PIDD has previously been described as a death domain (DD)-containing protein that is inducible upon p53 activation and plays a role in programmed cell death. It has previously been shown that PIDD interacts with RAIDD (RIP-associated ICE/CED3 homologous protein with a death domain) in a cytoplasmic complex known as the PIDDosome, which results in the activation of capsase-2 and ultimately in cell death in response to DNA damage. Despite earlier studies on PIDD, however, the physiological role of PIDD has not been elucidated. Thus, we have generated PIDD-deficient mice and examined its in vivo functions particularly in cell death and in antiviral innate immunity. The first major aim of the thesis is to determine whether or not PIDD is required in cell death. PIDD mice are developmentally normal and do not display a pronounced phenotype. Surprisingly, PIDD deficiency perturbed neither DNA damage-induced nor stress-induced cell death in a variety of cell types, suggesting that PIDD may not play a critical role in cell death. In addition, caspase-2 processing occurred normally in the absence of PIDD in response to ionizing irradiation or etoposide treatment, indicating that PIDD is dispensable in the cleavage of caspase-2. The second major aim is to examine the role of PIDD and RAIDD in LCMV-induced innate immunity. To study the role of PIDD and RAIDD in antiviral immune responses, I have generated PIDD/RAIDD double-deficient mice and challenged them with lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV). Interestingly, I observed that ablation of both PIDD and RAIDD together resulted in defective viral clearance in the spleen, but not in other organs including the lung, liver, and kidney. In addition, the production of type I IFN was also decreased in the mice deficient in both PIDD and RAIDD. However, the cytotoxicity of the T lymphocytes was largely intact in the absence of both PIDD and RAIDD. Collectively, our results suggest that PIDD is dispensable in cell death, yet PIDD and RAIDD together have a synergistic effect in LCMV-induced antiviral innate immunity. The findings presented in this thesis provide a better understanding of the physiological role of PIDD and may ultimately contribute to the novel therapeutic strategies for the proper control of viral infection.

Thesis (Ph. D.)--Cornell University, August, 2007. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 196-214).

La neurodégénérescence fait partie intégrante de la maladie de Huntington (MH) dont les premiers symptômes moteurs et cognitifs apparaissent vers l’âge de 30 à 40 ans. Cette maladie incurable est causée par une mutation dans le gène codant pour la protéine huntingtin (htt). L’activation de la caspase-6 (casp6) est observée au stade présymptomatique chez l’humain et les modèles murins MH faisant de la casp6 un joueur majeur dans la neurodégénérescence précoce associé à la MH. De plus, le clivage de htt mutant par la casp6 produit un fragment N-terminal neurotoxique essentielle au développement de la MH. Des résultats préliminaires ont permis de révéler l’interaction et le clivage des protéines proapoptotiques Serine/Threonine Kinase 3 (STK3), Death-Domain Associated Protein (DAXX) par la casp6. Des effets proapoptotiques sont associés à leurs fragments et leur production par les caspases pourrait influencer la neurodégénérescence observée dans diverses maladies neurodégénératives et dans le vieillissement normal. Nos résultats dans les souris C57Bl/6 démontrent que l’expression de DAXX varie fortement avec l’âge selon l’organe analysé. Ses divers fragments ne suivent pas la même tendance d’un organe à l’autre suggérant des fonctions différentielles à travers l’organisme et une importante régulation de ses fonctions par des modifications post-traductionnelles. Chez les modèles murins de la MH, les souris YAC128, nous avons constaté une augmentation des fragments à 65 et 70 kDa dans le cortex et une diminution de DAXX entier et du fragment à 70 kDa dans le cervelet soulignant la possibilité de fonctions spécifiques selon les régions cérébrales. Nous avons aussi démontré pour la première fois le clivage de STK3 par la caspase-7 et la production différentielle de fragments par les caspase-3, 6 et 7. L’expression protéique de STK3 augmente globalement à travers l’organisme avec l’âge et dans le cervelet des souris YAC128. Par contre, une diminution de l’expression de STK3 est observée dans le cortex des individus atteints de la MH et des souris YAC128. Finalement, par l’induction de différents stress cellulaires, nous avons constaté la présence d’un mécanisme adaptatif des neurones modèles de la MH impliquant STK3. En conclusion, l’expression de DAXX et STK3 varie avec l’âge à travers l’organisme et est altérée dans la maladie de Huntington. Plus particulièrement, STK3semble être impliqué dans un mécanisme protégeant les neurones de la mort cellulaire dans la MH.

Les aptamères peptidiques sont des protéines combinatoires capables de moduler spécifiquement une fonction de leur cible. Une sélection fonctionelle d’aptamères peptidiques capables d’inhiber la mort cellulaire Bax-dependante chez la levure et en cellules mammaifères a été effectuée. Deux aptamères peptidiques ont été sélectionnés (Apta-32 et Apta-34). L’objectif de ce travail de thèse a été de caractériser ces deux aptamères peptidiques et leur(s) cible(s) dans le contexte de la mort cellulaire Bax-dependante. La première partie est l’étude de l’Apta-34 qui cible une protéine (C34) contenant un domaine de mort et ayant des fonctions pro-apoptotiques. Nous avons montré que lors de l’induction de l’apoptose, C34 est transloquée du noyau (sa localisation principale) au cytoplasme. Dans les mêmes conditions, Apta-34 co-localise avec C34 dans le noyau, empêchant, ou du moins retardant, sa sortie du noyau. De plus nous avons identifié le site de liaison d’Apta-34 sur C34, qui est localisé dans les 215 amino acides en N-terminale de la protéine, une région qui contient un site prédictif d’export nucléaire. Finalement, nous avons montré que la délétion de l’homologue de C34 protège contre la mort induite par hBax en levure. La seconde partie est l’étude d’Apta-32 qui cible deux paralogues (C32a et b) d’une famille de protéine impliquée dans le traffic membranaire dans les voies de l’endocytose. Nous avons montré qu’Apta-32 se lie à un domaine fonctionnel de C32. Des études in silico de docking ont permis d’identifier trois sites distincts de liaison d’Apta-32 sur ce domaine. Le site dominant est composé d’acides aminés qui partagent des propriétés physico-chimiques communes entre les différents interacteurs d’Apta-32 (C32a, C32b et l’homologue levure) mais pas avec des homologues qui ne lient pas Apta-32. De plus un screening double hybride d’une banque de cDNA levure a permis d’identifier des cibles mevure d’Apta-32. Finalement, des études préliminaires chez l’embryons de drosophile, permettent de suggérer que l’expression d’Apta-32 peut entraîner un défaut de la phagocytose. Cette étude a permis d’identifier des régulateurs de la mort cellulaires impliqués dans deux processus cellulaires distincts. / Peptide aptamers are small combinatorial proteins able to specifically modulate a function of their target. A functional selection of peptide aptamers able to inhibit Bax-dependent cell death in yeast and mammalian systems has been performed. Two peptide aptamers have been selected (Apta-32 and Apta-34). The aim of this thesis project was to characterize those two inhibitory peptide aptamers and their targets in order to understand their function in the Bax-dependent cell death. The first part focuses on Apta-34 that targets a Death Domain-containing protein (T34) that has pro-apoptotic functions. We showed that during the induction of apoptosis T34 translocates from nucleus (its major localization site) to the cytoplasm. In the same conditions, Apta-34 co-localizes with T34 in the nucleus, inhibiting or at least delaying its exit from the nucleus. Moreover we identified that Apta-34 binds to the well conserved 215 N-terminal amino acids of T34 that contains a putative Nuclear Export Signal. Finally we showed that the deletion of its homologue prevents hBax-induced cell death in yeast. The second part focuses on Apta-32 that targets two paralogues (T32a and b) of a family of proteins involved in the endocytotic membrane trafficking. We showed that Apta-32 is binding to a functional domain of T32. By in silico docking studies we identified 3 distinct binding sites of Apta-32 on this domain. The dominant binding site is composed by amino acid that share physico-chemical properties between binders of Apta-32 (T32a, T32b and a yeast homologue) but not with homologues that do not bind Apta-32. Moreover we identified yeast targets of Apta-32 by yeast two hybrid yeast cDNA library screening. Finally preliminary observations on drosophila embryos expressing Apta-32 suggest that Apta-32 expression could lead to a defect on phagocytosis. This study leads to the identification of regulators of the cell death acting on two distinct pathways.