En la natura, la comunicació entre espècies o individus d'una mateixa espècie es produeix per l'emissió i captació per part dels diferents individus de compostos específics. Aquests compostos químics poden provocar diferents comportaments. Els compostos químics implicats en la comunicació sexual entre individus de la mateixa espècie s'anomenen feromones. La diversitat molecular dels components de les feromones sorgeix de variacions en un petit nombre d'etapes enzimàtiques conservades. La dessaturació dels èsters de coenzim A dels àcids grassos saturats és una reacció típica en les vies biosintètiques dels lepidòpters.Es pot definir la dessaturació com una reacció oxidativa que utilitza oxigen de forma molecular. Aquesta reacció està catalitzada per les dessaturases, que son enzims que contenen ferro no hemo. El complex funcional de la dessaturasa està format per tres proteïnes: la dessaturasa, el citocrom b5 i la citocrom b5 reductasa. En aquest complex la dessaturasa es considera que constitueix el pas més lent de la seqüència de reacció.La dessaturasa juga un paper essencial en la síntesi dels àcids grassos monoinsaturats que formen part de les membranes cel·lulars. Les glàndules feromonals dels lepidòpters contenen una família inusual de dessaturases que introdueixen dobles enllaços amb diferents estereoquímiques en diverses posicions. L'estudi de les dessaturases dut a terme en el grup de treball havia permès la identificació de les dessaturases implicades en la biosíntesi de la majoria de components de la feromona sexual de l'espècie Spodoptera littoralis. També s'havia estudiat la ruta de biosíntesi de les feromones de les processionàries del pi i del roure. El treball realitzat ha consistit en l'estudi de l'expressió de les dessaturases de les espècies plaga Trichoplusia ni i Spodoptera littoralis en un sistema heteròleg en llevat utilitzant vectors: constitutiu YEpOLEX i induïble pYEXTHS-BN. Es van introduir en aquests plasmidis els cDNAs que codifiquen per les dessaturases de les espècies T. ni i S. littoralis així com la proteïna quimèrica formada per la dessaturasa de T. ni fusionada a un domini homòleg a citocrom b5 de la dessaturasa de llevat i la pròpia dessaturasa de llevat en el vector constitutiu YEpOLEX. Les construccions corresponents es van expressar en una soca de llevat deficient en desaturases i elongases pròpies. De les soques resultants es va estudiar el perfil d'àcids grassos que es troben en les seves membranes quan aquests llevats creixen en diferents condicions de cultiu. El canvi del doble enllaç de la posició 9 (la natural pel llevat) a la posició 11 (que generen les dessaturases d'insecte) produeix diferències de comportament entre els llevats de manera que no tenen la mateixa capacitat d'adaptació als canvis ambientals que pateixen. L'estudi dels extractes lipídics per CG-EM dels llevats que expressen la delta-11 dessaturasa de S. littoralis ha permès detectar els compostos diènics E10,E12-tetradecadienoat de metil i E10,Z12-hexadecadienoat de metil, el primer compost és un component principal de la feromona de l'insecte del que no es coneixia l'enzim responsable de la seva biosíntesi. L'aparició d'aquest compost en els extractes permet dir que la dessaturasa de S. littoralis és un enzim bifuncional. També s'ha abordat la identificació i el clonatge de les dessaturases implicades en la biosíntesi de la feromona sexual de la processionària del pi. S'ha aconseguit identificar un fragment de DNA que codificaria per una proteïna que podria ésser una acil-CoA dessaturasa. Assaigs d'activitat posteriors han permès identificar aquesta proteïna com una delta-11 acil-CoA dessaturasa. Aquest enzim a més és capaç d'introduir un triple enllaç en la posició 11 de la cadena de l'àcid gras i de donar lloc a un compost diènic amb dobles enllaços en les posicions 11 i 13. / In nature, communication between species or individuals of the same species is produced by the emission and perception of different specific chemicals. The chemicals implied in the sex communication between individuals of the same species are called pheromones.The molecular diversity of pheromone compounds appears to arise from little changes in a few conserved enzymatic steps. Desaturation of saturated fatty acyl coenzyme A esters is a typical reaction in the lepidopteran biosynthetic pathways.Desaturase functional complex is formed for three proteins: the desaturase, a cythochrome b5 reductase and a cytochrome b5. We have studied the expression of fatty acid desaturases in the pests "Trichoplusia ni" and "Spodoptera littoralis" in an heterologous expression system in yeast using two plasmids: constitutive YEpOLEX and inducible pYEXTHS-BN. In these plasmids we have introduced the cDNAs for the fatty acid desaturases from S. littoralis, T. ni and this last one fused to a domain homologous to the cytochrome b5 from yeast desaturase. We also have worked with the yeast desaturase in the constitutive plasmid YEpOLEX.The constructs were introduced in a yeast strain desaturase and elongase deficient ("delta-eloI_delta-oleI"). From the resultant yeast strains we have studied the fatty acid profile which is found in their membranes when this yeast strains have been cultured in different conditions. Changing the position of the double bound from the 9th carbon to the 11th produces variations in yeast growth. The analysis of fatty acid profile from yeasts with "S. littoralis" delta-11 desaturase allowed to detect methyl E10, E12-tetradecadienoate and methyl E10, E12-hexadecadienoate. The first one is a compound of the insect pheromonal blend for which the enzyme responsible for its biosynthesis was not known. In this work we also have tackled identification and cloning of desaturases involved in the sex pheromone biosynthesis from pine processionary moth. We have isolated one DNA fragment which codifies for a acyl-CoA desaturase like protein. Subsequent activity assays have demonstrated this protein has delta-11 desaturase activity. We also could see that "T. pityocampa" is a trifunctional enzyme since it has delta-11 desaturase, acetylenase and delta-13 desaturase activities.

En aquesta tesi s'han abordat estudis sobre dues famílies de lípids: les feromones sexuals d'insectes i els esfingolípids. El nexe d'unió d'un grup amb l'altre han estat les dessaturases. Les dessaturases d'àcids grassos són enzims fonamentals en la biosíntesi de les feromones sexuals dels lepidòpters, mentre que la dihidroceramida dessaturasa és un enzim clau en la biosíntesi dels esfingolípids.Prenent les dessaturases com a centre d'interès d'aquesta tesi, el treball que es presenta en aquesta memòria està dividit, formalment, en dues parts. En la primera (Capitols 2 i 3), s'estudien aspectes relacionats amb dessaturases de lepidopters. Així, en el Capítol 2 s'investiga la relació entre determinades dessaturases i la variació fenotípica en l'estructura de la feromona sexual de dues espècies del gènere Thaumetopoea i es demostra que la producció d'un complex feromonal concret es deu, més que a la existència de dessaturases altament específiques, a la presència de substrats determinats. Tenint en compte la baixa especificitat d'algunes acil-CoA dessaturases, i per tal d'aportar més dades sobre l'abast de les reaccións catalitzades per aquests enzims, en el Capítol 3 s'estudia l'activitat de la Δ11-dessaturasa de l'Spodoptera littoralis sobre substrats ciclopropànics, i es demostra la formació de metilenciclopropans.Amb la finalitat d'extendre aquestes investigacions a d'altres dessaturases d'interès biològic, ens proposarem estudiar els requeriments estructurals del substrat de la dihidroceramida dessaturasa. Per tal d'obtenir un elevat nombre d'anàlegs per aquests estudis d'especificitat, es pensà en l'aplicació de les tècniques de química combinatòria. En relació amb aquesta temàtica, en el Capítol 4 d'aquesta tesi es descriu una metodologia per a la síntesi de quimioteques d'anàlegs de ceramides, i la seva aplicació per a la preparació d'una col·lecció exploratòria per tal d'estudiar la especificitat pel substrat de la dihidroceramida dessaturasa. / In this thesis studies about two families of lipids: the insect sexual pheromones and esfingolipids were approached. Desaturases have been the link between these two groups. The fatty acids desaturases are essential enzymes in the biosynthesis of moth sexual pheromones, while the dihydroceramide desaturase is a key enzyme in the esfingolipids biosynthesis.Taking the dessaturases as a center of interest, the work that is presented in this memory is divided, formally, into two parts. In the first part (Chapters 2 and 3); we studied different aspects related with lepidopters desaturases. Thus, in chapter 2 the relationship among determinate desaturases and phenotype variation in the sexual pheromone structure of two species of the genera Thaumetopoea is investigated and it is demonstrated that the production of a pheromonal complex is determined by the presence of specific substrate.The low specificity of some acil-CoA desaturases and the possibility to bring more information about the extent of the reactions catalyzed by these enzymes, we studied in chapter 3 the activity of the ∆11-desaturase of Spodoptera littoralis with cyclopropyl fatty acids as substrate, and it is demonstrated the transformation into the corresponding 11 cyclopropylidene acids.With the purpose to extend this research in other biological interesting desaturases, we will propose to study the structural requirements for dihydroceramide desaturase substrate. With the goal of obtaining a high number of analogous to study the specificity, combinatory chemistry techniques are applied. In relation to this subject matter, in chapter 4 of this thesis it is described a methodology for the synthesis of ceramide analogous libraries, and their application for the preparation of an exploratory collection in order to study the substrate specificity of the dihydroceramide desaturase.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:42:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1395291 bytes, checksum: c18b5a982983cd4231258a4941494a76 (MD5) Previous issue date: 2008-07-14 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The fatty acid composition of soybean seeds has a direct impact on its oxidative stability. High levels of polyunsaturated fatty acids such as linoleic and linolenic acids make the oil more susceptible to hydrolytic and oxidative degradation leading to the formation of volatile compounds which alter the quality and flavor of foods. For this reason, there is a world demand for oils with high content of monounsaturated fatty acids and reduced levels of linolenic acid. The regulation of the fatty acid biosynthetic pathway in soybean seeds possibly involves transcriptional and post- transcriptional control of the w-6 and w-3 desaturases. However, the precise control mechanism is not known. The present work is part of the Breeding Program for Soybean Quality developed at BIOAGRO/UFV and its main goal is to determine the mRNA levels of the main desaturases during the development of soybean seeds, and to correlate them with the fatty acid levels and the enzymatic activities in different genotypes during seed filling. The following genotypes were used: A29, low linolenic acid content (~1%); FA22, high oleic content (~50%); N85-2176, low linolenic acid content (~3%) and medium oleic acid content (~30%); and Tucunaré, commercial cultivar with normal contents of oleic (~19%) and linolenic acids (~8%). The seeds were divided into five stages according to their fresh weight: 1st (0-125 mg); 2nd (126- 250 mg); 3rd (251-375 mg), 4th (376-450 mg) and 5th (dry seed). The following parameters were determined: fatty acid content; total oil content; relative enzymatic activities of w- 6 and w-3-desaturases; mRNA levels of FAD2-1 and FAD2-2 genes which encode the w-6-desaturases, and of genes GmFAD3A, GmFAD3B and GmFAD3C, which encode the w-3- desaturases. The results show that the oleic acid content increased between the 1st and 4th stages and reduced after that. The genotype FA22, followed by N85-2176, presented the highest oleic acid content during the development of the seed. As for the linolenic acid a drastic reduction was observed between the 1st and the 3rd stages in all genotypes. The genotype A29, followed by N85-2176 presented the lowest linolenic acid content during the development of the seed. The total oil content in mature seeds (5th stage) was 22% for Tucunaré, 24% for A29, 21% for N85-2176 and 19% for FA22. The values obtained for the desaturases relative activities were proportional to the average concentrations of the fatty acids in the genotypes. The relative enzymatic activities estimated as a function of the average contents of the fattey acids did not allow much conclusion and further determinations in vitro are necessary. The amount of transcripts for FAD2-1 was higher than that of FAD2-2. FAD2-1 levels were low in the first stages of development and increased with time, whereas FAD2-2 levels reduced with the development of the seed. These results are in accordance with the idea that FAD2-1 is related with the biosynthesis of storage fatty acids in the seeds and FAD2-2, with the biosynthesis of membrane fatty acid. Although genotypes FA22 and N85-2176 present high oleic acid contents, this fact cannot be explained by the reduction on transcript levels for the genes FAD2-2 and FAD2-1. This indicates that post-transcriptional events or even other genes control the expression of this trait. Transcript levels for the GmFAD3A gene were higher than those of the GmFAD3B and GmFAD3C genes in all genotypes tested. The transcripts for the GmFAD3A gene were barely detected in genotypes A29 and N85-2176, wheres GmFAD3B transcript levels were extremely low in A29. This fact explains the low level of linolenic acid in this genotype. It is conceivable that post- transcriptional control events regulate the expression of the GmFAD3C gene which encodes for the w-3-desaturase in A29 as this genotype harbors a mutation in this gene and no alteration has been detected in the corresponding transcript profile in relation to the normal cultivar Tucunaré. / A composição de ácidos graxos na fração óleo da soja influencia diretamente na sua estabilidade oxidativa. Conteúdos elevados de ácidos graxos polinsaturados, tais como o linoléico e linolênico, resultam em óleos mais susceptíveis a degradações hidrolíticas e oxidativas, levando à formação de compostos voláteis que alteram a qualidade e sabor dos alimentos. Assim, a tendência atual do mercado alimentício é buscar óleos com conteúdos mais elevados de ácidos graxos monoinsaturados e reduzido conteúdo de ácido linolênico. A regulação da via de biossíntese de ácidos graxos polinsaturados em sementes de soja possivelmente envolve controle transcricional e pós-transcricional das w-6 e w-3 dessaturases. No entanto, os mecanismos precisos de controle ainda não são muito claros. O presente trabalho está inserido no Programa de Melhoramento da Qualidade da Soja (PMQS) do BIOAGRO/UFV e tem como principal objetivo determinar os níveis de mRNAs das principais dessaturases de soja durante o desenvolvimento da semente, correlacionando- os com as concentrações relativas de ácidos graxos e atividade enzimática em diferentes cultivares durante o enchimento do grão. Para isso, foram utilizados os genótipos: A29, com baixa concentração de ácido linolênico (~1%); FA22, com elevada concentração de ácido oléico (~50%); N85-2176, com baixa concentração de ácido linolênico (~3%) e concentração média de ácido oléico (~30%); e Tucunaré, variedade comercial com concentrações normais de ácido oléico (~19%) e ácido linolênico (~8%). As sementes de soja foram subdivididas em cinco estádios de desenvolvimento de acordo com o seu peso úmido: 1° (0-125 mg); 2° (126-250 mg); 3° (251-375 mg), 4° (376-450 mg) e 5° (semente madura). Foram determinados: as concentrações de ácidos graxos; a concentração de óleo total; as atividades enzimáticas relativas das w-6 e w-3-dessaturases; e a expressão dos genes de FAD2-1 e FAD2-2, que codificam as w-6-dessaturases, e GmFAD3A, GmFAD3B e GmFAD3C, que codificam as w-3-dessaturases. De modo geral, a concentração de ácido oléico aumentou do 1° ao 4° estádio tendo uma redução entre o 4° e 5° estádios. O genótipo FA22, seguido de N85-2176, apresentou a maior concentração de ácido oléico durante todo o desenvolvimento da semente. Para o conteúdo de ácido linolênico, observou-se uma redução drástica do 1° ao 3° estádio em todos os genótipos. O genótipo A29, seguido de N85-2176, apresentou a menor concentração de ácido linolênico durante todo o desenvolvimento da semente. A concentração de óleo total nas sementes maduras fisiologicamente (5° estádio) foi de 22% para Tucunaré, 24% para A29, 21% para N85-2176 e 19% para FA22. A atividade enzimática relativa foi estimada com base nas concentrações médias dos ácidos graxos e não foi conclusiva, sendo necessárias determinações posteriores de atividade in vitro. Os níveis de transcritos do gene FAD2-1 foram superiores aos do gene FAD2-2, sendo que o acúmulo de transcritos de FAD2-1 foi menor nos estádios iniciais e aumentou com o desenvolvimento da semente, enquanto que para o gene FAD2-2 os níveis de transcritos reduziram com o desenvolvimento da semente. Esses resultados estão coerentes com a idéia de que FAD2-1 está relacionado com a biossíntese de ácido graxos de reserva em sementes e FAD2- 2, com a biossíntese de ácido graxos de membrana. Embora os genótipos FA22 e N85-2176 apresentem elevadas concentrações de ácido oléico, o mesmo não pode ser explicado pela redução na expressão dos genes FAD2-1 e FAD2-2, evidenciando a existência de mecanismos de regulação pós-transcricionais, ou até mesmo a presença de outros genes que controlem esta característica. Os níveis de transcritos do gene GmFAD3A foram superiores aos demais genes GmFAD3B e GmFAD3C no genótipo Tucunaré. Os acúmulos de transcritos do gene GmFAD3A foram praticamente nulos em A29 e N85-2176, enquanto GmFAD3B apresentou baixo acúmulo de transcritos em A29. Tal fato explica as baixas concentrações de ácido linolênico observados nesses genótipos. Mecanismos de regulação pós- transcricionais devem alterar a expressão final do gene GmFAD3C, que codifica a w-3-dessaturase neste genótipo, uma vez que A29 possui mutação nesse gene e nenhuma alteração no seu perfil de acúmulo de mRNA foi observado.