Recentemente, uma nova molécula de sinalização bacteriana, o AMP dimérico cíclico (c-di-AMP) emergiu como um regulador central dos processos fisiológicos essenciais, tais como a homeostase celular, verificação da integridade do DNA e virulência bacteriana, entre outros. O c-di-AMP é produzido a partir da condensação de duas moléculas de adenosina trifosfato (ATP) por proteínas denominadas diadenilato ciclases, que contém o domínio DisA_N, também denominado DAC. Existem 2842 sequências de proteínas que contém o domínio DAC, provenientes de 2386 organismos encontradas no banco de dados Protein Families Database (Pfam). Essas proteínas são divididas em subfamílias sendo as três subfamílias mais abundantes: DacA (69,1%), proteínas de membrana associadas a sinalização intracelular de alterações decorrentes do meio externo; DisA (24,1%), primeira diadenilato ciclase a ser amplamente estudada, é uma proteína intracelular encontrada na forma de octâmeros ativos em solução, a qual, indiretamente, controla a divisão celular através da verificação da integridade do DNA e DacB (5,5%), proteínas citoplasmáticas expressa, particularmente, durante a formação de esporos bacterianos. Uma característica interessante é que a maioria dos organismos contém uma única e essencial proteína com domínio DAC. Os organismos que contém duas ou mais proteínas-DAC, tais como Clostridium e Bacillus spp., são uma exceção. Em Staphylococcus aureus (S. aureus), um patógeno humano oportunista e responsável por inúmeras doenças infecciosas, uma única diadenilato ciclase é encontrada pendurada na porção interna da membrana celular (Sau_DacA). A atividade desta proteína é potencialmente regulada através da interação direta com uma proteína YbbR-like, que contém um domínio sensor extracelular. Sau_DacA conserva todos os elementos-chave de uma diadenilato ciclase bacteriana, e por ser a única presente em S. aureus, revela-se um excelente alvo de estudo para o desenvolvimento de novos fins terapêuticos. No entanto, até o presente momento, existem poucas informações em relação a estrutura proteica, ao mecanismo de síntese de c-di-AMP e regulação do mecanismo de síntese de nucleotídeo destas proteínas, sendo, portanto, neste aspectos que o presente trabalho pretendeu contribuir. Através de uma série de ensaios, estruturais, calorimétricos, espectroscópicos e bioquímicos, aliados a mutações sítio-dirigidas, identificou-se a relevância de uma conformação dimérica para a estabilidade conformacional e térmica para a proteína ser funcionalmente ativa, assim como a importância dos motivos conservados DGA (Aspartato-Glicina-Alanina) e RHR (Arginina-Histidina-Arginina) para a atividade da Sau_DacA. O loop L5 localizado entre o sítio ativo e a interface dimérica mostrou-se relevante, uma vez que nele é encontrado o motivo DGA - de ligação ao ATP - e o mesmo encontra-se estabilizado em uma posição favorável para ligação do ATP, apenas na conformação dimérica da proteína. Nossos resultados aliados a dados da literatura possibilitaram a proposição de um mecanismo de síntese de c-di-AMP que deve ocorrer via encontro face-a-face de dois sítios de ligação de ATP presentes em dímeros proteicos distintos, podendo a taxa de síntese de o nucleotídeo sofrer interferência via interação proteína-proteína com a proteína receptora de sinal Sau_YbbR. Desta forma, contribuímos para uma melhor compreensão da estrutura e função da Sau_DacA, possibilitando o uso desta como alvo para o desenvolvimento de novos fármacos, uma vez que é sabido que a biossíntese de c-di-AMP é essencial para a maioria dos patógenos que o sintetizam. / Recently, a new bacterial signaling molecule, the dimeric cyclic AMP (c-di-AMP) has emerged as a central regulator of essential physiological processes, such as cell wall homeostasis, DNA integrity and bacterial virulence, among others. C-di-AMP is synthesized from two molecules of adenosine triphosphate (ATP) by proteins containing DisA_N domain, also called diadenilato cyclases (DACs). A survey in the Protein Families Database database (Pfam) found 2842 protein sequences containing the DAC domain, from 2386 different organisms. These proteins are divided into subfamilies and the three most abundant are: DacA (69,1%), a membrane protein associated with intracellular signaling resulting from an external environment change; DisA (24,1%), the first and most widely studied diadenilate cyclase, an intracellular protein found as active octamers in solution which indirectly controls cell division by DNA integrity verification; and DacB (5,5%), a cytoplasmic proteins, particularly expressed during bacterial spores formation. An interesting feature is that most organisms contain just a single and essential DAC-protein. Organisms containing two or more DAC-containing proteins, such as Clostridium and Bacillus spp., are exceptions. In Staphylococcus aureus (S. aureus), an opportunistic human pathogen responsible for some life-threating diseases, there is a single membrane attached diadenilate cyclase, hanging in the inner portion of the cell membrane (Sau_DacA). The activity of this protein is potentially regulated through direct interaction with YbbR, which contains an extracellular sensor domain. Sau_DacA conserves all key elements of bacterial di-adenylate cyclase, and for being the only di-adenylate cyclase from S. aureus, proves to be an excellent study target for new therapeutic purposes. However, to date, there is a lack of information about structure, c-di-AMP synthesis mechanism and regulation of nucleotide synthesis by Sau_DacA. Therefore, in this context the present work aims to contribute. Through a series of structural, calorimetric, spectroscopic and biochemical assays combined with site-directed mutations, we solved the structure of a soluble construct of Sau_DacA and identified a dimeric interface relevance for the conformational and thermal stability to the protein. This dimer is functionally active and highlights the importance of conserved motifs DGA (Aspartate-Glycine-Alanine) and RHR (Arginine-Histidine-Arginine) for the activity of Sau_DacA. The L5 loop, located between the active site and the dimer interface where is allocated the ATP binding motif (DGA), is stabilized in a favorable position for ATP binding, just in protein dimeric conformation. Our results combined with literary allowed us infer the synthesis of c-di-AMP occurs by face-to-face encounter of two distinct ATP binding site and its rate of synthesis could be regulated through direct protein interaction with. In this way, we contribute to a better understanding of Sau_DacA structure and function, assisting in its use as a target for new drugs development since it is known the biosynthesis of c-di-AMP is essential for most pathogens that synthesize.

Recentemente, uma nova molécula de sinalização bacteriana, o AMP dimérico cíclico (c-di-AMP) emergiu como um regulador central dos processos fisiológicos essenciais, tais como a homeostase celular, verificação da integridade do DNA e virulência bacteriana, entre outros. O c-di-AMP é produzido a partir da condensação de duas moléculas de adenosina trifosfato (ATP) por proteínas denominadas diadenilato ciclases, que contém o domínio DisA_N, também denominado DAC. Existem 2842 sequências de proteínas que contém o domínio DAC, provenientes de 2386 organismos encontradas no banco de dados Protein Families Database (Pfam). Essas proteínas são divididas em subfamílias sendo as três subfamílias mais abundantes: DacA (69,1%), proteínas de membrana associadas a sinalização intracelular de alterações decorrentes do meio externo; DisA (24,1%), primeira diadenilato ciclase a ser amplamente estudada, é uma proteína intracelular encontrada na forma de octâmeros ativos em solução, a qual, indiretamente, controla a divisão celular através da verificação da integridade do DNA e DacB (5,5%), proteínas citoplasmáticas expressa, particularmente, durante a formação de esporos bacterianos. Uma característica interessante é que a maioria dos organismos contém uma única e essencial proteína com domínio DAC. Os organismos que contém duas ou mais proteínas-DAC, tais como Clostridium e Bacillus spp., são uma exceção. Em Staphylococcus aureus (S. aureus), um patógeno humano oportunista e responsável por inúmeras doenças infecciosas, uma única diadenilato ciclase é encontrada pendurada na porção interna da membrana celular (Sau_DacA). A atividade desta proteína é potencialmente regulada através da interação direta com uma proteína YbbR-like, que contém um domínio sensor extracelular. Sau_DacA conserva todos os elementos-chave de uma diadenilato ciclase bacteriana, e por ser a única presente em S. aureus, revela-se um excelente alvo de estudo para o desenvolvimento de novos fins terapêuticos. No entanto, até o presente momento, existem poucas informações em relação a estrutura proteica, ao mecanismo de síntese de c-di-AMP e regulação do mecanismo de síntese de nucleotídeo destas proteínas, sendo, portanto, neste aspectos que o presente trabalho pretendeu contribuir. Através de uma série de ensaios, estruturais, calorimétricos, espectroscópicos e bioquímicos, aliados a mutações sítio-dirigidas, identificou-se a relevância de uma conformação dimérica para a estabilidade conformacional e térmica para a proteína ser funcionalmente ativa, assim como a importância dos motivos conservados DGA (Aspartato-Glicina-Alanina) e RHR (Arginina-Histidina-Arginina) para a atividade da Sau_DacA. O loop L5 localizado entre o sítio ativo e a interface dimérica mostrou-se relevante, uma vez que nele é encontrado o motivo DGA - de ligação ao ATP - e o mesmo encontra-se estabilizado em uma posição favorável para ligação do ATP, apenas na conformação dimérica da proteína. Nossos resultados aliados a dados da literatura possibilitaram a proposição de um mecanismo de síntese de c-di-AMP que deve ocorrer via encontro face-a-face de dois sítios de ligação de ATP presentes em dímeros proteicos distintos, podendo a taxa de síntese de o nucleotídeo sofrer interferência via interação proteína-proteína com a proteína receptora de sinal Sau_YbbR. Desta forma, contribuímos para uma melhor compreensão da estrutura e função da Sau_DacA, possibilitando o uso desta como alvo para o desenvolvimento de novos fármacos, uma vez que é sabido que a biossíntese de c-di-AMP é essencial para a maioria dos patógenos que o sintetizam. / Recently, a new bacterial signaling molecule, the dimeric cyclic AMP (c-di-AMP) has emerged as a central regulator of essential physiological processes, such as cell wall homeostasis, DNA integrity and bacterial virulence, among others. C-di-AMP is synthesized from two molecules of adenosine triphosphate (ATP) by proteins containing DisA_N domain, also called diadenilato cyclases (DACs). A survey in the Protein Families Database database (Pfam) found 2842 protein sequences containing the DAC domain, from 2386 different organisms. These proteins are divided into subfamilies and the three most abundant are: DacA (69,1%), a membrane protein associated with intracellular signaling resulting from an external environment change; DisA (24,1%), the first and most widely studied diadenilate cyclase, an intracellular protein found as active octamers in solution which indirectly controls cell division by DNA integrity verification; and DacB (5,5%), a cytoplasmic proteins, particularly expressed during bacterial spores formation. An interesting feature is that most organisms contain just a single and essential DAC-protein. Organisms containing two or more DAC-containing proteins, such as Clostridium and Bacillus spp., are exceptions. In Staphylococcus aureus (S. aureus), an opportunistic human pathogen responsible for some life-threating diseases, there is a single membrane attached diadenilate cyclase, hanging in the inner portion of the cell membrane (Sau_DacA). The activity of this protein is potentially regulated through direct interaction with YbbR, which contains an extracellular sensor domain. Sau_DacA conserves all key elements of bacterial di-adenylate cyclase, and for being the only di-adenylate cyclase from S. aureus, proves to be an excellent study target for new therapeutic purposes. However, to date, there is a lack of information about structure, c-di-AMP synthesis mechanism and regulation of nucleotide synthesis by Sau_DacA. Therefore, in this context the present work aims to contribute. Through a series of structural, calorimetric, spectroscopic and biochemical assays combined with site-directed mutations, we solved the structure of a soluble construct of Sau_DacA and identified a dimeric interface relevance for the conformational and thermal stability to the protein. This dimer is functionally active and highlights the importance of conserved motifs DGA (Aspartate-Glycine-Alanine) and RHR (Arginine-Histidine-Arginine) for the activity of Sau_DacA. The L5 loop, located between the active site and the dimer interface where is allocated the ATP binding motif (DGA), is stabilized in a favorable position for ATP binding, just in protein dimeric conformation. Our results combined with literary allowed us infer the synthesis of c-di-AMP occurs by face-to-face encounter of two distinct ATP binding site and its rate of synthesis could be regulated through direct protein interaction with. In this way, we contribute to a better understanding of Sau_DacA structure and function, assisting in its use as a target for new drugs development since it is known the biosynthesis of c-di-AMP is essential for most pathogens that synthesize.

A persistência bacteriana correlacionada à formação de biofilmes bacterianos é, há algum tempo, fonte de grande preocupação médica em virtude de sua ampla associação com a dificuldade de tratamento de infecções crônicas. Por outro lado, as perspectivas de utilização de biofilmes bacterianos em novas aplicações biotecnológicas e até mesmo para fins terapêuticos são promissoras. Há, portanto, grande interesse em compreender os mecanismos que levam as células bacterianas a deixar o estado planctônico, de vida livre, e associarem-se nesses conglomerados celulares altamente complexos. Ao longo das últimas décadas, o segundo mensageiro c-di-GMP – em conjunto com as moléculas que catalisam sua síntese (diguanilato ciclases) e sua degradação (fosfodiesterases) e seus receptores – estabeleceu-se como um elemento central de regulação de uma série de respostas celulares que determinam a formação ou a dispersão de biofilmes. Curiosamente, as proteínas que participam do metabolismo deste segundo mensageiro estão, frequentemente, codificadas múltiplas vezes em um mesmo genoma bacteriano. Em vista dessa observação, estudos mais recentes apontam que, para reger paralelamente uma variedade tão ampla de fenótipos, este sistema opera em modo de alta especificidade de sinalização e que, portanto, o sinal metabolizado por determinados conjuntos de diguanilato ciclases e fosfodiesterases tem alvos celulares específicos. Evidências robustas, porém isoladas até o momento, apontaram que um dos meios pelo qual ocorre a segregação entre sinal produzido e alvo específico é a interação direta entre as proteínas componentes das vias de sinalização. Mais, demonstrou-se que, em algumas vias, a transmissão de sinal ocorre exclusivamente via interação proteica, dispensando a intermediação do sinalizador em si. Para avaliar a validade e relevância global deste mecanismo, propôs-se, neste estudo, a investigação da rede total de interações entre as proteínas tipicamente associadas às vias de sinalização por c-di-GMP em Pseudomonas aeruginosa, utilizando ensaios de duplo-hibrido bacteriano. Para tanto, foram construídas duas bibliotecas de DNA direcionadas e foram feitos testes de interação de forma estratégica para possibilitar o esgotamento e averiguação de todas as possíveis interações entre as proteínas alvo identificadas. O resultado obtido, um mapa inicial, porém abrangente, da rede de interações proteicas em P. aeruginosa, indica uma grande probabilidade de que os mecanismos previamente descritos sejam realmente recorrentes e relevantes para o intermédio da sinalização nesse organismo. Algumas das interações mais robustas encontradas são bastante interessantes e serão, em estudos futuros, mais extensivamente estudadas. / Persister bacteria are correlated to biofilm formation and have been a source of great medical concern due to its close association with the impairment of traditional treatment in combating chronic infections. On the other hand, using bacterial biofilms to create original biotechnological applications or even as a means of therapeutic treatment in medical settings constitutes a promising prospect. There is, therefore, a great interest in understanding the mechanisms that allow bacteria to leave the free-living planktonic lifestyle and associate in these highly complex cellular aggregates. Over the last decades, the second messenger c-di-GMP – and also the molecules involved in its synthesis (diguanylate ciclases) and degradation (phosphodiesterases) along with its receptors – has been established as a key element implicated in regulation of a series of cellular responses that determine biofilm formation or dispersion. Curiously, the proteins that play a part in the metabolism of this second messenger are frequently coded multiple times in single bacterial genomes. Taking this into account, recent studies indicate that, in order to control such a wide range of phenotypes, this system operates via high specificity of signaling – which means that the signal metabolized by a certain set of diguanylate ciclases and phosphodiesterases has specific cellular targets. Robust but yet isolated evidence indicate that a means by which a signal is segregated with its correlated phenotypic response is through direct protein-protein interaction involving the components of these signaling pathways. Even more, there has been strikingly evidence that, in some of these pathways, signal transduction occurs exclusively through protein-protein interaction, entirely dismissing any mediation by the signal molecule. In order to validate and evaluate the global relevance of this type of mechanism, this study proposed the investigation of the entire network of interactions between proteins typically associated with c-di-GMP signaling pathways of Pseudomonas aeruginosa by employing bacterial two-hybrid system assays. To make that possible, two DNA libraries were constructed and interaction essays were performed in a strategic way so that all possibilities of interaction between target proteins were explored. The results obtained from these experiments allowed the construction of a broad map of interactions that, although still primitive, indicates that, chances are, the mechanisms previously described are both recurrent and relevant to signaling regulation in this organism. Some of the interaction partners found are particularly interesting and will be further investigated in future studies.

A persistência bacteriana correlacionada à formação de biofilmes bacterianos é, há algum tempo, fonte de grande preocupação médica em virtude de sua ampla associação com a dificuldade de tratamento de infecções crônicas. Por outro lado, as perspectivas de utilização de biofilmes bacterianos em novas aplicações biotecnológicas e até mesmo para fins terapêuticos são promissoras. Há, portanto, grande interesse em compreender os mecanismos que levam as células bacterianas a deixar o estado planctônico, de vida livre, e associarem-se nesses conglomerados celulares altamente complexos. Ao longo das últimas décadas, o segundo mensageiro c-di-GMP – em conjunto com as moléculas que catalisam sua síntese (diguanilato ciclases) e sua degradação (fosfodiesterases) e seus receptores – estabeleceu-se como um elemento central de regulação de uma série de respostas celulares que determinam a formação ou a dispersão de biofilmes. Curiosamente, as proteínas que participam do metabolismo deste segundo mensageiro estão, frequentemente, codificadas múltiplas vezes em um mesmo genoma bacteriano. Em vista dessa observação, estudos mais recentes apontam que, para reger paralelamente uma variedade tão ampla de fenótipos, este sistema opera em modo de alta especificidade de sinalização e que, portanto, o sinal metabolizado por determinados conjuntos de diguanilato ciclases e fosfodiesterases tem alvos celulares específicos. Evidências robustas, porém isoladas até o momento, apontaram que um dos meios pelo qual ocorre a segregação entre sinal produzido e alvo específico é a interação direta entre as proteínas componentes das vias de sinalização. Mais, demonstrou-se que, em algumas vias, a transmissão de sinal ocorre exclusivamente via interação proteica, dispensando a intermediação do sinalizador em si. Para avaliar a validade e relevância global deste mecanismo, propôs-se, neste estudo, a investigação da rede total de interações entre as proteínas tipicamente associadas às vias de sinalização por c-di-GMP em Pseudomonas aeruginosa, utilizando ensaios de duplo-hibrido bacteriano. Para tanto, foram construídas duas bibliotecas de DNA direcionadas e foram feitos testes de interação de forma estratégica para possibilitar o esgotamento e averiguação de todas as possíveis interações entre as proteínas alvo identificadas. O resultado obtido, um mapa inicial, porém abrangente, da rede de interações proteicas em P. aeruginosa, indica uma grande probabilidade de que os mecanismos previamente descritos sejam realmente recorrentes e relevantes para o intermédio da sinalização nesse organismo. Algumas das interações mais robustas encontradas são bastante interessantes e serão, em estudos futuros, mais extensivamente estudadas. / Persister bacteria are correlated to biofilm formation and have been a source of great medical concern due to its close association with the impairment of traditional treatment in combating chronic infections. On the other hand, using bacterial biofilms to create original biotechnological applications or even as a means of therapeutic treatment in medical settings constitutes a promising prospect. There is, therefore, a great interest in understanding the mechanisms that allow bacteria to leave the free-living planktonic lifestyle and associate in these highly complex cellular aggregates. Over the last decades, the second messenger c-di-GMP – and also the molecules involved in its synthesis (diguanylate ciclases) and degradation (phosphodiesterases) along with its receptors – has been established as a key element implicated in regulation of a series of cellular responses that determine biofilm formation or dispersion. Curiously, the proteins that play a part in the metabolism of this second messenger are frequently coded multiple times in single bacterial genomes. Taking this into account, recent studies indicate that, in order to control such a wide range of phenotypes, this system operates via high specificity of signaling – which means that the signal metabolized by a certain set of diguanylate ciclases and phosphodiesterases has specific cellular targets. Robust but yet isolated evidence indicate that a means by which a signal is segregated with its correlated phenotypic response is through direct protein-protein interaction involving the components of these signaling pathways. Even more, there has been strikingly evidence that, in some of these pathways, signal transduction occurs exclusively through protein-protein interaction, entirely dismissing any mediation by the signal molecule. In order to validate and evaluate the global relevance of this type of mechanism, this study proposed the investigation of the entire network of interactions between proteins typically associated with c-di-GMP signaling pathways of Pseudomonas aeruginosa by employing bacterial two-hybrid system assays. To make that possible, two DNA libraries were constructed and interaction essays were performed in a strategic way so that all possibilities of interaction between target proteins were explored. The results obtained from these experiments allowed the construction of a broad map of interactions that, although still primitive, indicates that, chances are, the mechanisms previously described are both recurrent and relevant to signaling regulation in this organism. Some of the interaction partners found are particularly interesting and will be further investigated in future studies.