A presença de bactérias patogênicas com capacidade de formar biofilme nos dispositivos de uso médico constitui um dos principais problemas na saúde pública. O biofilme confere proteção contra os mecanismos de defesa do hospedeiro e ação dos antimicrobianos, aumentando a virulência e resistência dos micro-organismos. A erradicação deste tipo de biofilmes é uma das principais estratégias no tratamento de doenças infecciosas associadas a bactérias patogênicas. A erradicação pode ser feita com o uso de biomoléculas produto do metabolismo secundário de diferentes micro-organismos. O objetivo deste estudo foi procurar novas moléculas com o potencial de erradicar biofilmes patogênicos associados a implantes médicos a partir de bactérias associadas ao género Drosera usando como bactérias alvo os patógenos Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus epidermidis. Para isto, foram crescidos 193 isolados bacterianos associados à planta Drosera que cresce na região litoral de Nova Tramandaí (RS) no sul do Brasil. Do total de isolados bacterianos foram usados os 36 que apresentaram atividade proteolítica para a produção de sobrenadantes bioativos. Os sobrenadantes bioativos foram usados para testes de erradicação de biofilme usando placas de 96 poços e a técnica de Cristal Violeta nas duas bactérias alvo. Nove isolados bacterianos associados à Drosera apresentaram atividade de erradicação de biofilme por acima de 40%, três deles para P. aeruginosa e seis para S. epidermidis. Destes isolados foi escolhido o isolado com melhor atividade de erradicação para P. aeruginosa e foram realizados testes para determinação da concentração mínima de erradicação de biofilme, antiformação de biofilme, viabilidade celular e microscopia eletrônica de varredura junto com a identificação da bactéria por médio de genes 16S, bem como o fracionamento bioguiado do sobrenadante. Adicionalmente, o sobrenadante bioativo foi testado in vitro em um modelo de dispositivo médico (cateter). A bactéria Gram-positiva que apresentou maior atividade de erradicação em seu sobrenadante possui 99% de similaridade com o Bacillus pumilus. Esta atividade de erradicação de biofilme de P. aeruginosa, pode ser atribuída à presença de uma molécula o composto de aproximadamente 34 kDa. Esta biomolécula o composto pode constituir uma alternativa complementária ao uso dos antibióticos convencionais. A perspectiva de purificar e caracterizar esta biomolécula ou composto para P. aeruginosa permitirá estudar seu mecanismo de ação e o uso no tratamento deste biofilme patogénico na clínica. / The presence of pathogenic bacteria with the ability to form biofilm on medical devices is one of the major problems in public health. The biofilm protects against the host defense mechanisms and the action of antibiotics, increasing the virulence and resistance of microorganisms. The elimination of this type of biofilms is a main strategy in the treatment of infectious diseases associated with pathogenic bacteria. This elimination can be done by using biomolecules from the secondary metabolism product of different micro-organisms. The objective of this study was to look for new molecules with the potential to eradicate pathogenic biofilms associated with medical implants from bacteria associated with gender Drosera using bacteria as targets Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus epidermidis pathogens. For this, were grown 193 bacterial isolates associated with Drosera plant that grows in the coastal region of New Tramandaí (RS) in southern Brazil. Of total bacterial isolates were used which had 36 proteolytic activity for the production of bioactive supernatants. The bioactive supernatants were used for biofilm eradication tests using 96- well plates and Crystal Violet technique in both target bacteria. Then the supernatant with the best eradication activity to P. aeruginosa was chosen to determine the minimum concentration to eradicate biofilm, biofilm inhibition, cell viability and scanning electron microscopy together with the identification of the bacteria by means of 16S and bioguided the fractionation of the supernatant. Additionally, the bioactive supernatant was tested in an in vitro model using the clinical device. Nine bacterial isolates associated with Drosera showed biofilm eradication activity by over 40%, three for P. aeruginosa and six for S. epidermidis. The Gram-positive bacterium with 99% similarity to the Bacillus pumilus showed the best biofilm eradication activity to P. aeruginosa capacity allocated to the presence of a molecule composed of approximately 34 kDa. These biomolecules can be an alternative to complement the use of conventional antibiotics or the direct use of antibiotic activity is presented as the case of bioactive found for P. aeruginosa supernatant. The prospect of purify and characterize this biomolecule or compound to P. aeruginosa will allow us to study this mechanism of action and the use in the treatment of this pathogenic biofilm in the clinic.

A presença de bactérias patogênicas com capacidade de formar biofilme nos dispositivos de uso médico constitui um dos principais problemas na saúde pública. O biofilme confere proteção contra os mecanismos de defesa do hospedeiro e ação dos antimicrobianos, aumentando a virulência e resistência dos micro-organismos. A erradicação deste tipo de biofilmes é uma das principais estratégias no tratamento de doenças infecciosas associadas a bactérias patogênicas. A erradicação pode ser feita com o uso de biomoléculas produto do metabolismo secundário de diferentes micro-organismos. O objetivo deste estudo foi procurar novas moléculas com o potencial de erradicar biofilmes patogênicos associados a implantes médicos a partir de bactérias associadas ao género Drosera usando como bactérias alvo os patógenos Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus epidermidis. Para isto, foram crescidos 193 isolados bacterianos associados à planta Drosera que cresce na região litoral de Nova Tramandaí (RS) no sul do Brasil. Do total de isolados bacterianos foram usados os 36 que apresentaram atividade proteolítica para a produção de sobrenadantes bioativos. Os sobrenadantes bioativos foram usados para testes de erradicação de biofilme usando placas de 96 poços e a técnica de Cristal Violeta nas duas bactérias alvo. Nove isolados bacterianos associados à Drosera apresentaram atividade de erradicação de biofilme por acima de 40%, três deles para P. aeruginosa e seis para S. epidermidis. Destes isolados foi escolhido o isolado com melhor atividade de erradicação para P. aeruginosa e foram realizados testes para determinação da concentração mínima de erradicação de biofilme, antiformação de biofilme, viabilidade celular e microscopia eletrônica de varredura junto com a identificação da bactéria por médio de genes 16S, bem como o fracionamento bioguiado do sobrenadante. Adicionalmente, o sobrenadante bioativo foi testado in vitro em um modelo de dispositivo médico (cateter). A bactéria Gram-positiva que apresentou maior atividade de erradicação em seu sobrenadante possui 99% de similaridade com o Bacillus pumilus. Esta atividade de erradicação de biofilme de P. aeruginosa, pode ser atribuída à presença de uma molécula o composto de aproximadamente 34 kDa. Esta biomolécula o composto pode constituir uma alternativa complementária ao uso dos antibióticos convencionais. A perspectiva de purificar e caracterizar esta biomolécula ou composto para P. aeruginosa permitirá estudar seu mecanismo de ação e o uso no tratamento deste biofilme patogénico na clínica. / The presence of pathogenic bacteria with the ability to form biofilm on medical devices is one of the major problems in public health. The biofilm protects against the host defense mechanisms and the action of antibiotics, increasing the virulence and resistance of microorganisms. The elimination of this type of biofilms is a main strategy in the treatment of infectious diseases associated with pathogenic bacteria. This elimination can be done by using biomolecules from the secondary metabolism product of different micro-organisms. The objective of this study was to look for new molecules with the potential to eradicate pathogenic biofilms associated with medical implants from bacteria associated with gender Drosera using bacteria as targets Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus epidermidis pathogens. For this, were grown 193 bacterial isolates associated with Drosera plant that grows in the coastal region of New Tramandaí (RS) in southern Brazil. Of total bacterial isolates were used which had 36 proteolytic activity for the production of bioactive supernatants. The bioactive supernatants were used for biofilm eradication tests using 96- well plates and Crystal Violet technique in both target bacteria. Then the supernatant with the best eradication activity to P. aeruginosa was chosen to determine the minimum concentration to eradicate biofilm, biofilm inhibition, cell viability and scanning electron microscopy together with the identification of the bacteria by means of 16S and bioguided the fractionation of the supernatant. Additionally, the bioactive supernatant was tested in an in vitro model using the clinical device. Nine bacterial isolates associated with Drosera showed biofilm eradication activity by over 40%, three for P. aeruginosa and six for S. epidermidis. The Gram-positive bacterium with 99% similarity to the Bacillus pumilus showed the best biofilm eradication activity to P. aeruginosa capacity allocated to the presence of a molecule composed of approximately 34 kDa. These biomolecules can be an alternative to complement the use of conventional antibiotics or the direct use of antibiotic activity is presented as the case of bioactive found for P. aeruginosa supernatant. The prospect of purify and characterize this biomolecule or compound to P. aeruginosa will allow us to study this mechanism of action and the use in the treatment of this pathogenic biofilm in the clinic.

A presença de bactérias patogênicas com capacidade de formar biofilme nos dispositivos de uso médico constitui um dos principais problemas na saúde pública. O biofilme confere proteção contra os mecanismos de defesa do hospedeiro e ação dos antimicrobianos, aumentando a virulência e resistência dos micro-organismos. A erradicação deste tipo de biofilmes é uma das principais estratégias no tratamento de doenças infecciosas associadas a bactérias patogênicas. A erradicação pode ser feita com o uso de biomoléculas produto do metabolismo secundário de diferentes micro-organismos. O objetivo deste estudo foi procurar novas moléculas com o potencial de erradicar biofilmes patogênicos associados a implantes médicos a partir de bactérias associadas ao género Drosera usando como bactérias alvo os patógenos Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus epidermidis. Para isto, foram crescidos 193 isolados bacterianos associados à planta Drosera que cresce na região litoral de Nova Tramandaí (RS) no sul do Brasil. Do total de isolados bacterianos foram usados os 36 que apresentaram atividade proteolítica para a produção de sobrenadantes bioativos. Os sobrenadantes bioativos foram usados para testes de erradicação de biofilme usando placas de 96 poços e a técnica de Cristal Violeta nas duas bactérias alvo. Nove isolados bacterianos associados à Drosera apresentaram atividade de erradicação de biofilme por acima de 40%, três deles para P. aeruginosa e seis para S. epidermidis. Destes isolados foi escolhido o isolado com melhor atividade de erradicação para P. aeruginosa e foram realizados testes para determinação da concentração mínima de erradicação de biofilme, antiformação de biofilme, viabilidade celular e microscopia eletrônica de varredura junto com a identificação da bactéria por médio de genes 16S, bem como o fracionamento bioguiado do sobrenadante. Adicionalmente, o sobrenadante bioativo foi testado in vitro em um modelo de dispositivo médico (cateter). A bactéria Gram-positiva que apresentou maior atividade de erradicação em seu sobrenadante possui 99% de similaridade com o Bacillus pumilus. Esta atividade de erradicação de biofilme de P. aeruginosa, pode ser atribuída à presença de uma molécula o composto de aproximadamente 34 kDa. Esta biomolécula o composto pode constituir uma alternativa complementária ao uso dos antibióticos convencionais. A perspectiva de purificar e caracterizar esta biomolécula ou composto para P. aeruginosa permitirá estudar seu mecanismo de ação e o uso no tratamento deste biofilme patogénico na clínica. / The presence of pathogenic bacteria with the ability to form biofilm on medical devices is one of the major problems in public health. The biofilm protects against the host defense mechanisms and the action of antibiotics, increasing the virulence and resistance of microorganisms. The elimination of this type of biofilms is a main strategy in the treatment of infectious diseases associated with pathogenic bacteria. This elimination can be done by using biomolecules from the secondary metabolism product of different micro-organisms. The objective of this study was to look for new molecules with the potential to eradicate pathogenic biofilms associated with medical implants from bacteria associated with gender Drosera using bacteria as targets Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus epidermidis pathogens. For this, were grown 193 bacterial isolates associated with Drosera plant that grows in the coastal region of New Tramandaí (RS) in southern Brazil. Of total bacterial isolates were used which had 36 proteolytic activity for the production of bioactive supernatants. The bioactive supernatants were used for biofilm eradication tests using 96- well plates and Crystal Violet technique in both target bacteria. Then the supernatant with the best eradication activity to P. aeruginosa was chosen to determine the minimum concentration to eradicate biofilm, biofilm inhibition, cell viability and scanning electron microscopy together with the identification of the bacteria by means of 16S and bioguided the fractionation of the supernatant. Additionally, the bioactive supernatant was tested in an in vitro model using the clinical device. Nine bacterial isolates associated with Drosera showed biofilm eradication activity by over 40%, three for P. aeruginosa and six for S. epidermidis. The Gram-positive bacterium with 99% similarity to the Bacillus pumilus showed the best biofilm eradication activity to P. aeruginosa capacity allocated to the presence of a molecule composed of approximately 34 kDa. These biomolecules can be an alternative to complement the use of conventional antibiotics or the direct use of antibiotic activity is presented as the case of bioactive found for P. aeruginosa supernatant. The prospect of purify and characterize this biomolecule or compound to P. aeruginosa will allow us to study this mechanism of action and the use in the treatment of this pathogenic biofilm in the clinic.

Os procedimentos de higienização nos matadouros de aves consistem fundamentalmente no uso de água quente, detergentes e sanificantes. Embora a água quente e os detergentes diminuam a carga bacteriana das superfícies, o objetivo principal do seu uso é a remoção de resíduos orgânicos e minerais. A sanitização, que é a última etapa do procedimento de higienização, visa reduzir os microrganismos até níveis seguros, de modo a obter um produto de boa qualidade higiênico-sanitária. Dentre os contaminantes da carne de aves, microrganismos patogênicos apresentam grande relevância como causadores de doenças veiculadas por alimentos e por terem reflexo econômico. Do ponto de vista da segurança e da degradação de alimentos, os biofilmes são importantes devido à sua formação em alimentos, utensílios e superfícies e à sua dificuldade de remoção. Com base na relevância destes temas, nesta tese constam seis trabalhos científicos. No primeiro trabalho foi avaliada a contaminação bacteriana das superfícies em contato com carne de frango através das contagens de microrganismos mesófilos aeróbios, coliformes totais, Escherichia coli, Staphylococcus sp, S. aureus e pesquisa de Salmonella sp. Verificou-se que a E. coli foi detectada na bancada de aço inoxidável e na esteira sobreposta de “nylon”, Staphylococcus sp foi detectado em todas as amostras, S. aureus não foi detectado apenas na bancada de aço inoxidável e em uma das esteiras lisas de poliuretano e Salmonella sp esteve ausente em todas as superfícies analisadas. No trabalho 2 avaliou-se a formação de biofilme em placas de poliestireno por Salmonella Heidelberg isoladas de abatedouros avícolas, cultivadas em caldo TSB com diferentes concentrações de glicose e a hidrofobicidade destas cepas na fase logarítmica (4 h) e na fase estacionária (24 h) do crescimento bacteriano. As S. Heidelberg foram capazes de formar biofilmes no poliestireno, com diferentes fontes de nutrientes, sendo fortemente formadoras de biofilme no caldo TSB sem suplementação de glicose, e foram determinadas como altamente hidrofóbicas e com média hidrofobicidade. O terceiro trabalho foi realizado para comparar o uso de swab e esponja para avaliação de superfícies em contato com alimentos em matadouro de aves. Concluiu-se que não houve diferença estatística entre as duas metodologias para a verificação da higienização em superfícies como as bancadas de aço inoxidável, esteiras de poliuretano, esteira sobreposta de “nylon” e placas de polietileno. No trabalho 4 foi realizada a pesquisa de Salmonella sp e Listeria sp em diferentes superfícies de contato com alimentos e a verificação da eficácia do processo de sanitização. Salmonella sp. não foi isolada em nenhuma das superfícies testadas. Antes da lavagem, isolou-se Listeria welshimeri da esteira de poliuretano e L. monocytogenes da mesa de aço inoxidável, ambas de superfícies contendo resíduos de alimentos. Após a lavagem com água quente isolou-se L. monocytogenes da esteira de poliuretano, sendo que este agente não foi novamente isolado após o tratamento com amônia quaternária a 2%. No trabalho 5 foram avaliadas as condições higiênico-sanitárias das superfícies de uma sala de cortes de abatedouro avícola, utilizando microbiologia convencional (placas Rodac e esponja) e ATP-bioluminescência, para analisar a efetividade da água quente e da ação de três princípios ativos (ácido peracético, amônia quaternária e biguanida) no processo de higienização, quantificando microrganismos mesófilos aeróbios, Staphylococcus aureus, Escherichia coli e ATP. O método ATP-bioluminescência demonstrou a presença de matéria orgânica em todos os pontos coletados e, assim como a microbiologia convencional, também evidenciou a eficácia da higienização, demonstrando ser um método rápido para a verificação e controle do processo. A utilização das placas Rodac possibilitou uma melhor recuperação de microrganismos que a esponja na quantificação de mesófilos aeróbios, E. coli e S. aureus. Houve redução da contaminação após o uso da água quente. Quanto aos sanitizantes, após o uso da amônia quaternária e do ácido peracético, em todas as superfícies avaliadas, não houve mais recuperação de E. coli e S. aureus. No trabalho 6 foi realizada a quantificação da formação de biofilme em poliestireno por Listeria, Escherichia coli e Staphylococcus aureus isolados de superfícies de abatedouro avícola. As amostras de S. aureus formaram biofilme no poliestireno em pelo menos uma das concentrações testadas, sendo fortemente formadoras em caldo TSB com 2 %, 3 %, 3,5 % e 4 % de glicose. As amostras de Listeria demonstraram-se moderadamente formadoras de biofilme em todas as concentrações de glicose testadas, exceto as cultivadas em TSB com 1,5 % glicose, no qual foram não formadoras e fracamente formadoras. Uma amostra, cultivada no caldo TSB com 3,5 % de glicose, foi a única L. monocytogenes considerada fortemente formadora de biofilme. As amostras de E. coli formaram biofilme em pelo menos uma das concentrações testadas, e foram fortemente formadoras quando cultivadas em caldo TSB com 0 %, 3,5 % e 4 %. / Cleaning procedures at poultry slaughterhouses basically include the use of hot water, detergents and sanitizing agents. Although hot water and detergents reduce the bacterial load on surfaces, their main goal is to remove organic and mineral residues. Sanitization, which is the last cleaning step is targeted at reducing the number of microorganisms to safety levels so as to obtain a product of good hygienic and sanitary quality. Among contaminants of poultry meat, pathogenic microorganisms play a key role as causing agents of foodborne diseases and also have a remarkable economic impact. With respect to food safety and degradation, biofilms are important because of their formation on foods, utensils and surfaces and because they cannot be easily removed. Given the relevance of these issues, the present study includes six scientific articles. The first one assessed bacterial contamination of surfaces in contact with poultry meat based on the counting of aerobic mesophiles, total coliforms, Escherichia coli, Staphylococcus sp, S. aureus and investigation of Salmonella sp. E. coli was detected on stainless steel tables and on the overhead nylon conveyor; Staphylococcus sp was detected in all samples; S. aureus was not detected only on stainless steel tables and on one smooth polyurethane conveyor, and Salmonella sp was not detected in any of the surfaces analyzed. The second article assessed biofilm formation on polystyrene cutting boards by Salmonella Heidelberg isolated from poultry slaughterhouses, grown in TSB at different glucose concentrations, in addition to the hydrophobicity of these strains in the logarithmic phase (4 h) and in the stationary phase (24 h) of bacterial growth. S. Heidelberg strains were capable of forming biofilm on polystyrene, at different nutrient concentrations, and turned out to be strong biofilm producers in TSB without glucose supplement, being regarded as highly and moderately hydrophic. The third article compared the use of swab and sponge in the assessment of surfaces in contact with foods at a poultry slaughterhouse. It concluded that there was no statistical difference between the two methods used to check the cleaning of surfaces such as stainless steel tables, polyurethane conveyors, overhead nylon conveyors and polyethylene cutting boards. Article 4 investigated Salmonella sp and Listeria sp on different surfaces in contact with foods and the efficacy of the sanitization process. Salmonella sp. was not isolated on any of the surfaces analyzed. Before washing, Listeria welshimeri was isolated from the polyurethane conveyor and L. monocytogenes from the stainless steel table, both from surfaces that contained food residues. After hot water washing, L. monocytogenes was isolated from the polyurethane conveyor, but this pathogen was not detected again after cleaning with 2% quaternary ammonium. Article 5 assessed the cleaning and hygiene of surfaces in the cutting room of a poultry slaughterhouse using conventional microbiological methods (Rodac plates and sponge) and ATP-bioluminescence to assess the effectiveness of hot water and the action of three active ingredients (peracetic acid, quaternary ammonium and biguanide) in the sanitization process, quantifying aerobic mesophilic microorganisms, Staphylococcus aureus, Escherichia coli and ATP. The ATP-bioluminescence assay revealed presence of organic matter at all sites analyzed and, as with conventional microbiology, it also demonstrated that sanitization was efficacious, proving that it is a quick method for inspecting and controlling the process. The use of Rodac plates allowed for better recovery of microorganisms than the sponge in the quantification of aerobic mesophiles, E. coli and S. aureus. Contamination was reduced after hot water use. With regard to sanitizing agents, E. coli and S. aureus were no longer detected on any of the surfaces analyzed after the use of quaternary ammonium and peracetic acid. The last article quantified biofilm formation on polystyrene by Listeria, Escherichia coli and Staphylococcus aureus isolated from surfaces at a poultry slaughterhouse. S. aureus strains formed biofilm on polystyrene at least at one of the concentrations tested, being strong biofilm producers in TSB with 2, 3, 3.5 and 4% of glucose. Listeria strains were moderate biofilm producers at all glucose concentrations, except for those grown in TSB containing 1.5% of glucose, in which they did not form biofilm or were weak producers. One L. monocytogenes strain, grown in TSB with 3.5% of glucose, was the only one regarded as strong biofilm producer. E. coli strains analyzed formed biofilm at least at one of the concentrations and were strong biofilm producers when grown in TSB with 0, 3.5 and 4% of glucose.

Os procedimentos de higienização nos matadouros de aves consistem fundamentalmente no uso de água quente, detergentes e sanificantes. Embora a água quente e os detergentes diminuam a carga bacteriana das superfícies, o objetivo principal do seu uso é a remoção de resíduos orgânicos e minerais. A sanitização, que é a última etapa do procedimento de higienização, visa reduzir os microrganismos até níveis seguros, de modo a obter um produto de boa qualidade higiênico-sanitária. Dentre os contaminantes da carne de aves, microrganismos patogênicos apresentam grande relevância como causadores de doenças veiculadas por alimentos e por terem reflexo econômico. Do ponto de vista da segurança e da degradação de alimentos, os biofilmes são importantes devido à sua formação em alimentos, utensílios e superfícies e à sua dificuldade de remoção. Com base na relevância destes temas, nesta tese constam seis trabalhos científicos. No primeiro trabalho foi avaliada a contaminação bacteriana das superfícies em contato com carne de frango através das contagens de microrganismos mesófilos aeróbios, coliformes totais, Escherichia coli, Staphylococcus sp, S. aureus e pesquisa de Salmonella sp. Verificou-se que a E. coli foi detectada na bancada de aço inoxidável e na esteira sobreposta de “nylon”, Staphylococcus sp foi detectado em todas as amostras, S. aureus não foi detectado apenas na bancada de aço inoxidável e em uma das esteiras lisas de poliuretano e Salmonella sp esteve ausente em todas as superfícies analisadas. No trabalho 2 avaliou-se a formação de biofilme em placas de poliestireno por Salmonella Heidelberg isoladas de abatedouros avícolas, cultivadas em caldo TSB com diferentes concentrações de glicose e a hidrofobicidade destas cepas na fase logarítmica (4 h) e na fase estacionária (24 h) do crescimento bacteriano. As S. Heidelberg foram capazes de formar biofilmes no poliestireno, com diferentes fontes de nutrientes, sendo fortemente formadoras de biofilme no caldo TSB sem suplementação de glicose, e foram determinadas como altamente hidrofóbicas e com média hidrofobicidade. O terceiro trabalho foi realizado para comparar o uso de swab e esponja para avaliação de superfícies em contato com alimentos em matadouro de aves. Concluiu-se que não houve diferença estatística entre as duas metodologias para a verificação da higienização em superfícies como as bancadas de aço inoxidável, esteiras de poliuretano, esteira sobreposta de “nylon” e placas de polietileno. No trabalho 4 foi realizada a pesquisa de Salmonella sp e Listeria sp em diferentes superfícies de contato com alimentos e a verificação da eficácia do processo de sanitização. Salmonella sp. não foi isolada em nenhuma das superfícies testadas. Antes da lavagem, isolou-se Listeria welshimeri da esteira de poliuretano e L. monocytogenes da mesa de aço inoxidável, ambas de superfícies contendo resíduos de alimentos. Após a lavagem com água quente isolou-se L. monocytogenes da esteira de poliuretano, sendo que este agente não foi novamente isolado após o tratamento com amônia quaternária a 2%. No trabalho 5 foram avaliadas as condições higiênico-sanitárias das superfícies de uma sala de cortes de abatedouro avícola, utilizando microbiologia convencional (placas Rodac e esponja) e ATP-bioluminescência, para analisar a efetividade da água quente e da ação de três princípios ativos (ácido peracético, amônia quaternária e biguanida) no processo de higienização, quantificando microrganismos mesófilos aeróbios, Staphylococcus aureus, Escherichia coli e ATP. O método ATP-bioluminescência demonstrou a presença de matéria orgânica em todos os pontos coletados e, assim como a microbiologia convencional, também evidenciou a eficácia da higienização, demonstrando ser um método rápido para a verificação e controle do processo. A utilização das placas Rodac possibilitou uma melhor recuperação de microrganismos que a esponja na quantificação de mesófilos aeróbios, E. coli e S. aureus. Houve redução da contaminação após o uso da água quente. Quanto aos sanitizantes, após o uso da amônia quaternária e do ácido peracético, em todas as superfícies avaliadas, não houve mais recuperação de E. coli e S. aureus. No trabalho 6 foi realizada a quantificação da formação de biofilme em poliestireno por Listeria, Escherichia coli e Staphylococcus aureus isolados de superfícies de abatedouro avícola. As amostras de S. aureus formaram biofilme no poliestireno em pelo menos uma das concentrações testadas, sendo fortemente formadoras em caldo TSB com 2 %, 3 %, 3,5 % e 4 % de glicose. As amostras de Listeria demonstraram-se moderadamente formadoras de biofilme em todas as concentrações de glicose testadas, exceto as cultivadas em TSB com 1,5 % glicose, no qual foram não formadoras e fracamente formadoras. Uma amostra, cultivada no caldo TSB com 3,5 % de glicose, foi a única L. monocytogenes considerada fortemente formadora de biofilme. As amostras de E. coli formaram biofilme em pelo menos uma das concentrações testadas, e foram fortemente formadoras quando cultivadas em caldo TSB com 0 %, 3,5 % e 4 %. / Cleaning procedures at poultry slaughterhouses basically include the use of hot water, detergents and sanitizing agents. Although hot water and detergents reduce the bacterial load on surfaces, their main goal is to remove organic and mineral residues. Sanitization, which is the last cleaning step is targeted at reducing the number of microorganisms to safety levels so as to obtain a product of good hygienic and sanitary quality. Among contaminants of poultry meat, pathogenic microorganisms play a key role as causing agents of foodborne diseases and also have a remarkable economic impact. With respect to food safety and degradation, biofilms are important because of their formation on foods, utensils and surfaces and because they cannot be easily removed. Given the relevance of these issues, the present study includes six scientific articles. The first one assessed bacterial contamination of surfaces in contact with poultry meat based on the counting of aerobic mesophiles, total coliforms, Escherichia coli, Staphylococcus sp, S. aureus and investigation of Salmonella sp. E. coli was detected on stainless steel tables and on the overhead nylon conveyor; Staphylococcus sp was detected in all samples; S. aureus was not detected only on stainless steel tables and on one smooth polyurethane conveyor, and Salmonella sp was not detected in any of the surfaces analyzed. The second article assessed biofilm formation on polystyrene cutting boards by Salmonella Heidelberg isolated from poultry slaughterhouses, grown in TSB at different glucose concentrations, in addition to the hydrophobicity of these strains in the logarithmic phase (4 h) and in the stationary phase (24 h) of bacterial growth. S. Heidelberg strains were capable of forming biofilm on polystyrene, at different nutrient concentrations, and turned out to be strong biofilm producers in TSB without glucose supplement, being regarded as highly and moderately hydrophic. The third article compared the use of swab and sponge in the assessment of surfaces in contact with foods at a poultry slaughterhouse. It concluded that there was no statistical difference between the two methods used to check the cleaning of surfaces such as stainless steel tables, polyurethane conveyors, overhead nylon conveyors and polyethylene cutting boards. Article 4 investigated Salmonella sp and Listeria sp on different surfaces in contact with foods and the efficacy of the sanitization process. Salmonella sp. was not isolated on any of the surfaces analyzed. Before washing, Listeria welshimeri was isolated from the polyurethane conveyor and L. monocytogenes from the stainless steel table, both from surfaces that contained food residues. After hot water washing, L. monocytogenes was isolated from the polyurethane conveyor, but this pathogen was not detected again after cleaning with 2% quaternary ammonium. Article 5 assessed the cleaning and hygiene of surfaces in the cutting room of a poultry slaughterhouse using conventional microbiological methods (Rodac plates and sponge) and ATP-bioluminescence to assess the effectiveness of hot water and the action of three active ingredients (peracetic acid, quaternary ammonium and biguanide) in the sanitization process, quantifying aerobic mesophilic microorganisms, Staphylococcus aureus, Escherichia coli and ATP. The ATP-bioluminescence assay revealed presence of organic matter at all sites analyzed and, as with conventional microbiology, it also demonstrated that sanitization was efficacious, proving that it is a quick method for inspecting and controlling the process. The use of Rodac plates allowed for better recovery of microorganisms than the sponge in the quantification of aerobic mesophiles, E. coli and S. aureus. Contamination was reduced after hot water use. With regard to sanitizing agents, E. coli and S. aureus were no longer detected on any of the surfaces analyzed after the use of quaternary ammonium and peracetic acid. The last article quantified biofilm formation on polystyrene by Listeria, Escherichia coli and Staphylococcus aureus isolated from surfaces at a poultry slaughterhouse. S. aureus strains formed biofilm on polystyrene at least at one of the concentrations tested, being strong biofilm producers in TSB with 2, 3, 3.5 and 4% of glucose. Listeria strains were moderate biofilm producers at all glucose concentrations, except for those grown in TSB containing 1.5% of glucose, in which they did not form biofilm or were weak producers. One L. monocytogenes strain, grown in TSB with 3.5% of glucose, was the only one regarded as strong biofilm producer. E. coli strains analyzed formed biofilm at least at one of the concentrations and were strong biofilm producers when grown in TSB with 0, 3.5 and 4% of glucose.

Os procedimentos de higienização nos matadouros de aves consistem fundamentalmente no uso de água quente, detergentes e sanificantes. Embora a água quente e os detergentes diminuam a carga bacteriana das superfícies, o objetivo principal do seu uso é a remoção de resíduos orgânicos e minerais. A sanitização, que é a última etapa do procedimento de higienização, visa reduzir os microrganismos até níveis seguros, de modo a obter um produto de boa qualidade higiênico-sanitária. Dentre os contaminantes da carne de aves, microrganismos patogênicos apresentam grande relevância como causadores de doenças veiculadas por alimentos e por terem reflexo econômico. Do ponto de vista da segurança e da degradação de alimentos, os biofilmes são importantes devido à sua formação em alimentos, utensílios e superfícies e à sua dificuldade de remoção. Com base na relevância destes temas, nesta tese constam seis trabalhos científicos. No primeiro trabalho foi avaliada a contaminação bacteriana das superfícies em contato com carne de frango através das contagens de microrganismos mesófilos aeróbios, coliformes totais, Escherichia coli, Staphylococcus sp, S. aureus e pesquisa de Salmonella sp. Verificou-se que a E. coli foi detectada na bancada de aço inoxidável e na esteira sobreposta de “nylon”, Staphylococcus sp foi detectado em todas as amostras, S. aureus não foi detectado apenas na bancada de aço inoxidável e em uma das esteiras lisas de poliuretano e Salmonella sp esteve ausente em todas as superfícies analisadas. No trabalho 2 avaliou-se a formação de biofilme em placas de poliestireno por Salmonella Heidelberg isoladas de abatedouros avícolas, cultivadas em caldo TSB com diferentes concentrações de glicose e a hidrofobicidade destas cepas na fase logarítmica (4 h) e na fase estacionária (24 h) do crescimento bacteriano. As S. Heidelberg foram capazes de formar biofilmes no poliestireno, com diferentes fontes de nutrientes, sendo fortemente formadoras de biofilme no caldo TSB sem suplementação de glicose, e foram determinadas como altamente hidrofóbicas e com média hidrofobicidade. O terceiro trabalho foi realizado para comparar o uso de swab e esponja para avaliação de superfícies em contato com alimentos em matadouro de aves. Concluiu-se que não houve diferença estatística entre as duas metodologias para a verificação da higienização em superfícies como as bancadas de aço inoxidável, esteiras de poliuretano, esteira sobreposta de “nylon” e placas de polietileno. No trabalho 4 foi realizada a pesquisa de Salmonella sp e Listeria sp em diferentes superfícies de contato com alimentos e a verificação da eficácia do processo de sanitização. Salmonella sp. não foi isolada em nenhuma das superfícies testadas. Antes da lavagem, isolou-se Listeria welshimeri da esteira de poliuretano e L. monocytogenes da mesa de aço inoxidável, ambas de superfícies contendo resíduos de alimentos. Após a lavagem com água quente isolou-se L. monocytogenes da esteira de poliuretano, sendo que este agente não foi novamente isolado após o tratamento com amônia quaternária a 2%. No trabalho 5 foram avaliadas as condições higiênico-sanitárias das superfícies de uma sala de cortes de abatedouro avícola, utilizando microbiologia convencional (placas Rodac e esponja) e ATP-bioluminescência, para analisar a efetividade da água quente e da ação de três princípios ativos (ácido peracético, amônia quaternária e biguanida) no processo de higienização, quantificando microrganismos mesófilos aeróbios, Staphylococcus aureus, Escherichia coli e ATP. O método ATP-bioluminescência demonstrou a presença de matéria orgânica em todos os pontos coletados e, assim como a microbiologia convencional, também evidenciou a eficácia da higienização, demonstrando ser um método rápido para a verificação e controle do processo. A utilização das placas Rodac possibilitou uma melhor recuperação de microrganismos que a esponja na quantificação de mesófilos aeróbios, E. coli e S. aureus. Houve redução da contaminação após o uso da água quente. Quanto aos sanitizantes, após o uso da amônia quaternária e do ácido peracético, em todas as superfícies avaliadas, não houve mais recuperação de E. coli e S. aureus. No trabalho 6 foi realizada a quantificação da formação de biofilme em poliestireno por Listeria, Escherichia coli e Staphylococcus aureus isolados de superfícies de abatedouro avícola. As amostras de S. aureus formaram biofilme no poliestireno em pelo menos uma das concentrações testadas, sendo fortemente formadoras em caldo TSB com 2 %, 3 %, 3,5 % e 4 % de glicose. As amostras de Listeria demonstraram-se moderadamente formadoras de biofilme em todas as concentrações de glicose testadas, exceto as cultivadas em TSB com 1,5 % glicose, no qual foram não formadoras e fracamente formadoras. Uma amostra, cultivada no caldo TSB com 3,5 % de glicose, foi a única L. monocytogenes considerada fortemente formadora de biofilme. As amostras de E. coli formaram biofilme em pelo menos uma das concentrações testadas, e foram fortemente formadoras quando cultivadas em caldo TSB com 0 %, 3,5 % e 4 %. / Cleaning procedures at poultry slaughterhouses basically include the use of hot water, detergents and sanitizing agents. Although hot water and detergents reduce the bacterial load on surfaces, their main goal is to remove organic and mineral residues. Sanitization, which is the last cleaning step is targeted at reducing the number of microorganisms to safety levels so as to obtain a product of good hygienic and sanitary quality. Among contaminants of poultry meat, pathogenic microorganisms play a key role as causing agents of foodborne diseases and also have a remarkable economic impact. With respect to food safety and degradation, biofilms are important because of their formation on foods, utensils and surfaces and because they cannot be easily removed. Given the relevance of these issues, the present study includes six scientific articles. The first one assessed bacterial contamination of surfaces in contact with poultry meat based on the counting of aerobic mesophiles, total coliforms, Escherichia coli, Staphylococcus sp, S. aureus and investigation of Salmonella sp. E. coli was detected on stainless steel tables and on the overhead nylon conveyor; Staphylococcus sp was detected in all samples; S. aureus was not detected only on stainless steel tables and on one smooth polyurethane conveyor, and Salmonella sp was not detected in any of the surfaces analyzed. The second article assessed biofilm formation on polystyrene cutting boards by Salmonella Heidelberg isolated from poultry slaughterhouses, grown in TSB at different glucose concentrations, in addition to the hydrophobicity of these strains in the logarithmic phase (4 h) and in the stationary phase (24 h) of bacterial growth. S. Heidelberg strains were capable of forming biofilm on polystyrene, at different nutrient concentrations, and turned out to be strong biofilm producers in TSB without glucose supplement, being regarded as highly and moderately hydrophic. The third article compared the use of swab and sponge in the assessment of surfaces in contact with foods at a poultry slaughterhouse. It concluded that there was no statistical difference between the two methods used to check the cleaning of surfaces such as stainless steel tables, polyurethane conveyors, overhead nylon conveyors and polyethylene cutting boards. Article 4 investigated Salmonella sp and Listeria sp on different surfaces in contact with foods and the efficacy of the sanitization process. Salmonella sp. was not isolated on any of the surfaces analyzed. Before washing, Listeria welshimeri was isolated from the polyurethane conveyor and L. monocytogenes from the stainless steel table, both from surfaces that contained food residues. After hot water washing, L. monocytogenes was isolated from the polyurethane conveyor, but this pathogen was not detected again after cleaning with 2% quaternary ammonium. Article 5 assessed the cleaning and hygiene of surfaces in the cutting room of a poultry slaughterhouse using conventional microbiological methods (Rodac plates and sponge) and ATP-bioluminescence to assess the effectiveness of hot water and the action of three active ingredients (peracetic acid, quaternary ammonium and biguanide) in the sanitization process, quantifying aerobic mesophilic microorganisms, Staphylococcus aureus, Escherichia coli and ATP. The ATP-bioluminescence assay revealed presence of organic matter at all sites analyzed and, as with conventional microbiology, it also demonstrated that sanitization was efficacious, proving that it is a quick method for inspecting and controlling the process. The use of Rodac plates allowed for better recovery of microorganisms than the sponge in the quantification of aerobic mesophiles, E. coli and S. aureus. Contamination was reduced after hot water use. With regard to sanitizing agents, E. coli and S. aureus were no longer detected on any of the surfaces analyzed after the use of quaternary ammonium and peracetic acid. The last article quantified biofilm formation on polystyrene by Listeria, Escherichia coli and Staphylococcus aureus isolated from surfaces at a poultry slaughterhouse. S. aureus strains formed biofilm on polystyrene at least at one of the concentrations tested, being strong biofilm producers in TSB with 2, 3, 3.5 and 4% of glucose. Listeria strains were moderate biofilm producers at all glucose concentrations, except for those grown in TSB containing 1.5% of glucose, in which they did not form biofilm or were weak producers. One L. monocytogenes strain, grown in TSB with 3.5% of glucose, was the only one regarded as strong biofilm producer. E. coli strains analyzed formed biofilm at least at one of the concentrations and were strong biofilm producers when grown in TSB with 0, 3.5 and 4% of glucose.

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:30:27Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3563_1.pdf: 2862069 bytes, checksum: 8ef6f7035e92bf837ff1580945cd1157 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Atualmente, a Pseudomonas aeruginosa é o bacilo Gram-negativo mais reportado em casos de infecções hospitalares. Sua elevada resistência a antimicrobianos e desinfetantes químicos pode ser explicada, em parte, pela forma de crescimento em biofilmes. A variante mucóide da P. aeruginosa, comumente isolada de pacientes com fibrose cística, é capaz de produzir grandes quantidades de alginato, resultando em biofilmes extremamente complexos. O presente estudo objetivou realizar um levantamento da prevalência da P. aeruginosa, bem como seu perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos no Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Pernambuco (HC), assim como avaliar a ação do óxido nítrico sobre biofilmes de amostras mucóides da mesma bactéria oriundas de pacientes com fibrose cística do Instituto de Medicina Integral Professor Fernando Figueira (IMIP), Recife-PE. Para a análise da prevalência, foi realizado um estudo retrospectivo baseado no livro de registros de secreções diversas do laboratório de bacteriologia do HC. Biofilmes de amostras mucóides e não-mucóides de pacientes com fibrose cística do IMIP foram analisados sobre microscopia eletrônica de varredura. As bactérias mais freqüentes, isoladas das secreções diversas, foram P. aeruginosa (26%) e S. aureus (25%). Quanto à origem, a P. aeruginosa parece ser um patógeno essencialmente respiratório, uma vez que 33% das amostras positivas para esta bactéria foram de secreções traqueais e 21% nasais. Os antimicrobianos mais eficazes contra a P. aeruginosa foram Amicacina, Imipenem, Meropenem e Aztreonam. Biofilmes de amostras mucóides da P. aeruginosa são muito mais complexos se comparados aos das amostras não-mucóides. No primeiro caso, as bactérias se agregam em estruturas que lembram teias de aranha que se fixam ao substrato formando grandes estruturas complexas no interior das microcolônias. Portanto, apesar da elevada prevalência no HC, a P. aeruginosa mostrou boa sensibilidade aos antimicrobianos testados naquele hospital. Ainda concluindo, biofilmes desta bactéria apresentam grande complexidade e necessitam de estudos mais aprofundados. Apesar de mais complexos, biofilmes mucóides da P. aeruginosa podem ser inibidos na presença de concentrações nanomolares do nitroprussiato de sódio

Os microrganismos podem apresentar-se tanto em forma de vida livre como aderidos a uma superfície ou interface ar-líquido, formando comunidades complexas e dinâmicas conhecidas como biofilmes. Nos últimos anos, com o avanço das pesquisas em nível molecular, foi identificado que a maioria das bactérias utilizam guanosina monofosfato (3´-5´)-cíclica dimérica (c-di-GMP) como um segundo mensageiro. De forma geral, essa molécula controla a sinalização celular, virulência, comunicação entre células e a expressão de proteínas relacionadas com o fenótipo de biofilmes, em resposta à sua concentração intracelular. Sua síntese e degradação são controladas respectivamente por diguanilto ciclases (DGCs) contendo domínio GGDEF e fosfodiesterases (PDEs) que possuem os domínios EAL ou HD-GYP. Em Pseudomonas aeruginosa (PA14) foi identificada uma nova classe de receptor específico para c-di-GMP, a proteína transmembranar PelD, cuja porção citoplasmática contém os domínios GAF e GGDEF degenerado. Sua modulação através desse dinucleotídeo controla a produção de exopolissacarídeos pelos componentes do conservado operon pel e influencia diretamente na capacidade de formação de biofilmes. Devido à escassez de dados a respeito dos eventos moleculares do mecanismo de sinalização mediado por c-di-GMP, este trabalho teve como objetivo principal a caracterização biofísica/estrutural da proteína PelD, bem como o reconhecimento de interação entre este ligante e a porção citoplasmática da proteína. Diversas construções solúveis de PelD foram clonadas e expressas, sendo que a construção compreendendo os resíduos 176-455 (PelD176-455) foi cristalizada com sucesso e teve sua estrutura determinada por iodo-SAD. O modelo final apresentou os dois domínios com enovelamentos característicos das famílias GAF e GGDEF, sendo a interface inter-domínios composta majoritariamente por resíduos hidrofóbicos. Visando uma compreensão das bases moleculares de reconhecimento e ativação de PelD por c-di-GMP, uma estrutura em complexo com o ligante foi resolvida. Como esperado, o dinucleotídeo foi encontrado no sítio inibitório do domínio GGDEF, onde o motivo R367xxD370 e o resíduo R402 são responsáveis pela maior parte das interações com c-di-GMP. No entanto, nenhuma grande mudança estrutural foi observada entre as formas apo e holo de PelD, ao contrário de outros sistemas efetores tal como LapD e domínios PilZ. Curiosamente, apenas uma molécula de c-di-GMP foi encontrada no sítio, contrastando com a forma dimérica intercalada normalmente ligada aos sítios inibitórios de domínios GGDEF, tais como em PleD e WspR. Estudos de ITC confirmaram a estequiometria 1:1 em solução. Isso mostra a versatilidade dos diversos receptores já identificados até o momento, frente à ligação desse dinucleotídeo. Estudos de bioinformática identificaram uma potencial região de coiled-coil na hélice juxtamembrana de PelD, resíduos 115-160, provavelmente responsável pela homodimerização. Visando uma comprovação experimental dessa hipótese, uma construção contendo toda a porção citoplasmática, PelD111-455, foi expressa e purificada. Estudos comparativos de dicroísmo circular e ultracentrifugação analítica entre as construções PelD176-455 e PelD111-455 realmente demonstraram que os resíduos extras presentes em PelD111-455 formam uma hélice-α e são responsáveis pela dimerização da porção citoplasmática da proteína. De modo geral, os resultados aqui apresentados não só contribuirão para o entendimento dos mecanismos de regulação das vias de sinalização mediadas por c-di-GMP como, em longo prazo, poderão levar ao desenvolvimento de agentes contra infecções bacterianas. / Microorganisms may be presented either in planktonic free-swimming life-style or adhered to surfaces, forming a complex and dynamic community known as biofilm. In recent years, with the progress of research at the molecular level, it was identified that the majority of bacteria use guanosine monophosphate (3\'-5 \')-cyclic dimeric (c-di-GMP) as a second messenger. Generally, this molecule controls the cell signaling, virulence, communication between cells and expression of proteins related to the phenotype of biofilms in response to its intracellular concentration. Its synthesis and degradation are controlled respectively by diguanylate cyclases (DGC) containing the GGDEF domain and phosphodiesterases (PDE) with the domains EAL or HD-GYP. In Pseudomonas aeruginosa (PA14) a novel class of receptor specific for c-di-GMP has been identified, the transmembrane protein PelD, which contains a GAF and degenerate GGDEF domains in the cytoplasmic portion. Its modulation through this dinucleotide controls the production of exopolysaccharides by the components of the conserved operon pel and directly influences the ability of biofilm formation. Due to the paucity of data about the molecular events of the signaling mechanism mediated by c-di-GMP, this study aimed to characterize biophysically and structurally the protein PelD. Various soluble constructions of PelD were cloned and expressed, and the construction comprising the residues 176-455 (PelD176-455) was successfully crystallized and its structure was determined by iodine-SAD. The final model showed the two characteristic domains of families GAF and GGDEF, and the inter-domain interface composed primarily of hydrophobic residues. Seeking an understanding of the molecular basis of recognition and activation of PelD by c-di-GMP, a structure in complex with the ligand was solved. As expected, the dinucleotide was found at the inhibitory site of the GGDEF domain, where the motif R367xxD370 and the residue R402 are responsible for most of the interactions with c-di-GMP. However, no major structural change was observed between the apo and holo forms of PelD, unlike other effector systems such as LapD and domains PilZ. Interestingly, only one molecule of c-di-GMP was present on the site, in contrast to the dimeric intercalated form normally found at I-sites GGDEF domains, such as PleD and in WspR. ITC studies confirmed the 1:1 stoichiometry in solution. This shows the versatility of the various receptors identified so far, compared to the binding of dinucleotide. Bioinformatics studies have identified a potential coiled-coil region in the juxtamembrane helix of PelD, residues 115-160, probably responsible for homodimerization. Aiming at an experimental confirmation of this hypothesis, a construct containing the full cytoplasmic portion, PelD111-455 was expressed and purified. Comparative studies of circular dichroism and analytical ultracentrifugation between constructs PelD176-455 and PelD111-455 indeed demonstrated that the extra residues present in PelD111-455 form an α-helix and are responsible for dimerization of the cytoplasmic portion of the protein. Overall, the results presented here not only contribute to the understanding of the mechanisms of regulation of signaling pathways mediated by c-di-GMP as in the long run, may lead to the development of agents against bacterial infections.

Biofilmes são comunidades bacterianas tridimensionais complexas, que vivem organizadas e aderidas a uma superfície, biótica ou abiótica, embebidas em uma matriz exopolimérica. Cerca de 80% das bactérias vivem organizadas na forma de biofilmes, pois dentro destas estruturas são menos sensíveis aos antibióticos e à resposta imune do hospedeiro. Dentre as principais bactérias formadoras de biofilmes têm-se Staphylococcus spp., Pseudomonas aeruginosa e enterobacteriaceas. Estas bactérias formadoras de biofilmes são importantes colonizadoras da superfície de dispositivos médicos e implantes, aumentando a morbidade e mortalidade dos pacientes que apresentam este tipo de infecção. A investigação de novas estratégias para prevenção e tratamento de infecções por biofilmes é urgentemente necessária. Dentre estas estratégias estão a pesquisa de diferentes mecanismos ou substâncias capazes de provocar a inibição da formação ou a erradicação do biofilme formado. Neste contexto, os venenos animais representam uma fonte ainda inexplorada de uma vasta quantidade de moléculas bioativas, candidatas ao desenvolvimento de novas terapias, inclusive antibiofilme. O principal objetivo deste estudo é avaliar diferentes venenos de serpentes e análogos sintéticos como fonte de moléculas contra biofilmes bacterianos patogênicos. O capítulo 1 revisa estudos que relatam a atividade antimicrobiana (contra bactérias, vírus, protozoários e fungos) de 170 peptídeos isolados de venenos de oito diferentes animais. Peptídeos antimicrobianos vêm ganhando destaque em pesquisas para o tratamento de infecções e peptídeos com atividade antibiofilme são uma nova e promissora abordagem, para o tratamento de infecções relacionadas. O capítulo 2 mostra as atividades antimicrobiana, antibiofilme e de erradicação de biofilmes pré-estabelicidos de 18 análogos de peptídeos de oriundos de venenos de serpentes. Inicialmente foram analisadas e alinhadas 170 sequências peptídeos oriundos de venenos animais. O pepptídeos 16 apresentou considerável atividade antimicrobiana contra cepas bacterianas Gram-positivas, sensíveis e resistentes. Para S. epidermidis os peptídeos 1, 2, 3, 4, 12, 13 e 16 apresentaram menos de 50% de formação de biofilme e os peptídeos 2, 3 e 16 reduziram o biofilme pré-formad. A citotoxicidade e a actividade hemolítica foram testadas e os peptídeos ativos 2 e 16 apresentaram citotoxicidade e hemólise significativas em comparação com os controles. A posição dos aminoácidos pode contribuir para as atividades, sendo que mais testes são necessários para entender a relação das posições de aminoácidos na ação. O capítulo 3 mostra as atividades antiformação e erradicação de biofilmes pré-estabelecidos de dezessete diferentes venenos de serpentes, duas de escorpiões e três de anêmonas marinhas, bem como as secreções de pele de três espécies de sapos. Consideráveis atividades antiformação e de erradicação foram verificadas contra as cepas de S. aureus, S. epidermidis e E. cloaceae por todos os venenos de serpentes testados, em diferentes concentrações. Além disso, um fracionamento inicial foi realizado e as melhores condições foram selecionadas para um novo fracionamento, onde foram testadas 27 frações de veneno de B. diporus. As frações 8, 14 e 23 apresentaram atividades com menos de 50% de formação de biofilme e menos de 80% do biofilme remanescente. Os resultados indicam a capacidade dos venenos, especialmente da serpente de B. diporus, de serem potenciais fontes de moléculas como estratégia para combater os biofilmes patogênicos bacterianos. O presente estudo aborda o potencial de venenos animais, principalmente venenos de serpentes, como fonte de moléculas, que podem apresentar inúmeras atividades farmacológicas inéditas, incluindo àquelas relacionadas com a prevenção da formação e de erradicação de biofilmes bacterianos patogênicos. Atualmente, existem seis medicamentos aprovados pelo Food and Drug Administration (FDA), oriundos de venenos, como o Captopril (Capoten®). Este estudo mostra a capacidade de venenos como fonte de novas moléculas ativas contra biofilmes patogênicos. / Biofilms are complex three-dimensional bacterial communities living organized and attached on a surface, embedded in exopolimeric matrix. About 80% of live bacteria are organized in the form of biofilms because in these structures are less sensitive to antibiotics and host immune response. Staphylococcus spp., Pseudomonas aeruginosa and enterobacteriaceas are the main biofilm forming bacteria. These forming biofilms bacteria are important colonizing surface of medical devices and implants, increasing the morbidity and mortality of patients with this kind of infection. The investigation of new strategies for prevention and treatment of infections caused by biofilms is urgently needed. Among these strategies, there are the research of different mechanisms or substances capable of inhibit the formation or to eradicate the formed biofilm. In this context, animal venoms represent an untapped source of vast amounts of bioactive molecules, candidates for the development of new therapies, including antibiofilm. The main objective of this study is to evaluate different venoms of snakes and synthetic analogs as source of molecules against pathogenic bacterial biofilms. The chapter 1 reviewed numerous studies reporting the antimicrobial activity (against bacteria, viruses, protozoa and fungi) of 170 peptides isolated from venoms of eight different animals. Antimicrobial peptides have been gaining attention in research for the treatment of infections and peptides with antibiofilm activity are a new and promising approach for the treatment of infections related. The chapter 2 shows the antimicrobial, antibiofilm and eradication of established biofilms activities of 18 analogs of peptides derived from snake venoms. Initially, 170 peptide sequences from animal venoms were analyzed and aligned. The peptide 16 showed considerable antimicrobial activity against Gram-positive bacterial strains, sensitive and resistant. For S. epidermidis, the peptides 1, 2, 3, 4, 12, 13 and 16 showed less than 50% of biofilm formation and peptides 2, 3 and 16 reduced preformed biofilm. Cytotoxicity and hemolytic activity were tested and active peptides 2 and 16 showed significant cytotoxicity and hemolysis compared with the controls. The position of the amino acids can contribute to the activities and more tests are needed to understand the relationship of the amino acid positions in the action. The chapter 3 shows the antiformation and eradication of established biofilms activities of seventeen different venoms of snakes, two of scorpions and three of marine anemones, as well as the skin secretions of three species of frogs. Significant activities were observed against strains of S. aureus, S. epidermidis and E. cloaceae for all venom of snakes tested at different concentrations. In addition, an initial fractionation was performed and the best conditions were selected for a new fractionation, where 27 fractions of B. diporus enom were tested. Fractions 8, 14 and 23 presented activities with less than 50% of biofilm formation and less than 80% of the remaining biofilm. The results indicate the ability of venoms, especially the snake B. diporus, to be potential sources of molecules as a strategy to combat bacterial pathogenic biofilms. This study addresses the potential of animal venoms, especially snake venoms, as source of molecules, which can present numerous unpublished pharmacological activities, including those related to the prevention of the formation and eradication of pathogenic bacterial biofilms. Currently, there are six drugs approved by Food and Drug Administration (FDA), derived from venoms, such as Captopril®. This study shows the ability of venoms as source of new bioactive molecules against pathogenic biofilms.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-05-06T16:54:51Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2543097 bytes, checksum: 2cf75ea8db42a45b228e5bd1fc41258d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-06T16:54:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2543097 bytes, checksum: 2cf75ea8db42a45b228e5bd1fc41258d (MD5) Previous issue date: 2015-02-23 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Os butenolídeos, γ-lactonas insaturadas, estão presentes na estrutura de um grande número de produtos naturais e apresentam uma variedade de atividades biológicas, tais como fungicida, bactericida, anti-inflamatória, citotóxica e reguladora de germinação de sementes. Essas atividades também são descritas para as γ-hidroxi- γ-lactamas e γ-alquilideno-γ-lactamas que estão presentes em vários produtos naturais biologicamente ativos. Visando contribuir com o estudo dessas classes de compostos, esse trabalho teve como objetivo sintetizar novas γ-alquilideno-γ- lactonas e seus correspondentes γ-hidroxi-γ-lactamas e γ-alquilideno-γ-lactamas, além de avaliar suas atividades citotóxica e inibitória da formação de biofilmes bacterianos. Na rota sintética escolhida, o ácido mucoclórico, utilizado como material de partida, foi inicialmente reduzido a 3,4-diclorofuran-2(5H)-ona e posteriormente reagiu com diferentes aldeídos aromáticos por meio da reação de alquilidenação, resultando no preparo de oito diferentes γ-alquilideno-γ-lactonas. Três desses análogos foram convertidos nas γ-hidroxi-γ-lactamas correspondentes pela reação de conversão lactona-lactama com isobutilamina e propilamina, e a subsequente desidratação das γ-hidroxi-γ-lactamas resultou na formação das (Z) e (E)-γ- alquilideno-γ-lactamas. Todos os compostos sintetizados foram caracterizados por espectroscopia no IV, espectroscopia de RMN de H e de 13 C, técnicas bidimensionais COSY e HETCOR e espectrometria de massas, além de experimentos de NOEDIF para determinar a estereoquímica da ligação dupla das unidades γ-alquilideno-γ-lactamas. O ensaio de citotoxicidade foi realizado com as linhagens celulares de câncer humano OVCAR-8, SF-295, HCT-116 e HL-60. Os resultados mostraram que as γ-lactonas são mais ativas do que as γ-lactamas. Os melhores efeitos citotóxicos observados estão relacionados a lactona (5Z)-3,4- dicloro-5-(4-bromobenzilideno)furan-2(5H)-ona (21), que apresentou significativa atividade contra as quatro linhagens celulares de câncer humano testadas. Em particular, a lactona 21 apresentou CR 50 = 0,66 μg/mL contra HL-60. No ensaio de inibição da formação de biofilme bacteriano de Streptococcus mutans, o melhor resultado foi observado para a lactona (5Z)-3,4-dicloro-5-(4- trifluorometilbenzilideno)furan-2(5H)-ona (26) que apresentado IC 50 equivalente a 0,21 ± 0,05 μg/mL. / The butenolides, γ-unsaturated lactones, are present in the structure of many natural products, and exhibit a variety of biological activities, such as fungicide, bactericide, anti-inflammatory, cytotoxicity and regulation of seed germination. These activities are also described for γ-hydroxy-γ-lactams and γ-alkylidene-γ-lactams which are present in many biologically active natural products. To contribute to the study of these classes of compounds, this study aimed to synthesize new γ-alkylidene-γ- lactones and their corresponding γ-hydroxy-γ-lactams and γ-alkylidene-γ-lactams and to evaluate their cytotoxicity and formation of bacterial biofilms inhibition. In the chosen synthetic route, the mucochloric acid was inittially reduced to 3,4- diclorofuran-2(5H)-one which subsequently reacted with various aromatic aldehydes through the reaction of aldol condensation, resulting in the preparation of eight different γ-alkylidene-γ-lactones. Three of these analogs were converted to the corresponding by γ-hydroxy-γ-lactams lactamization with isobutylamine and propylamine. Further dehydration of γ-hydroxy-γ-lactams resulted in the formation of (Z) and (E)-γ-alkylidene-γ-lactams. characterized by IR spectroscopy, All H and the synthesized compounds were 13 C NMR spectroscopy, COSY and HETCOR bidimensional techniques and mass spectrometry. NOEDIF experiments to determine the geometry of the double bond of the γ-alkylidene-γ-lactam units. The cytotoxicity assay was performed with OVCAR-8, SF-295, HCT-116 and HL-60 cancer cell lines. The results showed that the γ-lactones are more active than the γ- lactams. The best effects were associated with lactone (5Z)-3,4-dichloro-5-(4- bromobenzilidene)furan-2(5H)-one (21) which was active against all tested cell lines. Particularly, the compound 21 presented CR 50 = 0.66 μg/mL against HL-60. In the inhibition assay of bacterial biofilm formation of Streptococcus mutans, the compounds did not show good activity. Exception to this generalization is the lactone (5Z)-3,4-dichloro-5-(4-trifluoromethylbenzylidene)furan-2(5H)-one (26) which presented IC 50 = 0,21 ± 0,05 μg/mL.