L’avènement de la microscopie STED (Stimulated Emission Depletion) a bouleversé le domaine desneurosciences du au fait que beaucoup de structures neuronale, tels que les épines dendritiques, lesaxones ou les processus astrocytaires, ne peuvent pas être correctement résolu en microscopiephotonique classique. La microscopie 2-photon est une technique d’imagerie photonique très largement utilisée dans le domaine des neurosciences car elle permet d’imager les événements dynamique en profondeur dans le tissu cérébral, offrant un excellent sectionnement optique et une meilleure profondeur de pénétration. Cependant, la résolution spatiale de cette approche est limitée autour de 0.5 μm, la rendant inappropriée pour étudier les détails morphologiques des neurones et synapses. Le but de mon travail de thèse était à A) développer un microscope qui permet d'améliorer l'imagerie 2-photon en la combinant avec la microscopie STED et B) démontrer son potentiel pour l'imagerie à l'échelle nanométrique de processus neuronaux dynamiques dans des tranches de cerveau aigus et in vivo. Le nouveau microscope permet d'obtenir une résolution spatiale latérale de ~ 50 nm à des profondeurs d'imagerie de ~ 50 μm dans du tissu cérébral vivant. Il fonctionne avec des fluorophores verts, y compris les protéines fluorescentes communes telles que la GFP et YFP, offrant le contraste de deux couleurs basé sur la détection spectrale et linéaire ‘unmixing’. S’agissant d’un microscope droit, utilisant un objectif à immersion ayant une grande distance de travail, nous avons pu incorporer des techniques électrophysiologiques comme patch-clamp et ajouter une plateforme pour l'imagerie in vivo. J’ai utilise ce nouveau microscope pour imager des processus neuronaux fins et leur dynamique à l’échelle nanométrique dans différent types de préparations et des régions différentes du cerveau. J’ai pu révéler des nouvelles caractéristiques morphologique des dendrites et épines. En outre, j'ai exploré différentes stratégies de marquage pour pouvoir utiliser la microscopie STED pour imager le trafic des protéines et de leur dynamique à l'échelle nanométrique dans des tranches de cerveau. / The advent of STED microscopy has created a lot of excitement in the field of neuroscience becausemany important neuronal structures, such as dendritic spines, axonal shafts or astroglial processes,cannot be properly resolved by regular light microscopy techniques. Two-photon fluorescence microscopy is a widely used imaging technique in neuroscience because it permits imaging dynamic events deep inside light-scattering brain tissue, providing high optical sectioning and depth penetration. However, the spatial resolution of this approach is limited to around half a micron, and hence is inadequate for revealing many morphological details of neurons and synapses. The aim of my PhD work was to A) develop a microscope that improves on two-photon imaging by combining it with STED microscopy and to B) demonstrate its potential for nanoscale imaging of dynamic neural processes in acute brain slices and in vivo. The new microscope achieves a lateral spatial resolution of ~50 nm at imaging depths of ~50 μm in living brain slices. It works with green fluorophores, including common fluorescent proteins like GFP and YFP, offering two-color contrast based on spectral detection and linear unmixing. Because of its upright design using a long working distance water-immersion objective, it was possible to incorporate electrophysiological techniques like patch-clamping or to add a stage for in vivo imaging. I have used the new microscope to image fine neural processes and their nanoscale dynamics in different experimental preparations and brain regions, revealing new and interesting morphological features of dendrites and spines. In addition, I have explored different labeling strategies to be able to use STED microscopy for visualizing protein trafficking and dynamics at the nanoscale in brain slices.

Les techniques modernes d'imagerie fonctionnelle du cerveau utilisent le métabolisme cérébral comme marqueur d'activité neuronale. En effet le cerveau dépend intimement des apports sanguins en métabolites pour son fonctionnement. Cependant les mécanismes de régulation du métabolisme sont encore mal connus. Dans cette étude nous avons utilisé le modèle du bulbe olfactif chez le rat anesthésié pour caractériser la consommation d'oxygène en réponse à une stimulation physiologique. La quantification précise de la vascularisation du bulbe olfactif a pu mettre en évidence que la couche glomérulaire, très dense en synapses, est l'une des zones les plus vascularisées du cerveau. Cette couche est aussi le lieu d'une intense consommation d'oxygène lors du traitement de l'information olfactive. Par contraste, la couche du nerf, complètement dénuée d'interactions synaptiques et très peu vascularisée, consomme peu d'oxygène. L'étude pharmacologique de ces réponses métaboliques nous a permis de montrer que le compartiment post-synaptique du glomérule est le siège de cette intense activité métabolique. Cette dernière est aussi dépendante du traitement de l'information olfactive qui est effectué à la fois dans le bulbe olfactif et à la périphérie, dans la cavité nasale. Ceci nous a permis de caractériser l'effet de l'adaptation périphérique sur la consommation d'oxygène et le traitement local de l'information olfactive. Enfin, nous avons décrit en détail l'importance des phénomènes de diffusion au niveau du réseau microvasculaire dans le rééquilibrage transitoire du taux d'oxygène local.

L’imagerie en profondeur in vivo à deux photons est sévèrement limitée par les aberrations optiques. L'optique adaptative est maintenant une technique largement utilisée pour résoudre ce problème. Elle repose sur une des nombreuses techniques possibles de mesure de front d'onde. L'estimation du front d'onde indirecte ou sensorless présente l'avantage d'être facile à mettre en œuvre sur les systèmes existants.L'approche modale sensorless, développée initialement pour l’imagerie à deux photons par Débarre et al., est devenue une technique standard fondée sur la maximisation d'une métrique de qualité d'image telle que l'intensité moyenne de l'image.Cependant, le front d'onde indirectement inféré est influencé par l'échantillon, qui peut induire un biais fort dans l'estimation. Cet effet est connu sous le nom de dépendance en l'échantillon.Ce travail de doctorat vise à développer une approche modale sensorless améliorée qui n'est pas affectée par la dépendance en l'échantillon. J'ai d'abord étudié l'impact des aberrations et de la structure de l'échantillon sur l'intensité moyenne de l'image.Je donne une nouvelle expression analytique de l'intensité moyenne de l'image est donnée qui rend explicite l'interaction entre la forme de la PSF 3D et la distribution spatiale de l'échantillon. À partir de simulations numériques, je montre que la sensibilité de la métrique aux aberrations est préservée pour des échantillons beaucoup plus grands que la résolution spatiale. Deuxièmement, j'étudie l'approche Standard Modal Sensorless (SMS) pour différents types d'échantillons.Je caractérise le problème de la dépendance en l'échantillon induit par des structures très fluorescentes situées hors de la profondeur de focalisation.Ensuite, je montre que la technique displacement-free n’élimine pas complètement la dépendance en l'échantillon.Cette analyse aboutit au développement de notre approche nommée Axially-Locked Modal Sensorless (ALMS). Cette nouvelle approche résout la dépendance en l'échantillon par un réglage automatique et contrôlé de la profondeur de focalisation afin de verrouiller la focalisation sur des motifs brillants de l'échantillon. En outre, l'approche ALMS se fonde également sur une métrique de qualité d'image spécialement conçue pour ce verrouillage. La performance de cette approche est numériquement comparée aux approches SMS et displacement-free. Enfin, ALMS est validée par des tests expérimentaux ex vivo et in vivo. / Deep in vivo two-photon microscopy is severely limited by optical aberrations. Adaptive optics is now a widely used technique to overcome this issue. It relies on one of several possible wavefront sensing techniques. Indirect or sensorless wavefront estimation has the advantage of being easy-to-implement on existing systems. Modal sensorless approach, initially developed for two photon imaging by Débarre et al., has become a standard technique based on the maximization of an image quality metric such as the mean image intensity.However, the indirectly inferred wavefront is influenced by the sample, which may induce a strong bias in the estimation, the so-called sample dependence. This PhD work aims at developing an improved modal sensorless approach that is not affected by sample dependence.I first study the impact of aberrations and of the sample structure on the mean image intensity.A new analytical expression of the mean image intensity is given and makes explicit the interplay between the shape of the 3D PSF and the sample spatial distribution. Through numerical simulations I show that the metric sensitivity to aberrations is preserved for samples much larger than the spatial resolution.Secondly, I study the Standard Modal Sensorless (SMS) approach for different sample scenarios. I characterize the sample dependence issue induced by strong fluorescent structures located out-of-focus. Then, I show that the displacement-free technique fails at fully removing the sample dependence. This analysis leads to the development of our Axially-Locked Modal Sensorless approach (ALMS). This new approach solves the sample dependence by an automatic and controlled adjustment of the focusing depth so as to lock on bright sample features. Furthermore, the ALMS approach is based on a specifically designed image quality metric.The performance of this approach is numerically compared with the SMS and the displacement-free approaches. Finally, ALMS is demonstrated through ex vivo and in vivo experimental tests.

Ce travail porte sur l’étude théorique de la double ionisation à deux photons de l’atome d’hélium avec comme objectif de comprendre le rôle des corrélations électroniques dans le mécanisme de double éjection. En analysant les distributions en énergie et les distributions angulaires des électrons émis, nous montrons que lors du processus direct, le système initialement dans son état fondamental évolue vers un état hautement corrélé. Les corrélations angulaires forcent les deux électrons à être éjectés dans des directions opposées, le long de l’axe de polarisation. Sous l’effet de "l’écrantage dynamique" c’est-à-dire des corrélations radiales, les deux électrons ont tendance à partager équitablement l’énergie disponible au dessus du seuil de double ionisation. Pour valider ou invalider ce mécanisme, nous proposons de mesurer la distribution des impulsions des ions doublement chargés He++. Tous ces résultats s’obtiennent en résolvant l’équation de Schrödinger dépendante du temps à l’aide d’une méthode spectrale combinée à celle de la matrice de Jacobi. En parallèle, et toujours dans le cas de l’ionisation double à deux photons de l’hélium, nous analysons les effets des corrélations électroniques à l’échelle attoseconde.

Ce travail porte sur l’étude théorique de la double ionisation à deux photons de l’atome d’hélium avec comme objectif de comprendre le rôle des corrélations électroniques dans le mécanisme de double éjection. En analysant les distributions en énergie et les distributions angulaires des électrons émis, nous montrons que lors du processus direct, le système initialement dans son état fondamental évolue vers un état hautement corrélé. Les corrélations angulaires forcent les deux électrons à être éjectés dans des directions opposées, le long de l’axe de polarisation. Sous l’effet de "l’écrantage dynamique" c’est-à-dire des corrélations radiales, les deux électrons ont tendance à partager équitablement l’énergie disponible au dessus du seuil de double ionisation. Pour valider ou invalider ce mécanisme, nous proposons de mesurer la distribution des impulsions des ions doublement chargés He++. Tous ces résultats s’obtiennent en résolvant l’équation de Schrödinger dépendante du temps à l’aide d’une méthode spectrale combinée à celle de la matrice de Jacobi. En parallèle, et toujours dans le cas de l’ionisation double à deux photons de l’hélium, nous analysons les effets des corrélations électroniques à l’échelle attoseconde.

La premiere partie du manuscript concerne l'etude des performances metrologiques d'un etalon secondaire de frequence utilisant les transitions a deux photons du rubidium. La mesure de la frequence absolue de cet etalon est decrite ainsi que ses applications a la spectroscopie de l'hydrogene atomique. La seconde partie concerne le calcul tres precis des niveaux d'energie et des fonctions d'onde de l'ion moeculaire H2+, ainsi que des resonances des especes exotiques ou l'electron est remplace par un muon ou un pion. A partir des fonctions d'onde, les probabilites de transition a deux photons entre niveaux vibrationnels de H2+ sont calculees. Un nouveau shema experimental pour deduire le rapport de la masse du proton a celle de l'electron par spectroscopie de H2+ est propose et discute. Enfin, une nouvelle methode de calcul du probleme coulombien a trois corps en deux dimensions est proposee et appliquee a l'helium.