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Protein-Glycopolymer Biohybrid Structures Based on Molecular Recognition Processes for Biomedical Applications / Protein-Glykopolymer Biohybridstrukturen auf der Basis molekularer Erkennungsprozesse für biomedizinische AnwendungenEnnen, Franka 13 January 2015 (has links) (PDF)
The design of versatile biohybrid nanosized materials has revealed itself as a promising avenue towards biomedical applications in today´s life sciences. In this regard the combination of components of synthetic and natural origin facilitates an applicability which is supposed to be far beyond the sum of their single components. These biohybrid structures (BHS) can be built by a huge variety of building blocks including solid or soft nanoparticles, peptides/proteins, polynucleotides or low molecular weight drugs. Along with the latter the attachment of biologically active entities or imaging moieties, e. g. enzymes, fluorescence markers or targeting motifs display thereby a key step towards the development of carrier systems for drug delivery purposes.
Among the soft nanoparticles especially dendritic polymers such as perfectly branched dendrimers or hyperbranched polymers are considered as ideal building blocks, since they allow an easy tailoring of crucial properties such as solubility, biocompatibility or bioactivity by means of surface functionalization. Especially in the field of targeted drug delivery the crucial role of sizes and size distributions of carriers has been highlighted recently, since it critically influences important factors such as circulation time or biodistribution within the body.
The ability of avidin to form high molecular weight associates with biotinylated macromolecules as well as its inherent properties makes it a suitable candidate for passive and active targeting in combination with biotinylated (bio-)polymers. Furthermore, along with the covalent attachment of bioactive moieties, non-covalent attachment is a frequently used approach, because it is assumed to only require stoichiometric mixing. In context of the latter molecular recognition processes such as the avidin-biotin, β-cyclodextrin-adamantane or Ni(II)-NTA-histidine-tag interactions have shown to be fruitful strategies for the attachment of bioactive entities.
The overall aim of this work was to fabricate BHS based on dendritic glycopolymers with varied sizes in the nano- and micrometer range as models for biomedical applications e. g. carriers for drug delivery. Therefore the molecular recognition of avidin with biotin derivatives and β-cyclodextrin with adamantane derivatives was utilized in order to tailor final sizes, functionality or catalytic activity of those BHS.
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Dendritische Glykopolymere und deren Polyelektrolytkomplexe als effiziente Drug-Delivery-Systeme für die verzögerte Wirkstofffreisetzung aus CalciumphosphatzementStriegler, Christin 05 December 2016 (has links) (PDF)
Das multiple Myelom ist eine seltene maligne Knochenerkrankung bei insbesondere älteren Menschen. Dabei vermehren sich im Knochenmark in hohem Maße unkontrolliert entartete Plasmazellen. Diese Myelomzellen unterdrücken einerseits die Bildung von normalen Plasmazellen, andererseits wird das Gleichgewicht zwischen Knochenaufbau und –abbau empfindlich gestört, woraus eine erhöhte Knochenresorption resultiert. Neben den bisher angewandten Chemo- und Strahlentherapien gewinnen innovative Medikamente, wie Proteasominhibitoren und Bisphosphonate, in der Therapie an Bedeutung. Diese Medikamente reduzieren das Myelomzellwachstum und wirken hemmend auf den Knochenabbau.
Durch das Auffüllen von durch Resorptionsprozesse geschädigten Knochendefekten mit wirkstoffbeladenen Calciumphosphatzementen (CPC) wird nicht nur der Knochen stabilisiert, sondern im Vergleich zur herkömmlichen oralen oder intravenösen Medikamentenverabreichung eine gezielte Freisetzung des Wirkstoffes direkt am Wirkort in wesentlich reduzierten Dosen ermöglicht. Durch die Kombination des Knochenzementes mit anderen effizienten Drug-Delivery-Systemen (DDS), wie z. B. Polymeren, kann eine optimale Anpassung der Wirkstofffreisetzung ermöglicht werden. Insbesondere haben sich bereits dendritische Polymere aufgrund ihrer globularen Struktur und Vielzahl an peripheren Funktionalitäten als besonders geeignete Wirkstoffträgersysteme herausgestellt. Bei der Anwendung im physiologischen System spielt insbesondere die Biokompatibilität dieser polymeren DDS eine entscheidende Rolle. Durch Modifizierung der peripheren Gruppen mit biokompatiblen Einheiten, wie Oligosacchariden oder Aminosäuren, kann die physiologische Verträglichkeit signifikant erhöht werden.
Für die Behandlung des multiplen Myeloms am Knochen sollte in dieser Arbeit ein geeignetes dendritisches DDS auf Basis von hochverzweigtem Polyethylenimin (PEI) synthetisiert und charakterisiert werden. Das DDS sollte dabei verschiedene Anforderungen, wie eine hohe Wasserlöslichkeit und Biokompatibilität, erfüllen. Weiterhin sollten die mechanischen Eigenschaften des CPC nicht negativ beeinflusst werden und der Wirkstoff sollte effektiv vom DDS aufgenommen und kontrolliert aus dem generierten Komposit (Wirkstoff/DDS/CPC) freigesetzt werden.
In der sogenannten N-Carboxyanhydrid (NCA)-Polymerisation wurden am PEI(5) (5 ≙ Mw 5 kDa) benzylgeschützte Polyglutaminsäure bzw. Polyasparaginsäureketten aufgepfropft. Durch hydrolytische Abspaltung der Schutzgruppen an den PBLG-Ketten von PEI(5)-PBLG-346 und PEI(5)-PBLA-346 erfolgte die Generierung der wasserlöslichen DDS PEI(5)-PGlu-346 und PEI(5)-PAsp-346. Die Charakterisierung der synthetisierten Kern-Schale-Architekturen PEI(5)-PBLG-346, PEI(5)-PBLA-346, PEI(5)-PGlu-346 und PEI(5)-PAsp-346 zeigte, dass nur wenige lange Polyaminosäureketten an wenigen primären und sekundären Aminogruppen des PEI(5) aufgebaut wurden. Aufgrund der noch freien primären und sekundären Aminogruppen am PEI(5) und den peripheren Aminogruppen an den Polyaminosäureketten wurden durch die Anbindung von Maltose- bzw. Laktoseeinheiten Kern-Schale-Architekturen mit einer binären Doppelschalenstrukturen erzeugt. Im Gegensatz zu reiner Polyglutaminsäure zeigten die mit Glutaminsäure modifizierten Polymerstrukturen PEI(5)-PGlu-346 und PEI(5)-PGlu-346-Mal interessante strukturelle Eigenschaften in wässriger Umgebung. Aufgrund des pH-abhängigen Ladungszustandes resultiert bei reinen Polyglutaminsäureketten normalerweise der typische Helix-Coil-Übergang. Dabei findet eine Konformationsumwandlung der α-helikalen Struktur zur ungeordneten Sekundärstruktur statt. Im Falle der PEI(5)-PGlu-346- und PEI(5) PGlu-346-Mal-Copolymere wurde jedoch keine α-helikale Konformation bei niedrigem pH-Wert nachgewiesen. Die PGlu-Ketten der wasserlöslichen Kern-Schale-Architekturen bildeten sowohl im sauren, als auch im basischen pH-Wertbereich eine ungeordnete Sekundärstruktur aus. Zusätzlich konnte nachgewiesen werden, dass die Kern-Schale-Architekturen in Abhängigkeit vom pH-Wert als isolierte Makromoleküle bzw. Aggregate mit unterschiedlich lang gestreckten Peptidketten vorliegen. Die Ursache dafür sind nicht-kovalente, intra- und intermolekular wirkende Kräfte.
Zur Beurteilung der Kern-Schale-Architekturen als geeignete DDS wurde die Komplexierung des Proteasominhibitors Bortezomib (BZM) in die reinen Copolymere PEI(5)-PGlu-346, PEI(5)-PGlu-346-Mal und PEI(25)-Mal B (25 ≙ Mw 25 kDa, ohne Polyglutaminsäureketten) sowie deren Polyelektrolytkomplexe untersucht. Dabei wurden Copolymer/BZM- bzw. PEK/BZM-Komplexe in verschiedenen Verhältnissen hergestellt und die Komplexierungskapazität durch zeitabhängige Ultrafiltration UV/Vis-spektroskopisch ermittelt. Im Vergleich zu den glutaminsäuremodifizierten Copolymeren wurde durch PEI(25)-Mal B etwa doppelt so viel Wirkstoff in verschiedenen wässrigen Systemen aufgenommen. Der Grund dafür ist der größere PEI-Kern und die dementsprechend höhere Anzahl an peripheren Aminogruppen mit gebundenen Maltoseeinheiten. Die PEK zeigten im Vergleich zu den Copolymeren keine Verbesserung der Komplexierungskapazität.
Um eine effektive Wirkstofffreisetzung für eine dosierte Langzeittherapie aus dem Kompositmaterial zu erhalten, ist eine stark verzögerte Freisetzung des Copolymers bzw. PEK selbst aus dem CPC notwendig. In Abhängigkeit von der Konzentration wurde für PEI(25)-Mal B eine geringere Freisetzung aus dem Copolymer/CPC- und PEK/CPC ermittelt. Aufgrund der nanoskaligen Dimension der polymeren Strukturen wird die Diffusion durch das offene CPC-Porensystem erschwert. Für die PEI(5)-PGlu-346, PEI(5)-PGlu-346-Mal und die zugehörigen PEK wurde hingegen keine messbare Freisetzung aus dem CPC nachgewiesen. Die Glutaminsäureeinheiten können Calciumionen komplexieren und beeinflussen dadurch die Keimbildung und das Wachstum der CaP-Phase. Die Copolymerstrukturen werden somit in den CPC integriert und können nur durch Abbau des schwerlöslichen Zementes freigesetzt werden.
Bei den Untersuchungen der BZM-Freisetzung aus den BZM/Copolymer/CPC- und BZM/PEK/CPC-Kompositen kristallisierte sich BZM/PEI(5)-PGlu-346-Mal/CPC als effektivstes DDS heraus. Im Vergleich zum reinen BZM in CPC wurde nach 24 h nur etwa die Hälfte des Wirkstoffes aus dem Komposit freigesetzt. Weiterhin steigerte sich die Freisetzungsrate über den gesamten Zeitraum von 14 Tagen auf nur etwa 60 %. Aus dem BZM/CPC-Komposit wurden nach 14 Tagen mehr als 75 % BZM freigesetzt.
In Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Michael Gelinsky vom Zentrum für Translationale Knochen-, Gelenk- und Weichgewebeforschung (TU Dresden) wurde keine signifikante Änderung der Druckfestigkeit des CPC durch die Integration der glutaminsäuremodifizierten Copolymere festgestellt. Weiterhin wurde in in vitro-Untersuchungen mit osteogen stimulierten humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC) kein entscheidender Einfluss der in dieser Arbeit hergestellten PEI(5)-PGlu-346- und PEI(5)-PGlu-346-Mal-Copolymere auf die Proliferation der Zellen beobachtet. Zudem war bei beiden Copolymeren eine osteogene Differenzierung der hMSC zu knochenbildenden Osteoblasten nachweisbar, wobei PEI(5)-PGlu-346-Mal die Entwicklung der Stammzellen zu knochenbildenden Zellen sogar zu fördern scheint.
Durch die Kombination von hochverzweigtem PEI mit Polyglutaminsäure und Maltose wurde in dieser Arbeit ein innovatives DDS für die kontrollierte und effektiv verzögerte Freisetzung von BZM aus CPC erzeugt, welches die einleitend erwähnten Anforderungen erfüllt. Das Copolymersystem weist eine hohe Biokompatibilität auf, ohne die mechanischen Eigenschaften des CPC zu verändern. Diese Arbeit hat daher einen entscheidenden Beitrag im Bereich der Wirkstofffreisetzung aus festen Materialien geliefert und bildet die Grundlage für zukünftige polymere DDS in CPC.
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Protein-Glycopolymer Biohybrid Structures Based on Molecular Recognition Processes for Biomedical ApplicationsEnnen, Franka 11 December 2014 (has links)
The design of versatile biohybrid nanosized materials has revealed itself as a promising avenue towards biomedical applications in today´s life sciences. In this regard the combination of components of synthetic and natural origin facilitates an applicability which is supposed to be far beyond the sum of their single components. These biohybrid structures (BHS) can be built by a huge variety of building blocks including solid or soft nanoparticles, peptides/proteins, polynucleotides or low molecular weight drugs. Along with the latter the attachment of biologically active entities or imaging moieties, e. g. enzymes, fluorescence markers or targeting motifs display thereby a key step towards the development of carrier systems for drug delivery purposes.
Among the soft nanoparticles especially dendritic polymers such as perfectly branched dendrimers or hyperbranched polymers are considered as ideal building blocks, since they allow an easy tailoring of crucial properties such as solubility, biocompatibility or bioactivity by means of surface functionalization. Especially in the field of targeted drug delivery the crucial role of sizes and size distributions of carriers has been highlighted recently, since it critically influences important factors such as circulation time or biodistribution within the body.
The ability of avidin to form high molecular weight associates with biotinylated macromolecules as well as its inherent properties makes it a suitable candidate for passive and active targeting in combination with biotinylated (bio-)polymers. Furthermore, along with the covalent attachment of bioactive moieties, non-covalent attachment is a frequently used approach, because it is assumed to only require stoichiometric mixing. In context of the latter molecular recognition processes such as the avidin-biotin, β-cyclodextrin-adamantane or Ni(II)-NTA-histidine-tag interactions have shown to be fruitful strategies for the attachment of bioactive entities.
The overall aim of this work was to fabricate BHS based on dendritic glycopolymers with varied sizes in the nano- and micrometer range as models for biomedical applications e. g. carriers for drug delivery. Therefore the molecular recognition of avidin with biotin derivatives and β-cyclodextrin with adamantane derivatives was utilized in order to tailor final sizes, functionality or catalytic activity of those BHS.
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Dendritische Glykopolymere und deren Polyelektrolytkomplexe als effiziente Drug-Delivery-Systeme für die verzögerte Wirkstofffreisetzung aus CalciumphosphatzementStriegler, Christin 17 November 2016 (has links)
Das multiple Myelom ist eine seltene maligne Knochenerkrankung bei insbesondere älteren Menschen. Dabei vermehren sich im Knochenmark in hohem Maße unkontrolliert entartete Plasmazellen. Diese Myelomzellen unterdrücken einerseits die Bildung von normalen Plasmazellen, andererseits wird das Gleichgewicht zwischen Knochenaufbau und –abbau empfindlich gestört, woraus eine erhöhte Knochenresorption resultiert. Neben den bisher angewandten Chemo- und Strahlentherapien gewinnen innovative Medikamente, wie Proteasominhibitoren und Bisphosphonate, in der Therapie an Bedeutung. Diese Medikamente reduzieren das Myelomzellwachstum und wirken hemmend auf den Knochenabbau.
Durch das Auffüllen von durch Resorptionsprozesse geschädigten Knochendefekten mit wirkstoffbeladenen Calciumphosphatzementen (CPC) wird nicht nur der Knochen stabilisiert, sondern im Vergleich zur herkömmlichen oralen oder intravenösen Medikamentenverabreichung eine gezielte Freisetzung des Wirkstoffes direkt am Wirkort in wesentlich reduzierten Dosen ermöglicht. Durch die Kombination des Knochenzementes mit anderen effizienten Drug-Delivery-Systemen (DDS), wie z. B. Polymeren, kann eine optimale Anpassung der Wirkstofffreisetzung ermöglicht werden. Insbesondere haben sich bereits dendritische Polymere aufgrund ihrer globularen Struktur und Vielzahl an peripheren Funktionalitäten als besonders geeignete Wirkstoffträgersysteme herausgestellt. Bei der Anwendung im physiologischen System spielt insbesondere die Biokompatibilität dieser polymeren DDS eine entscheidende Rolle. Durch Modifizierung der peripheren Gruppen mit biokompatiblen Einheiten, wie Oligosacchariden oder Aminosäuren, kann die physiologische Verträglichkeit signifikant erhöht werden.
Für die Behandlung des multiplen Myeloms am Knochen sollte in dieser Arbeit ein geeignetes dendritisches DDS auf Basis von hochverzweigtem Polyethylenimin (PEI) synthetisiert und charakterisiert werden. Das DDS sollte dabei verschiedene Anforderungen, wie eine hohe Wasserlöslichkeit und Biokompatibilität, erfüllen. Weiterhin sollten die mechanischen Eigenschaften des CPC nicht negativ beeinflusst werden und der Wirkstoff sollte effektiv vom DDS aufgenommen und kontrolliert aus dem generierten Komposit (Wirkstoff/DDS/CPC) freigesetzt werden.
In der sogenannten N-Carboxyanhydrid (NCA)-Polymerisation wurden am PEI(5) (5 ≙ Mw 5 kDa) benzylgeschützte Polyglutaminsäure bzw. Polyasparaginsäureketten aufgepfropft. Durch hydrolytische Abspaltung der Schutzgruppen an den PBLG-Ketten von PEI(5)-PBLG-346 und PEI(5)-PBLA-346 erfolgte die Generierung der wasserlöslichen DDS PEI(5)-PGlu-346 und PEI(5)-PAsp-346. Die Charakterisierung der synthetisierten Kern-Schale-Architekturen PEI(5)-PBLG-346, PEI(5)-PBLA-346, PEI(5)-PGlu-346 und PEI(5)-PAsp-346 zeigte, dass nur wenige lange Polyaminosäureketten an wenigen primären und sekundären Aminogruppen des PEI(5) aufgebaut wurden. Aufgrund der noch freien primären und sekundären Aminogruppen am PEI(5) und den peripheren Aminogruppen an den Polyaminosäureketten wurden durch die Anbindung von Maltose- bzw. Laktoseeinheiten Kern-Schale-Architekturen mit einer binären Doppelschalenstrukturen erzeugt. Im Gegensatz zu reiner Polyglutaminsäure zeigten die mit Glutaminsäure modifizierten Polymerstrukturen PEI(5)-PGlu-346 und PEI(5)-PGlu-346-Mal interessante strukturelle Eigenschaften in wässriger Umgebung. Aufgrund des pH-abhängigen Ladungszustandes resultiert bei reinen Polyglutaminsäureketten normalerweise der typische Helix-Coil-Übergang. Dabei findet eine Konformationsumwandlung der α-helikalen Struktur zur ungeordneten Sekundärstruktur statt. Im Falle der PEI(5)-PGlu-346- und PEI(5) PGlu-346-Mal-Copolymere wurde jedoch keine α-helikale Konformation bei niedrigem pH-Wert nachgewiesen. Die PGlu-Ketten der wasserlöslichen Kern-Schale-Architekturen bildeten sowohl im sauren, als auch im basischen pH-Wertbereich eine ungeordnete Sekundärstruktur aus. Zusätzlich konnte nachgewiesen werden, dass die Kern-Schale-Architekturen in Abhängigkeit vom pH-Wert als isolierte Makromoleküle bzw. Aggregate mit unterschiedlich lang gestreckten Peptidketten vorliegen. Die Ursache dafür sind nicht-kovalente, intra- und intermolekular wirkende Kräfte.
Zur Beurteilung der Kern-Schale-Architekturen als geeignete DDS wurde die Komplexierung des Proteasominhibitors Bortezomib (BZM) in die reinen Copolymere PEI(5)-PGlu-346, PEI(5)-PGlu-346-Mal und PEI(25)-Mal B (25 ≙ Mw 25 kDa, ohne Polyglutaminsäureketten) sowie deren Polyelektrolytkomplexe untersucht. Dabei wurden Copolymer/BZM- bzw. PEK/BZM-Komplexe in verschiedenen Verhältnissen hergestellt und die Komplexierungskapazität durch zeitabhängige Ultrafiltration UV/Vis-spektroskopisch ermittelt. Im Vergleich zu den glutaminsäuremodifizierten Copolymeren wurde durch PEI(25)-Mal B etwa doppelt so viel Wirkstoff in verschiedenen wässrigen Systemen aufgenommen. Der Grund dafür ist der größere PEI-Kern und die dementsprechend höhere Anzahl an peripheren Aminogruppen mit gebundenen Maltoseeinheiten. Die PEK zeigten im Vergleich zu den Copolymeren keine Verbesserung der Komplexierungskapazität.
Um eine effektive Wirkstofffreisetzung für eine dosierte Langzeittherapie aus dem Kompositmaterial zu erhalten, ist eine stark verzögerte Freisetzung des Copolymers bzw. PEK selbst aus dem CPC notwendig. In Abhängigkeit von der Konzentration wurde für PEI(25)-Mal B eine geringere Freisetzung aus dem Copolymer/CPC- und PEK/CPC ermittelt. Aufgrund der nanoskaligen Dimension der polymeren Strukturen wird die Diffusion durch das offene CPC-Porensystem erschwert. Für die PEI(5)-PGlu-346, PEI(5)-PGlu-346-Mal und die zugehörigen PEK wurde hingegen keine messbare Freisetzung aus dem CPC nachgewiesen. Die Glutaminsäureeinheiten können Calciumionen komplexieren und beeinflussen dadurch die Keimbildung und das Wachstum der CaP-Phase. Die Copolymerstrukturen werden somit in den CPC integriert und können nur durch Abbau des schwerlöslichen Zementes freigesetzt werden.
Bei den Untersuchungen der BZM-Freisetzung aus den BZM/Copolymer/CPC- und BZM/PEK/CPC-Kompositen kristallisierte sich BZM/PEI(5)-PGlu-346-Mal/CPC als effektivstes DDS heraus. Im Vergleich zum reinen BZM in CPC wurde nach 24 h nur etwa die Hälfte des Wirkstoffes aus dem Komposit freigesetzt. Weiterhin steigerte sich die Freisetzungsrate über den gesamten Zeitraum von 14 Tagen auf nur etwa 60 %. Aus dem BZM/CPC-Komposit wurden nach 14 Tagen mehr als 75 % BZM freigesetzt.
In Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Michael Gelinsky vom Zentrum für Translationale Knochen-, Gelenk- und Weichgewebeforschung (TU Dresden) wurde keine signifikante Änderung der Druckfestigkeit des CPC durch die Integration der glutaminsäuremodifizierten Copolymere festgestellt. Weiterhin wurde in in vitro-Untersuchungen mit osteogen stimulierten humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC) kein entscheidender Einfluss der in dieser Arbeit hergestellten PEI(5)-PGlu-346- und PEI(5)-PGlu-346-Mal-Copolymere auf die Proliferation der Zellen beobachtet. Zudem war bei beiden Copolymeren eine osteogene Differenzierung der hMSC zu knochenbildenden Osteoblasten nachweisbar, wobei PEI(5)-PGlu-346-Mal die Entwicklung der Stammzellen zu knochenbildenden Zellen sogar zu fördern scheint.
Durch die Kombination von hochverzweigtem PEI mit Polyglutaminsäure und Maltose wurde in dieser Arbeit ein innovatives DDS für die kontrollierte und effektiv verzögerte Freisetzung von BZM aus CPC erzeugt, welches die einleitend erwähnten Anforderungen erfüllt. Das Copolymersystem weist eine hohe Biokompatibilität auf, ohne die mechanischen Eigenschaften des CPC zu verändern. Diese Arbeit hat daher einen entscheidenden Beitrag im Bereich der Wirkstofffreisetzung aus festen Materialien geliefert und bildet die Grundlage für zukünftige polymere DDS in CPC.
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