorpositiven Zelllinie MCF-7 zu einer konzentrationsabhängigen Steigerung der Zellproliferation und Mikrokernsteigerung, als Maß für die chromosomale Schädigung. In der östrogenrezeptornegativen Zelllinie MDA-MB231 konnte weder einer Steigerung der Zellproliferation, noch eine vermehrte Mikrokerninduktion nachgewiesen werden. Die Vermutung ist, dass die Zellen, durch den Proliferationsdruck den Zellteilungszyklus schneller durchlaufen und infolgedessen vermehrt Fehler im Replikationsablauf entstehen können. Zudem können wichtige Reparaturmechanismen oder Zellzykluskontrollpunkte nicht mehr adäquat agieren. / The carcinogenicity of sex hormones is considered to be the result of a combination of genotoxic and epigenetic modes of action. In this work are data presented on the induction of micronuclei in estrogen receptor-positive (MCF-7) and -negative (MDA-MB231) human breast cancer cell lines treated with estradiol to support an additional mechanism of chromosomal damage. MCF-7 cells, but not MDA cells, treated with estradiol in the picomolar concentration range showed an increase in micronucleus formation which correlated with the estradiol-induced cell proliferation. Addition of the specific estradiol-receptor antagonist hydroxytamoxifen suppressed the estradiol-induced formation of micronuclei in MCF-7 cells. The induced genomic damage may be explained by a hormone-specific forcing of responsive cells through the cell cycle, thereby overriding checkpoints operating under homeostatic control of the cell cycle.

Auf der Suche nach neuen Therapiemöglichkeiten für Tumorpatienten stellt die Immuntherapie mit gd T-Lymphozyten einen innovativen Ansatz dar. In vitro Zytotoxizität von Vg9Vd2 T-Lymphozyten wurde gegen eine Vielzahl von Tumorzellen belegt. Mit den Aminobisphosphonaten steht eine Reihe zugelassener und langjährig erprobter Medikamente zur Verfügung, die im Bereich therapeutisch verwendeter Dosierungen Vg9Vd2 T-Lymphozyten auch in vivo aktivieren können. Zudem ist Bromohydrin (BrHPP) als hochaffines synthetisches Phosphoantigen ein weiterer attraktiver Kandidat zur Aktivierung von gd T-Zellen und befindet sich am Menschen bereits in klinischen Studien. Strategien einer auf gd T-Zellen beruhenden Immuntherapie umfassen zum einen die in vitro Expansion von gd T-Lymphozyten mittels BrHPP oder Aminobisphosponaten mit anschließendem Transfer, dem so genannten adoptiven Zelltransfer auf den Patienten. Zum anderen kann die Anti-Tumoraktivität von Vg9Vd2 T-Lymphozyten auch direkt in vivo mittels Bisphosphonaten induziert werden, wie in einer Pilotstudie mit einem Anti-Lymphom- bzw. Anti-Myelom-Effekt bis hin zu einer klinischen partiellen Remission durch die Therapie mit einem Bisphosphonat (Pamidronat) und IL-2 eindrucksvoll gezeigt werden konnte. In der hier vorliegenden Arbeit wurde eine effektive Methode zur in vitro Proliferation von Vg9Vd2 T-Zellen mit Ausbildung ihrer Anti-Tumoraktivität durch BrHPP und durch das Bisphosphonat Zoledronat in Anwesenheit von IL-2 gezeigt. Weitergehend konnte mit Zytotoxizitätstestungen – basierend auf der Messung der Laktatdehydrogenase-Aktivität – die zytolytische Aktivität dieser expandierten gd T-Zellen gegenüber den primären Tumorzellen von insgesamt 8 Leukämie-Patienten, sowie je einem Patienten mit einem Lymphom und einem Plasmozytom nachgewiesen werden. Dadurch wurde einerseits das besondere Potential der gd T-Lymphozyten gegenüber hämatologischen Neoplasien unterstrichen, andererseits konnte ein Testverfahren gezeigt werden, mit dem das Spektrum empfindlicher Tumorzellen und Einflussgrößen untersucht werden können. In einem Experiment wurde dargestellt, wie die myelomonozytäre Zelllinie THP1 im Gegensatz zu ihrer sonst vorliegenden Anergie nach Vorbehandlung mit Zoledronat durch gd T-Zellen lysiert werden konnte. In einem autologen Versuchsansatz konnte die Anti-Tumoraktivität der gd T-Zellen eines Patienten mit der Diagnose eines follikuläres B-NHL durch Vorbehandlung der Lymphomzellen mit Zoledronat noch gesteigert werden. gd T-Zellen unterliegen als Teil des komplexen Immunsystems verschiedenen Regulationsmechanismen, die auch manipuliert werden können. In vitro Testverfahren – wie in dieser Arbeit – sind die Voraussetzung für eine Grundlagenforschung, mit deren Hilfe man in Zukunft zu einer hoffnungsvollen, auf gd T-Zellen basierenden Immuntherapie maligner Erkrankungen gelangen könnte. / During the last few years, knowledge about the innate effector lymphocytes – such as natural killer (NK) cells, NK T cells and gd T cells – has advanced enormously, while immunotherapeutic strategies based on gd T cells have received increasingly more attention. The main subset of gd T cells in the human peripheral blood – the Vg9Vd2 T cells – possess a cytotoxic effector activity against a variety of tumor cells in vitro. Aminobisphosphonates – licensed and widely used antiresorptive drugs in malignant and nonmalignant bone disease – have been identified as potent synthetic stimulators of Vg9Vd2 T cells in vitro and in vivo. Furthermore, bromohydrin pyrophosphate (BrHPP) is another highly potent synthetic phosphoantigen for gd T cells. Two strategies for the potential use of gd T cells in tumor immunotherapy are presently being envisaged. On one hand, in vitro expansion of gd T cells by aminobisphosphonates (ABP) or BrHPP in the presence of IL-2 with a resultant cell transfer – the so-called adoptive transfer – to the patient, has shown promising results in animal models. On the other hand, there is the possibility of in vivo therapeutic administration of gd-stimulating synthetical phosphoantigens (ABP or BrHPP) in combination with low dose IL-2 in cancer therapy. In a pioneer pilot study, treatment with a second-generation ABP, Pamidronate, in combination with IL- 2 induced an objective antitumor activity in patients with low-grade non-Hodgkin lymphoma or multiple myeloma. The correlation of expansion of gd T cells in vivo with the clinical response (tumor stabilization or partial remission) demonstrated in this study the feasability of gd T-cell immunotherapy. Phase 1 clinical trials designed to evaluate BrHPP combined with low-dose IL-2 in patients with renal cell carcinoma and relapsed lymphoma are ongoing. In the presented medical thesis, peripheral Vg9Vd2 T cells were activated and expanded to large in vitro clones by stimulation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) with BrHPP in the presence of low-dose IL-2. After 12 to 16 days, cultures derived from patient’s PBMCs contained a percentage of gd T cells ranging between 75 % and 92 % (from an initial 4 % – 6 %) with an accompanying 2 to 4-fold increase in the absolute cell counts. Through this protocol, numerous gd T cells can be made available for in vitro experiments or for potential adoptive cell transfers. Furthermore, the capacity of expanded gd T cells from healthy donors to lyse primary tumor cells from patients were analysed with a cytotoxicity assay, based on the release of the enzyme lactate dehydrogenase (LDH). Our examinations displayed a strong cytotoxic effector activity of gd T cells against tumor cells from eight patients with acute myeloid and acute lymphocytic leukemia. The CD69 expression – as an early activation marker – of native gd T-cells induced through the tumor cells was not correlated to the antitumor effect of BrHPP-activated gd T cells against these tumor cells. This may be a consequence of distinct pathways – a TCR-dependent pathway and a natural killer-like pathway - for antitumor immunity. In an autologous experiment, gd T cells of a patient with a non-Hodgkin’s lymphoma showed cytotoxicity against the malignant cells. Additionally, the gd T-cells from this patient exhibited a markedly enhanced cytotoxicity against lymphoma cells pretreated with Zoledronate – currently the most potent third-generation ABP – as compared with untreated lymphoma cells. Further, we showed that the THP-1 tumorline (myelomonocytic leukemia) became susceptible to gd T cell-mediated cytotoxicity following pretreatment with Zoledronate, while normal THP-1 cells remained resistant. These observations outline the critical role of gd T cell population in immune surveillance, particularly against hematopoietic malignancies and the possibility to benefit from synthetical phosphoantigens for this immunotherapeutic approach. In vitro analysis – as demonstrated here – are the presupposition for evaluating future immunotherapeutic strategies with gd T lymphocytes.

Kernpunkt dieser Arbeit ist die interessante pharmakologische Regulation der 2PDK+- Kan�le durch Inhalationsan�sthetika. �ber die molekularen Grundlagen dieser Interaktion und deren Bedeutung in vivo ist noch immer sehr wenig bekannt. Am Beispiel von Halothan, das in der aktuellen Literatur in diesem Zusammenhang am h�ufigsten verwendete Inhalationsan�sthetikum, soll im Hauptteil der Arbeit mit elektrophysiologischen Methoden die Wirkung der Inhalationsan�sthetika auf den Aktivit�tszustand der unterschiedlichen Subgruppen der 2PD-K+-Kan�le beschrieben werden. Die in Xenopus-Oozyten exprimierten 2PD-K+-Kan�le dienen hierbei als Modell nativer 2PD-K+-Kan�le. Es wird eine pharmakologische Konzentrations-Wirkungs-Beziehung erstellt, mit der anschlie�end R�ckschl�sse auf die Bedeutung der 2PD-K+-Kan�le f�r die Vermittlung der Narkose gezogen werden k�nnen. Es soll auch untersucht werden, ob diese Halothanwirkung durch andere physiologische Regulatoren der 2PD-K+- Kan�le beeinflusst wird. Im zweiten Teil dieser Arbeit soll anhand von Mutagenese bestimmter Kanalabschnitte der molekulare Wirkmechanismus von Halothan genauer charakterisiert werden: Liegt dem beobachteten Ph�nomen eine Ligandenbindung nach dem Schl�ssel-Schloss-Prinzip zugrunde oder vermitteln kompliziertere Mechanismen, etwa ein Ionenkanal-Gate oder komplexe intrazellul�re Signalwege, die Wirkung von Halothan auf die 2PD-K+-Kan�le? / Two-pore domains potassium channels (K2P) are substrates for resting K+ currents in neurons. Thus, they play integral roles in cell signaling pathways by modifying cell membrane resting potential and represent important targets for multiple endogenous modulators, as well as for clinically important compounds such as volatile anesthetics. In electrophysiological studies in the heterologous expression system of Xenopus laevis, a pharmacological profil of this interaction is characterised for certain members of this family. Additionally, the current work investigates the molecular basis of this interaction using site directed mutagenesis experiments.

Im Rahmen dieser Studie sollte die Frage beantwortet werden, ob sich einzelne SNPs oder Haplotypen als biologische Marker affektiver Psychosen identifizieren lassen. Hierfür sollten Assoziations- und Haplotypuntersuchung an zwei Kandidatengenen, FKBP5 und G72 DAOA/G30, mit unterschiedlichen pathophysiologischen Theorien, durchgeführt werden. Das auf der Kortisolhypothese basierende Kandidatengen FKBP5 liegt auf dem Chromosom 6 p21 und stellt ein wichtiges Regulatorprotein für den Glukokortikoid- Rezeptor (GR) dar. In FKBP5 wurden drei SNPs mit einem schnelleren Ansprechen auf Antidepressiva assoziiert gefunden: rs4713916 in der vermuteten Promoterregion, rs1360780 im 2. Intron und rs3800373 im nicht translatiertem 3Ende (Binder et al. 2004). Die vorbeschriebenen Polymorphismen sollten in einem unabhängigen Kollektiv auf Assoziation mit affektiven Psychosen untersucht werden, um eine Rolle von FKBP5 bei der Ätiopathogenese affektiver Psychosen zu überprüfen oder einen Einfluss auf verschiedene Variable des Krankheitsverlaufs zu bestätigen. In unserer Studie mit 248 Fällen und 188 Kontrollen unterschieden sich die untersuchten SNPs in FKBP5, rs4713916, rs1360780 und rs3800373 in ihrer Verteilung nicht bei Erkrankten und Gesunden. Den einzigen signifikanten Hinweis für eine Assoziation mit affektiven Erkrankungen bot der Risikophaplotyp G-C-G mit einer Odds Ratio von 6,4, der jedoch nur bei 2,1% der Fälle vorkam. Auch zeigte sich kein Zusammenhang mit den untersuchten klinischen Parametern. Die Untersuchungsergebnisse können somit einen wesentlichen Beitrag von FKBP5 für die depressive Erkrankung nicht belegen. Es erscheint daher fraglich, ob Polymorphismen in FKBP5 als biologische Marker affektiver Psychosen dienen können. Das zweite Kandidatengen G72 DAOA /G30 war durch positive Kopplungsbefunde des chromosomalen Locus für die bipolare Störung und schizophrenen Psychosen identifiziert worden. Neuere Befunde lassen einen Einfluss auf das glutamaterge Transmittersystem vermuten (Chumakov et al. 2002). Das Genprodukt von G72, D-Amino-Oxidase (DAOA) fördert die Oxidation von D-Serine durch D-Amino-Oxidase (DAO), was zum Beinamen D-Amino-Oxidase-Aktivator (DAOA) führte. Da D-Serin ein wichtiger Aktivator des NMDA Glutamatrezeptors ist, könnte G72/DAOA einen wichtigen Faktor für die glutamatergen Signaltransduktion darstellen. Mehrfach wurde eine Assoziation von 69 Markern im Locus G72/G30 mit der bipolaren Depression aber auch schizophrenen Psychosen beschrieben (Detera-Wadleigh et al. 2006). In der Studie sollte eine mögliche Assoziation von SNPs in G72/G30 mit der Erkrankung überprüft und die vorbeschriebenen LD-Blöcke am 5Ende von G72 näher untersucht werden. Dafür wurden sieben SNPs, die sich über den chromosomalen Locus von G72/G30 verteilen, bei 429 Fällen mit affektiven und zykloiden Psychosen und 188 Kontrollen, untersucht. Durch die LD-Analyse der untersuchten SNPs konnte die Ausdehnung der vorbeschriebenen LD-Blöcke in G72 genauer definiert und rs9558575 dem 1. Block zugeordnet werden, der somit bis zum 5-Ende vom G72 reicht. Der SNP rs9558575 am 5- Ende vom G72 wurde erstmalig in dieser Studie untersucht. Trotz adäquater Power (80% bei α = 0,05) erreichte kein Einzelmarker Signifikanzniveau (Tabelle 17). Dennoch zeigten sich Hinweise für eine Beteiligung von G72/G30 am Erkrankungsrisiko, insbesondere für den SNP rs2391191 bei den zykloiden Psychosen. Darüber hinaus scheint der Risikohaplotyp rs2391191A / rs3916966C sowohl für die zykloiden Psychosen (p = 0,002), als auch für die Gesamtgruppe der Affektpsychosen (p = 0,017) ein geeigneter biologischer Marker zu sein. Die in der vorliegenden Studie gefundene Assoziation mit zykloiden Psychosen könnte dabei helfen, die Vorbefunde für G72/G30 als Risikogen sowohl für die bipolare Depression als auch schizophrenen Psychosen zu erklären, da die zykloiden Psychosen nach IDC10 beiden Krankheitsentitäten zugerechnet werden können. / In this dissertation two susceptibility genes, FKPP5 and G72/DAOA for the manic depression and monopolar depression were examined by genotyping several single nucleotide polymorphisms (SNPs). In summary, our data do not support a significant genetic contribution of FKBP5 or G72/DAOA to the pathogenesis of affective psychosis in the analysed markers; they may play a role as a disease modificatory factors. FKBP5: A dysregulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis has been proposed as an important pathogenic factor in depression. Genetic variants of FKBP5, a protein of the HPA system modulating the glucocorticoid receptor, have been reported to be genetically associated with improved response to medical treatment and an increase of depressive episodes. We examined three single nucleotide polymorphisms (SNPs) in FKBP5, rs4713916 in the proposed promoter region, rs1360780 in the second intron and rs3800373 in the 3’-untranslated region (3’-UTR), in a case-control study of Caucasian origin (affective psychosis: n= 248; controls: n= 188) for genetic association and association with disease related traits. Allele and genotype frequencies of rs4713916, rs1360780 and rs3800373 were not significantly different between cases and controls. Odds ratios were not increased between cases and controls, except the rare haplotype G-C-G (OR 6.81), representing 2.1% of cases and 0.3% of controls. The frequency of rs4713916AG in patients deviated from expected Hardy-Weinberg equilibrium, the genotype AA at rs4713916 in monopolar depression (P= 0.011), and the two-locus haplotype rs1360780T - rs3800373T in the total sample (overall P= 0.045) were associated with short duration of disease. In summary, our data do not support a significant genetic contribution of FKBP5 to affective psychosis in the analysed markers, and the findings are inconclusive regarding putative risk haplotypes or association with disease-related traits. G72/DAOA: The chromosomal region 13q32-33 has been found to be linked with bipolar disorder and schizophrenia in several studies. After the description of two genes, G72 and G30, in this region by Chumakov et al 2002, association studies revealed evidence for an association of SNPs at G72/G30 with bipolar disorder, but the results remained heterogeneous with differing risk alleles and missing replication. We examined seven single nucleotide polymorphisms (SNPs) around G7/G30: rs3916966, rs1935058, rs2391191, rs1935062, rs947267, rs3918342, rs9558575, in a case-control study of Caucasian origin (affective psychosis: n= 248; controls: n= 188) for genetic association. Allele and genotype frequencies were not significantly different between cases and controls, no single marker reached statistical significance. We found different specific marker combinations associated with manic depression rs1935062, rs2391191, rs3916966 (overall P=0.022 and monopolar affective disorder, rs1935058, rs947267, rs2391191, rs3916966, rs9558575 (overall P= 0.036), but no well-defined risk haplotype. Our data revealed no clear-cut association with polymorphisms and haplotypes in G72 with disease and did not support a significant genetic contribution of G72 to the pathogenesis of affective psychosis.

Zwangsstörungen, im englischen als Obsessive Compulsive Disorder (OCD) bezeichnet, sind sowohl in der Erwachsenen- als auch in der Kinder- und Jugendpsychiatrie bekannte Krankheitsbilder, die mit einer Lebenszeitprävalenz von 2,5 – 3% zu den häufigsten psychiatrischen Erkrankungen im Kindes- und Jugendalter gehören. Sie stellen in der Regel eine erhebliche Belastung sowohl für die betroffenen Kinder als auch für deren Familie dar und schränken den alltäglichen Lebensablauf je nach Ausprägung erheblich ein. Familien- und Zwillingsuntersuchungen zeigen, dass bei Zwangsstörungen eine deutliche familiäre Belastung vorliegt. Gerade bei einer frühen Manifestation im Kindesalter (auf englisch als early onset bezeichnet) konnten Familienstudien zeigen, dass genetische Faktoren eine besonders ausgeprägte Rolle spielen. Diese formalgenetischen Studien legen weitere Untersuchungen auf molekulargenetischer Ebene für Zwangsstörungen im Kindes- und Jugendalter nahe. Pharmakologische Studien und erste molekulargenetische Studien verweisen zudem auf einen Zusammenhang zwischen Zwangs- und Angstsymptomen und dem Serotoninstoffwechsel. Selektive Serotonin Wiederaufnahme-Hemmer (Selective Serotonine Reuptake Inhibitors, SSRI) und tricyclische Antidepressiva sind bei der Behandlung von Zwangsstörungen besonders wirksam. Auch im Kindes- und Jugendalter sind diese Medikamente aufgrund ihrer positiven Wirkung bei Zwangsstörungen Mittel der ersten Wahl. Insgesamt wird die Pathogenese der Zwangsstörungen nach aktuellem Forschungsstand als multifaktoriell angenommen. Dabei bezieht sich bisher die überwiegende Zahl der Untersuchungen auf Zwangsstörungen erwachsener Patienten. Nach aktuellem Kenntnisstand handelt es sich bei der vorliegenden Arbeit um die ersten familienbasierten Assoziationsstudien bei Kindern und Jugendlichen mit Zwangsstörungen. Zielsetzung dieser Arbeit war die Untersuchung einer Assoziation von Varianten in ausgewählten Genen des serotonergen Systems und juvenilen Zwangsstörungen. Die Auswahl der Kandidatengene für Zwangsstörungen erfolgte auf patho-physiologischen Überlegungen: Die Tryptophanhydroxylase als geschwindigkeits-bestimmendes Enzym in der Synthese von Serotonin, der Serotonin-1B-Rezeptor als Zielorgan mit autoregulierender Funktion auf das serotonerge System, sowie der Serotonintransporter, der, therapeutisch genutzt, von SSRIs blockiert wird. Untersuchungen zu den genannten Kandidatengenen liegen bei erwachsenen Patienten mit Zwangsstörungen vor, die Ergebnisse sollten in unserer Studie repliziert werden. 64 Kinder und Jugendliche, sowie deren leibliche Eltern wurden in die Untersuchung eingeschlossen. In den vorliegenden molekulargenetischen Untersuchungen konnten für Varianten im Tryptophanhydroxylase-1-Gen und dem Serotonin-1B-Rezeptor-Gen kein Zusammenhang mit Zwangsstörungen bei Kindern und Jugendlichen gesehen werden. Die funktionelle Variante des Serotonintransporter-Gens, die zu einer höheren Aktivität des Transporters führt, wurde tendenziell häufiger bei den Patienten mit Zwangsstörungen beobachtet. Der Befund entspricht damit in der Richtung den früheren Befunden von erwachsenen Patienten. / Obsessive Compulsive Disorder (OCD)is a common psychiatric disorder in adults, but also in children and adolescents. A strong genetic impact has been shown particulary in early-onset ocd. In this investigation variants of three serotonin system candidate genes (tryptophan hydroxylase 1, serotonin transporter, serotonin autoregulation-receptor 1B) were studied for an association with early-onset ocd in 64 triads.

Die diffusen großzelligen B-Zell-Lymphome (DLBCL) stellen den häufigsten Typ aller Non-Hodgkin-Lymphome dar, sind aber morphologisch, immunologisch, genetisch und klinisch eine sehr heterogene Gruppe. Aufgrund dieser Heterogenität von DLBCL wurde in mehreren Studien untersucht, ob eine molekulare Heterogenität der Tumoren vorläge, bzw. versucht, eine molekulare Reklassifikation zu erreichen. Resultat dieser Bemühungen war eine Unterscheidung bzw. Definition einer Keimzentrums- ähnlichen (GCB-cell-like) Gruppe und einer aktivierten B-Zellen-ähnlichen (ABC-like) Gruppe, die sich in ihrem Ansprechen auf übliche Therapieschemata, mit einer deutlich besseren Prognose für die GCB-like-Gruppe, unterschieden. Die hierbei angewendete Microarray-Technologie hat den entscheidenden Nachteil, dass hierfür qualitativ hochwertige RNA zur Verfügung stehen muss. Neu ist der Ansatz, unterschiedliche Proteinexpressionsmuster am Paraffinmaterial zur Unterscheidung prognostisch relevanter Gruppen heranzuziehen. Die hierbei erzielten Daten sind allerdings in Ihren Aussagen hinsichtlich der prognostischen Wertigkeiten widersprüchlich. In der vorliegenden Arbeit wurden zunächst verschiedene biologische Parameter am Paraffinmaterial hinsichtlich ihrer prognostischen Wertigkeit in der Risikostratifikation von DLBCL untersucht. In einem ersten Schritt wurden klinische Daten von 99 de novo entstandenen großzelligen B-Zell-Lymphomen erhoben, bei denen es sich um 84 DLBCL und um elf DLBCL mit einer weiteren Komponente eines follikulären Lymphoms Grad 3B bzw. auch um vier Fälle mit ausschließlich follikulärem Wachstumsmuster handelte. Die Klassifikation der Fälle nach dem Internationalen Prognostischen Index (IPI) sowie der einzelnen klinischen Parameter des IPI zeigte eine deutliche prognostische Relevanz. In einem zweiten Schritt wurden immunhistochemische Färbungen mit verschiedenen Antikörpern durchgeführt und auf ihre prognostische Bedeutung überprüft. Als negative prognostische Parameter erwiesen sich die Negativität für CD10 sowie BCL-6, also Antigene, die mit einer Keimzentrumszell-Differenzierung assoziiert werden, sowie eine Überexpression von MUM-1, das mit einer postfollikulären Differenzierung assoziiert wird. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass einer Expression von BCL-2 und einem Ki67-Index von unter 80 % eine negative prognostische Bedeutung zukommt. Die Stratifikation der Fälle in einen GCB- und einen ABC- Typ anhand des Hans-Klassifikators zeigte nur eine schwache Korrelation zur Überlebenswahrscheinlichkeit. In einem dritten Schritt wurde gezeigt, dass die kombinierte Analyse jeweils zweier Parameter eine relative Abhängigkeit ihrer Expression von der Expression weiterer Marker erkennen ließ. Aus diesem Grunde wurde ein Modell einer sequentiellen Addition negativer prognostischer Indikatoren entwickelt, in der bei Anwesenheit einer negativen Variable (CD10-Negativität, BCL-6 < 20%, BCL-2 positiv, MUM-1&#8805; 50% und Ki67 < 80%) ein negativer Faktor gewertet und die Summe dieser als Risiko-Score angegeben wurde. Die Stratifikation der Patienten anhand dieses „kombinierten immunhistochemischen Risiko-Scores“ zeigte drei prognostisch deutlich unterschiedliche Gruppen: In der Gruppe von Patienten ohne Risikofaktoren verstarb lediglich eine Patientin (die eine Behandlung abgelehnt hatte); in der Hochrisikogruppe (Score 5) verstarben alle Patienten innerhalb eines Jahres. Die multivariate Analyse des Scores ergab dabei eine Unabhängigkeit von den Parametern des IPI. In der intermediären Gruppe mit einem Risiko-Score von 1-4 zeigten sich der IPI sowie eine LDH-Erhöhung und das Vorhandensein einer B-Symptomatik als geeignete Parameter, um hier eine weitere Stratifizierung durchzuführen. Die vorliegende Arbeit stellt somit eine Erweiterung der publizierten Ansätze einer Erfassung prognostischer Indikatoren in kombinierten Algorithmen dar. Eine Verifizierung der gezeigten Ergebnisse in einer homogen behandelten Patientengruppe innerhalb einer klinischen Studie muss Ziel weiterer Untersuchungen sein. / Diffuse large B-cell Lymphomas (DLBCL)are heterogeneous in morphologic, immunologic, genetic and clinical features. In different studies a molecular reclassification of this hetreogeneous group has been tried to establish, defining a germinal center B-cell-like group (GCB)and a activated B-cell-like group (ABC), with a better prognosis for the GCB-like group in responding to chemotherapy. Another way to differentiate prognostically relevant groups in DLBCL is by getting different protein expression patterns by using paraffin embedded material. In this study different biological parameters were analysed for their prognostic relevance. Clinical data of 99 de novo large B-cell lymphomas was collected, including 84 DLBCL, 11 DLBCL with a component of a follicular lymphoma grade 3B and 4 lamphomas with only a follicular growth pattern. Classification using the International Prognostic Index and its items in particular showed a significant clinical relevance. In a second step immunohistochemically revealed antibodies were examined for their prognostically relevance. As negative prognostic factors were found CD10-negativity and bcl-6, both beeing associated with a germinal center- differentiation. Another negative prognostic factor was MUM-1-overexpression, beeing associated with a postfollicular differentiation. Expression of bcl-2 und a Ki67-index below 80% indicated a negative prognosis as well. Stratification by using the Hans-Classificator showed a non-significant correlation of overall survival. In a third step a combined analysis of the parameters by looking for prognostic significance showed that the expression of one parameter was dependent of the expression of other parameters. Therefore a score was developed by using a sequentially addition of every negative prognostic factor (CD10-negativitiy, bcl-6 <20%, Bcl-2-positivity, MUM-1 >=50% and Ki67 <80%). Stratification of the patients using this "combined immunohistochemical risc score" showed three significantly different groups: In the group without any risc factor only one patient died (who had denied any treatment), in the high risk group (score 5) all patients died within one year. Multivariate analysis of the score showed independence of the IPI-parameters. In the intermediate risk group (score 1-4) the IPI-parameters as well as high LDH-levels and any B-symptoms were useful to make a further risk stratification. The present study extends the studies published trying to find prognostic indicators in combined algorithms. Verification of the presented results by a homogeneous treated patient group using a controlled clinical study has to be evaluated in further studies.

Die bullösen Autoimmundermatosen sind organspezifische Autoimmunkrankheiten, die durch das Auftreten einer Autoimmunantwort gegen Strukturproteine der Haut gekennzeichnet sind. Diese Proteine sind wichtig für den Zell-Zell-Kontakt der Keratinozyten bzw. für die Adhäsion der Epidermis auf der Dermis. Die blasenbildenden Autoimmunkrankheiten werden nach den betroffenen Zielstrukturen eingeteilt. Man unterscheidet vier Hauptgruppen: die Pemphigus- und Phemphigoid-Erkrankungen, die Epidermolysis bullosa acquisita und die Dermatitis herpetiformis Duhring. Entscheidend für die Diagnosestellung von bullösen Autoimmundermatosen sind Klinik, Histologie sowie direkte und indirekte Immunfluoreszenzuntersuchung. Zur exakten Einordnung der verschiedenen bullösen Dermatosen ist die Charakterisierung der Autoantikörper durch immunserologische Tests notwendig. In der vorliegenden Arbeit beschäftigten wir uns mit der Optimierung des Immunoblotnachweises. Wir untersuchten die Seren von 120 Patienten mit bullösen Autoimmundermatosen mit Extrakten kultivierter Keratinozyten. 63 von 78 Patienten mit bullösem Pemphigoid erkannten entweder BP180 oder BP230. 16 von 18 Patienten mit Pemphigoid gestationis reagierten ebenfalls mit BP180 seltener auch mit BP230. Fünf von 6 Patienten mit Pemphigus vulgaris erkannten Desmoglein 3, einer davon zusätzlich Desmoglein 1. Zwei von 2 Patienten mit Pemphigus foliaceus reagierten mit Desmoglein 1. Fünf von 5 Patienten mit paraneoplastischem Pemphigus zeigten eine Reaktivität mit Envo-, Peri- oder Desmoplakin. Drei von 11 Patienten mit Schleimhautpemphigoid reagierten mit Laminin 5, ein Patient mit BP180. Autoantikörper gegen Kollagen Typ VII und Beta4-Integrin konnten mit Extrakten kultivierter Keratinozyten nicht nachgewiesen werden. Deshalb versuchten wir in weiteren Experimenten, den Nachweis dieser beiden Antigene zu optimieren. Zwei von 2 Patienten mit Epidermolysis bullosa acquisita erkannten Kollagen Typ VII in dermalen Extrakten und konzentriertem Überstand von kultivierten Keratinozyten. Autoantikörper gegen Beta4-Integrin konnten mit extrazellulärer Matrix von kultivierten Keratinozyten in 3 von 12 Seren von Patienten mit Schleimhautpemphigoid nachgewiesen werden. Da der Nachweis von Laminin 5 mit Extrakten kultivierter Keratinozyten nicht zufriedenstellend war, wurde auch dieser Immunoblotnachweis weiter optimiert. Wir konnten zeigen, dass die extrazelluläre Matrix kultivierter Keratinozyten ein besser geeignetes Substrat zum Nachweis von Antikörper gegen Laminin 5 ist, vor allem zum Nachweis der IgG-Subklassen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen insgesamt, dass das Extrakt kultivierter Keratinozyten den größten Teil der verschiedenen Antigene der bullösen Autoimmundermatosen enthält und somit ein effizientes Substrat für den Immunoblotnachweis darstellt. Der Nachweis von Autoantikörper gegen Laminin 5 ist zwar ebenfalls mit diesem Extrakt möglich, sensitiver ist jedoch der Nachweis unter Verwendung extrazellulärer Matrix. Mit extrazellulärer Matrix gelingt auch der Nachweis von Autoantikörpern gegen Beta4-Integrin. Weiterhin konnten wir zeigen, dass der konzentrierte Überstand von kultivierten Keratinozyten zum Nachweis von Autoantikörpern gegen Kollagen Typ VII eine gute Alternative zum dermalen Extrakt darstellt. / Autoimmune bullous skin diseases are organ specific autoimmune disorders characterized by autoantibodies against various structural proteins of the skin. These proteins are responsible for cell-to-cell or cell-to-matrix adhesion. Binding of autoantibodies to these proteins results in intra-epidermal or subepidermal blisters. The autoimmune bullous skin diseases are divided into 4 main groups according to the target autoantigen: pemphigus diseases, pemphigoid diseases, epidermolysis bullosa acquisita and dermatitis herpetiformis Duhring. Decisive for the diagnosis of autoimmune bullous skin diseases are clinic, histology, direct and indirect immunofluorescence. For the exact differential diagnosis of the various autoimmune bullous skin diseases immunoserological analysis are necessary. In this study we tried to optimise the immunoblotting analysis. 120 sera from patients with autoimmune bullous skin diseases, including pemphigus vulgaris, pemphigus foliaceus, paraneoplastic pemphigus, bullous pemphigoid, pemphigoid gestationis and mucous membrane pemphigoid, were immunoblotted on the keratinocyte extract. Among the 120 sera, 95 showed detectable levels of immunoreactivity to their respective antigens. 63 of 78 sera from patients with bullous pemphigoid detected bands corresponding to BP180 and BP230. 16 of 18 sera from patients with pemphigoid gestationis reacted as well with BP180, rarely with BP230. Five of 6 sera from patient with pemphigus vulgaris recognized Desmoglein 3, one additionally Desmoglein 1. Both patients with pemphigus foliaceus reacted with Desmoglein 1. All sera from patients with paraneoplastic pemphigus detected bands corresponding to Envo-, Peri-, or Desmoplakin. Three of 11 sera from patients with mucous membrane pemphigoid reacted with laminin 5, one with BP180. Autoantibodies to type 7 collagen and beta4-integrin were not detected by immunoblotting with keratinocyte extract. Therefore, we tried to optimise the detection of autoantibodies to type 7 collagen and beta4-integrin. Both sera from patients with epidermolysis bullosa acquisita recognized type 7 collagen in dermal extract and in medium of cultured keratinocytes. In 3 of 12 patients with mucous membrane pemphigoid we were able to detect autoantibodies to beta4-integrin extracted from the extracellular matrix of human keratinocytes. In a next set of experiments, we optimised the detection of autoantibodies against laminin 5. We could show that extracellular matrix of human keratinocytes was the most sensitive substrate for the detection of autoantibodies to laminin 5. This study shows that most of the target antigens in autoimmune bullous skin diseases could be detected with immunblotting analysis using keratinocyte extract. While the detection of autoantibodies to laminin 5 with keratinocyte extract is possible, the extracellular matrix of human keratinocytes represents a more sensitive substrate. Autoantibodies to beta4-integrin can also be detected with extracellular matrix of human keratinocytes. Furthermore we can show that medium of cultured keratinozytes represents a good alternative substrate to dermal extract in the detection of autoantibodies to type 7 collagen.

Es konnte erstmals gezeigt werden, dass Tumor Nekrose Faktor-&#945; (TNF- &#945;) (TNF-&#945;) in pathophysiologisch relevanten Konzentrationen neben seiner bekannten negativ inotropen Wirkung einen deutlichen Effekt auf die myokardiale Energetik im Myokard der Ratte besitzt. Dieser wurde anhand des Sauerstoffverbrauchs an rechtsventrikulären Muskelstreifenpräparaten quantifiziert. Der erhöhte Energieumsatz bei gleichzeitig reduzierter myokardialer Arbeit, d.h. der gesteigerte spezifische Sauerstoffverbrauch, basiert auf einer verschlechterten Ökonomie des Kontraktionsprozesses. Diese schnelle Wirkung auf die myokardiale Energetik ist durch einen Sphingolipid Signaltransduktionsweg vermittelt. Dagegen spielt wohl für den mechanischen Effekt von TNF-&#945; sowohl NO, als auch Sphingosin eine Rolle. / Objective: Several experimental studies have demonstrated that tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;) impairs myocardial contractility. It was the aim of the present study to test the hypothesis that TNF-&#945; influences myocardial energy metabolism as well. Methods: Oxygen consumption (MVO2) of isometrically contracting trabeculae isolated from right ventricular rat myocardium was analyzed using a clark-type oxygen probe. The slope of the force-time integral-MVO2 regression line indicates economy of contraction. Results: TNF-&#945; impaired myocardial economy without altering baseline MVO2. Incubation with TNF-&#945; in the presence of the NO-synthase inhibitor L-NAME further impaired myocardial economy. Pre-incubation with the ceramidase inhibitor NOE abrogated the TNF-&#945; effect on myocardial economy. The negative inotropic effect of TNF-&#945; was observed in NOE, but not in L-NAME pre-incubated muscle fibers. Moreover, exogenous sphingosine mimicked the TNF-&#945; effect on mechanics and energetics. Conclusion: TNF-&#945; impairs the economy of chemo-mechanical energy transduction primarily through a sphingosine-mediated pathway.

Der intrazelluläre Hormonrezeptor PPARgamma spielt eine Rolle in vielen Differenzierungsprozessen. Zudem konnte in multiplen malignen Tumoren verschiedenen Ursprungsgewebe gezeigt werden, dass sowohl Proliferation als auch Apoptose beeinflusst werden können und so eine neuartige antiproliferative Therapieoption bestehen könnte. Im Barrettadenokarzinom des distalen Ösophagus, einer malignen Neoplasie auf dem Boden von Magensäure- und Dünndarmsekretreflux, sind diese Zusammenhänge bisher nicht ausreichend untersucht. Ziel dieser Studie sollte eine Untersuchung von Proliferation und Apoptose des Barrettadenokarzinoms unter dem Einfluss von einer PPARgamma-Aktivierung durch den synthetischen Agonisten Pioglitazon sein. Dazu wurden in vitro Zelllinien von Barrettadenokarzinomen und von Plattenepithelkarzinomen sowie humane Barrettgewebeproben auf Expression von PPARgamma untersucht. Zudem wurde nach Stimulation mit Pioglitazon die Wirkung auf Proliferation und Apoptose gemessen. Nach Generierung von soliden Tumoren in immundepletierten balb/c nu/nu Mäusen wurden diese mit Pioglitazon-haltigem Actos® stimuliert und das Tumorwachstum mit einer Kontrollgruppe verglichen. Zudem wurden nach Explantation der Tumore histologisch Apoptose- und Proliferationsverhalten bestimmt. Wir konnten zeigen, dass PPARgamma in humaner Barrettmukosa und in der humanen Barrettadenokarzinomzelllinie OE33 überexprimiert ist. PPARgamma-Aktivierung inhibiert das Wachstum von OE33-Barrett-Adenokarzinomzellen in vitro durch eine Induktion von Apoptose, während das Wachstum von transplantierten Tumoren, die von OE33-Zellen abgeleitet wurden, in vivo durch systemische PPARgamma-Aktivierung auf dem Boden einer gesteigerten Proliferation und einer Hemmung der Apoptose verstärkt wurde. Diese Ergebnisse charakterisieren PPARgamma als einen potentiellen molekularen Mediator, der in die Entwicklung eines Barrettepithels mit Metaplasie aus normalem Plattenepithel in dem gastro-ösophagealen Übergang involviert ist. / Backround&Aims: The nuclear hormone receptor peroxisome proliferator activated receptor gamma&#61472; (PPARgamma) is a key transcription factor regulating a broad spectrum of target genes involved in adipogenesis, glucose homeostasis and cell differentiation. In addition, PPARgamma has been demonstrated to control proliferation and apoptosis in various types of cancer cells. The objective of this study was to characterize the biological effects of PPARgamma activation in Barrett’s esophagus and Barrett’s adenocarcinoma. Methods: PPARgamma&#61472;expression was investigated in endoscopic biopsies of the gastroesophageal junction and in Barrett’s epithelium as well as cancer cell lines derived from Barrett’s adenocarcinoma and squamous epithelium cancer of the esophagus by Western blot, fluorescence immunocytochemistry and semiquantitative competitive RT-PCR. Effects of PPARgamma activation by the thiazolidinedione pioglitazone on cell proliferation and apoptosis were assessed in cell culture in vitro and in mice bearing transplantable Barrett´s adenocarcinoma tumors in vivo. Results: PPARgamma mRNA and protein were overexpressed in both Barrett’s epithelium and in the Barrett’s adenocarcinoma derived cell line OE33. PPARgamma activation by pioglitazone induced apoptosis in OE33 cells resulting in reduced tumor growth in vitro. Unexpectedly, enhanced growth of OE33 derived transplantable adenocarcinomas was observed in Balb/c nu/nu mice in vivo upon systemic thiazolidinedione treatment due to increased cell proliferation. Conclusions: PPARgamma seems to be involved in the molecular pathogenesis of Barrett’s epithelium and Barrett’s adenocarcinoma. PPARgamma activation exerts differential effects on growth of Barrett’s adenocarcinoma cells in vitro and after transplantation in vivo emphasizing the importance of cell context specific factors and signal transduction pathways modulating PPARgamma action.