Neste trabalho estudamos por espalhamento de raios-X a baixos ângulos (SAXS) quatro diferentes sistemas de interesse biológico. Visamos investigar a auto-agregação de proteínas e de complexos proteicos que darão origem a fibras amilóides, interação proteína-proteína, simulando ambientes altamente concentrados, interação proteína-membrana simulando vesículas de matriz extracelular (MVs) de sistemas de biomineralização e interações proteína-agentes desnaturantes. No caso de formação de amilóides, investigamos a agregação do domínio GTPase da septina 6 (SEPT6G) e do complexo formado com o domínio GTPase da septina 2 (SEPT2G-SEPT6G). A temperaturas de até 15°C, tanto SEPT6G quanto SEPT2G-SEPT6G apresentam-se predominantemente diméricas em solução. Já a 25°C, o heterodímero SEPT2G-SEPT6G permanece estável enquanto agregados maiores de SEPT6G evoluem e coexistem em solução com SEPT6G-SEPT6G dimérica, sendo que a proporção de dímeros diminui com a temperatura. No estudo das MVs, mostramos que miméticos lipossomais de DPPC e DPPC:DPPS (9:1) possuem as mesmas características estruturais na ausência e presença de cálcio na solução. A interação da proteína anexina V humana (A5), envolvida em processos de biomineralização, impacta na membrana modelo induzindo a formação de nanoporos. A adição da fosfatase alcalina tecido não-específico (TNAP) não altera as propriedades estruturais do proteolipossomo na presença de A5. A ação do surfactante dodecil sulfato de sódio (SDS) a 30 mM não altera a conformação da albumina soro bovina (BSA), de maneira que é observada a formação de micelas de SDS coexistindo com a proteína livre em solução. Já a adição de 50 mM de SDS induz um desenovelamento parcial da proteína, identificado pela análise das curvas de SAXS via modelo de \"colar de pérolas\". A ação de uréia a 3 M e 8 M promove um desenovelamento parcial e total da BSA, respectivamente, com subsequente agregação de proteína dependente da temperatura (T > 30°C). A adição de 6 mM de SDS em proteínas parcialmente desenoveladas pela ação da uréia promove um desenovelamento mais acentuado. O potencial efetivo resultante da interação entre duas proteínas distintas, BSA e lisozima a concentração total de 100 mg/mL em solução, pH 7.0, foi obtido da análise de curvas de SAXS. Para isto, utilizou-se uma análise simplificada (em primeira aproximação) considerando um potencial efetivo de interação entre BSA-BSA, lisozima-lisozima e lisozima-BSA. Variamos a razão molar BSA:LISO até 1:42. No pH estudado, BSA tem uma carga residual superficial de -11e, enquanto a lisozima possui +9e. Conforme variamos a razão molar BSA:LISO, observamos dois regimes para o potencial efetivo resultante: i) até BSA:LISO 1:2, a carga efetiva do sistema é praticamente nula com um potencial resultante de caráter atrativo e ii) para razões entre BSA:LISO 1:3 a 1:42, a carga efetiva aumenta e o potencial resultante tem caráter repulsivo. Assim, lisozima e BSA coexistem sem agregar, através de um delicado balanço de forças atrativas e repulsivas no sistema. / In this work we have used small-angle x-ray scattering (SAXS) to study four systems of biological interest. We aim to investigate the self aggregation of proteins and protein complexes that would form amyloid fibers; protein/protein interaction, simulating high concentrations; protein/cell-membrane interaction, simulating extracellular matrix vesicles (MVs) from biomineralizing systems; and protein/denaturating-agents interactions. On the case of amyloid formation, we have investigated the aggregation of G-domain of septin-6 (SEPT6G) and the protein complex formed with G-domain of septin-2 (SEPT2G-SEPT6G). At temperatures lower than 15°C, both SEPT6G and SEPT2G-SEPT6G were found predominantly as dimers. At 25°C, SEPT2G-SEPT6G heterodimer is still stable while aggregates of SEPT6G grow. Both coexist in solutions of SEPT2G-SEPT6G dimers, with the percentage of dimers decreasing the higher the temperature. As for the study of MVs, we have shown that DPPC and DPPC:DPPS (9:1) liposomal mimetics have the same structural characteristics at the absence or presence of Calcium. The interaction with human annexin V protein (A5), related to biomineralization processes, affects the model membrane by the creation of nanopores. The addition of tissue-nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) does not change the structural properties of the proteoliposome when A5 is present. The addition of SDS surfactant (30 mM) does not alters the conformation of bovine serum albumin (BSA), and we have observed the formation of SDS micelles coexisting with free protein in solution. The addition of 50 mM of SDS, on the other hand, induces the partial unraveling of the protein, as seen by the analysis of SAXS data via the pearl necklace\'\' model. The effect of adding 3M and 8M urea is, respectively, the partial and total unraveling of BSA, with ensuing aggregation of the protein dependent on the temperature (T > 30°C). The introduction of SDS 6mM promotes further unraveling in proteins that were previously partially unraveled by urea. The resulting effective potential for the interaction between BSA and lysozyme at total concentration of 100mg/ml and 7.0 pH has been obtained from the analysis of SAXS curves. In order to obtain this result we have used a simplified analysis (first order approximation) in which were considered the effective potentials for the interactions between BSA-BSA, lysozyme-lysozyme and lysozyme-BSA. We have varied the BSA:LISO molar ratio up to 1:42. At the studied pH, BSA has a surface residual charge of -11e, and lysozyme has +9e. As we changed the BSA:LISO molar ratio, we have found two regimens for the resulting effective potential: i) up to BSA:LISO 1:2, the effective charge of the system is virtually zero and the resulting potential is attractive; and ii) for BSA:LISO between 1:3 and 1:42 the effective charge increases, and the resulting potential is repulsive. Therefore, both lysozyme and BSA coexist without forming aggregates, by a delicate balance of attractive and repulsive forces.

Neste trabalho estudamos por espalhamento de raios-X a baixos ângulos (SAXS) quatro diferentes sistemas de interesse biológico. Visamos investigar a auto-agregação de proteínas e de complexos proteicos que darão origem a fibras amilóides, interação proteína-proteína, simulando ambientes altamente concentrados, interação proteína-membrana simulando vesículas de matriz extracelular (MVs) de sistemas de biomineralização e interações proteína-agentes desnaturantes. No caso de formação de amilóides, investigamos a agregação do domínio GTPase da septina 6 (SEPT6G) e do complexo formado com o domínio GTPase da septina 2 (SEPT2G-SEPT6G). A temperaturas de até 15°C, tanto SEPT6G quanto SEPT2G-SEPT6G apresentam-se predominantemente diméricas em solução. Já a 25°C, o heterodímero SEPT2G-SEPT6G permanece estável enquanto agregados maiores de SEPT6G evoluem e coexistem em solução com SEPT6G-SEPT6G dimérica, sendo que a proporção de dímeros diminui com a temperatura. No estudo das MVs, mostramos que miméticos lipossomais de DPPC e DPPC:DPPS (9:1) possuem as mesmas características estruturais na ausência e presença de cálcio na solução. A interação da proteína anexina V humana (A5), envolvida em processos de biomineralização, impacta na membrana modelo induzindo a formação de nanoporos. A adição da fosfatase alcalina tecido não-específico (TNAP) não altera as propriedades estruturais do proteolipossomo na presença de A5. A ação do surfactante dodecil sulfato de sódio (SDS) a 30 mM não altera a conformação da albumina soro bovina (BSA), de maneira que é observada a formação de micelas de SDS coexistindo com a proteína livre em solução. Já a adição de 50 mM de SDS induz um desenovelamento parcial da proteína, identificado pela análise das curvas de SAXS via modelo de \"colar de pérolas\". A ação de uréia a 3 M e 8 M promove um desenovelamento parcial e total da BSA, respectivamente, com subsequente agregação de proteína dependente da temperatura (T > 30°C). A adição de 6 mM de SDS em proteínas parcialmente desenoveladas pela ação da uréia promove um desenovelamento mais acentuado. O potencial efetivo resultante da interação entre duas proteínas distintas, BSA e lisozima a concentração total de 100 mg/mL em solução, pH 7.0, foi obtido da análise de curvas de SAXS. Para isto, utilizou-se uma análise simplificada (em primeira aproximação) considerando um potencial efetivo de interação entre BSA-BSA, lisozima-lisozima e lisozima-BSA. Variamos a razão molar BSA:LISO até 1:42. No pH estudado, BSA tem uma carga residual superficial de -11e, enquanto a lisozima possui +9e. Conforme variamos a razão molar BSA:LISO, observamos dois regimes para o potencial efetivo resultante: i) até BSA:LISO 1:2, a carga efetiva do sistema é praticamente nula com um potencial resultante de caráter atrativo e ii) para razões entre BSA:LISO 1:3 a 1:42, a carga efetiva aumenta e o potencial resultante tem caráter repulsivo. Assim, lisozima e BSA coexistem sem agregar, através de um delicado balanço de forças atrativas e repulsivas no sistema. / In this work we have used small-angle x-ray scattering (SAXS) to study four systems of biological interest. We aim to investigate the self aggregation of proteins and protein complexes that would form amyloid fibers; protein/protein interaction, simulating high concentrations; protein/cell-membrane interaction, simulating extracellular matrix vesicles (MVs) from biomineralizing systems; and protein/denaturating-agents interactions. On the case of amyloid formation, we have investigated the aggregation of G-domain of septin-6 (SEPT6G) and the protein complex formed with G-domain of septin-2 (SEPT2G-SEPT6G). At temperatures lower than 15°C, both SEPT6G and SEPT2G-SEPT6G were found predominantly as dimers. At 25°C, SEPT2G-SEPT6G heterodimer is still stable while aggregates of SEPT6G grow. Both coexist in solutions of SEPT2G-SEPT6G dimers, with the percentage of dimers decreasing the higher the temperature. As for the study of MVs, we have shown that DPPC and DPPC:DPPS (9:1) liposomal mimetics have the same structural characteristics at the absence or presence of Calcium. The interaction with human annexin V protein (A5), related to biomineralization processes, affects the model membrane by the creation of nanopores. The addition of tissue-nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) does not change the structural properties of the proteoliposome when A5 is present. The addition of SDS surfactant (30 mM) does not alters the conformation of bovine serum albumin (BSA), and we have observed the formation of SDS micelles coexisting with free protein in solution. The addition of 50 mM of SDS, on the other hand, induces the partial unraveling of the protein, as seen by the analysis of SAXS data via the pearl necklace\'\' model. The effect of adding 3M and 8M urea is, respectively, the partial and total unraveling of BSA, with ensuing aggregation of the protein dependent on the temperature (T > 30°C). The introduction of SDS 6mM promotes further unraveling in proteins that were previously partially unraveled by urea. The resulting effective potential for the interaction between BSA and lysozyme at total concentration of 100mg/ml and 7.0 pH has been obtained from the analysis of SAXS curves. In order to obtain this result we have used a simplified analysis (first order approximation) in which were considered the effective potentials for the interactions between BSA-BSA, lysozyme-lysozyme and lysozyme-BSA. We have varied the BSA:LISO molar ratio up to 1:42. At the studied pH, BSA has a surface residual charge of -11e, and lysozyme has +9e. As we changed the BSA:LISO molar ratio, we have found two regimens for the resulting effective potential: i) up to BSA:LISO 1:2, the effective charge of the system is virtually zero and the resulting potential is attractive; and ii) for BSA:LISO between 1:3 and 1:42 the effective charge increases, and the resulting potential is repulsive. Therefore, both lysozyme and BSA coexist without forming aggregates, by a delicate balance of attractive and repulsive forces.

A persistência bacteriana correlacionada à formação de biofilmes bacterianos é, há algum tempo, fonte de grande preocupação médica em virtude de sua ampla associação com a dificuldade de tratamento de infecções crônicas. Por outro lado, as perspectivas de utilização de biofilmes bacterianos em novas aplicações biotecnológicas e até mesmo para fins terapêuticos são promissoras. Há, portanto, grande interesse em compreender os mecanismos que levam as células bacterianas a deixar o estado planctônico, de vida livre, e associarem-se nesses conglomerados celulares altamente complexos. Ao longo das últimas décadas, o segundo mensageiro c-di-GMP – em conjunto com as moléculas que catalisam sua síntese (diguanilato ciclases) e sua degradação (fosfodiesterases) e seus receptores – estabeleceu-se como um elemento central de regulação de uma série de respostas celulares que determinam a formação ou a dispersão de biofilmes. Curiosamente, as proteínas que participam do metabolismo deste segundo mensageiro estão, frequentemente, codificadas múltiplas vezes em um mesmo genoma bacteriano. Em vista dessa observação, estudos mais recentes apontam que, para reger paralelamente uma variedade tão ampla de fenótipos, este sistema opera em modo de alta especificidade de sinalização e que, portanto, o sinal metabolizado por determinados conjuntos de diguanilato ciclases e fosfodiesterases tem alvos celulares específicos. Evidências robustas, porém isoladas até o momento, apontaram que um dos meios pelo qual ocorre a segregação entre sinal produzido e alvo específico é a interação direta entre as proteínas componentes das vias de sinalização. Mais, demonstrou-se que, em algumas vias, a transmissão de sinal ocorre exclusivamente via interação proteica, dispensando a intermediação do sinalizador em si. Para avaliar a validade e relevância global deste mecanismo, propôs-se, neste estudo, a investigação da rede total de interações entre as proteínas tipicamente associadas às vias de sinalização por c-di-GMP em Pseudomonas aeruginosa, utilizando ensaios de duplo-hibrido bacteriano. Para tanto, foram construídas duas bibliotecas de DNA direcionadas e foram feitos testes de interação de forma estratégica para possibilitar o esgotamento e averiguação de todas as possíveis interações entre as proteínas alvo identificadas. O resultado obtido, um mapa inicial, porém abrangente, da rede de interações proteicas em P. aeruginosa, indica uma grande probabilidade de que os mecanismos previamente descritos sejam realmente recorrentes e relevantes para o intermédio da sinalização nesse organismo. Algumas das interações mais robustas encontradas são bastante interessantes e serão, em estudos futuros, mais extensivamente estudadas. / Persister bacteria are correlated to biofilm formation and have been a source of great medical concern due to its close association with the impairment of traditional treatment in combating chronic infections. On the other hand, using bacterial biofilms to create original biotechnological applications or even as a means of therapeutic treatment in medical settings constitutes a promising prospect. There is, therefore, a great interest in understanding the mechanisms that allow bacteria to leave the free-living planktonic lifestyle and associate in these highly complex cellular aggregates. Over the last decades, the second messenger c-di-GMP – and also the molecules involved in its synthesis (diguanylate ciclases) and degradation (phosphodiesterases) along with its receptors – has been established as a key element implicated in regulation of a series of cellular responses that determine biofilm formation or dispersion. Curiously, the proteins that play a part in the metabolism of this second messenger are frequently coded multiple times in single bacterial genomes. Taking this into account, recent studies indicate that, in order to control such a wide range of phenotypes, this system operates via high specificity of signaling – which means that the signal metabolized by a certain set of diguanylate ciclases and phosphodiesterases has specific cellular targets. Robust but yet isolated evidence indicate that a means by which a signal is segregated with its correlated phenotypic response is through direct protein-protein interaction involving the components of these signaling pathways. Even more, there has been strikingly evidence that, in some of these pathways, signal transduction occurs exclusively through protein-protein interaction, entirely dismissing any mediation by the signal molecule. In order to validate and evaluate the global relevance of this type of mechanism, this study proposed the investigation of the entire network of interactions between proteins typically associated with c-di-GMP signaling pathways of Pseudomonas aeruginosa by employing bacterial two-hybrid system assays. To make that possible, two DNA libraries were constructed and interaction essays were performed in a strategic way so that all possibilities of interaction between target proteins were explored. The results obtained from these experiments allowed the construction of a broad map of interactions that, although still primitive, indicates that, chances are, the mechanisms previously described are both recurrent and relevant to signaling regulation in this organism. Some of the interaction partners found are particularly interesting and will be further investigated in future studies.

A persistência bacteriana correlacionada à formação de biofilmes bacterianos é, há algum tempo, fonte de grande preocupação médica em virtude de sua ampla associação com a dificuldade de tratamento de infecções crônicas. Por outro lado, as perspectivas de utilização de biofilmes bacterianos em novas aplicações biotecnológicas e até mesmo para fins terapêuticos são promissoras. Há, portanto, grande interesse em compreender os mecanismos que levam as células bacterianas a deixar o estado planctônico, de vida livre, e associarem-se nesses conglomerados celulares altamente complexos. Ao longo das últimas décadas, o segundo mensageiro c-di-GMP – em conjunto com as moléculas que catalisam sua síntese (diguanilato ciclases) e sua degradação (fosfodiesterases) e seus receptores – estabeleceu-se como um elemento central de regulação de uma série de respostas celulares que determinam a formação ou a dispersão de biofilmes. Curiosamente, as proteínas que participam do metabolismo deste segundo mensageiro estão, frequentemente, codificadas múltiplas vezes em um mesmo genoma bacteriano. Em vista dessa observação, estudos mais recentes apontam que, para reger paralelamente uma variedade tão ampla de fenótipos, este sistema opera em modo de alta especificidade de sinalização e que, portanto, o sinal metabolizado por determinados conjuntos de diguanilato ciclases e fosfodiesterases tem alvos celulares específicos. Evidências robustas, porém isoladas até o momento, apontaram que um dos meios pelo qual ocorre a segregação entre sinal produzido e alvo específico é a interação direta entre as proteínas componentes das vias de sinalização. Mais, demonstrou-se que, em algumas vias, a transmissão de sinal ocorre exclusivamente via interação proteica, dispensando a intermediação do sinalizador em si. Para avaliar a validade e relevância global deste mecanismo, propôs-se, neste estudo, a investigação da rede total de interações entre as proteínas tipicamente associadas às vias de sinalização por c-di-GMP em Pseudomonas aeruginosa, utilizando ensaios de duplo-hibrido bacteriano. Para tanto, foram construídas duas bibliotecas de DNA direcionadas e foram feitos testes de interação de forma estratégica para possibilitar o esgotamento e averiguação de todas as possíveis interações entre as proteínas alvo identificadas. O resultado obtido, um mapa inicial, porém abrangente, da rede de interações proteicas em P. aeruginosa, indica uma grande probabilidade de que os mecanismos previamente descritos sejam realmente recorrentes e relevantes para o intermédio da sinalização nesse organismo. Algumas das interações mais robustas encontradas são bastante interessantes e serão, em estudos futuros, mais extensivamente estudadas. / Persister bacteria are correlated to biofilm formation and have been a source of great medical concern due to its close association with the impairment of traditional treatment in combating chronic infections. On the other hand, using bacterial biofilms to create original biotechnological applications or even as a means of therapeutic treatment in medical settings constitutes a promising prospect. There is, therefore, a great interest in understanding the mechanisms that allow bacteria to leave the free-living planktonic lifestyle and associate in these highly complex cellular aggregates. Over the last decades, the second messenger c-di-GMP – and also the molecules involved in its synthesis (diguanylate ciclases) and degradation (phosphodiesterases) along with its receptors – has been established as a key element implicated in regulation of a series of cellular responses that determine biofilm formation or dispersion. Curiously, the proteins that play a part in the metabolism of this second messenger are frequently coded multiple times in single bacterial genomes. Taking this into account, recent studies indicate that, in order to control such a wide range of phenotypes, this system operates via high specificity of signaling – which means that the signal metabolized by a certain set of diguanylate ciclases and phosphodiesterases has specific cellular targets. Robust but yet isolated evidence indicate that a means by which a signal is segregated with its correlated phenotypic response is through direct protein-protein interaction involving the components of these signaling pathways. Even more, there has been strikingly evidence that, in some of these pathways, signal transduction occurs exclusively through protein-protein interaction, entirely dismissing any mediation by the signal molecule. In order to validate and evaluate the global relevance of this type of mechanism, this study proposed the investigation of the entire network of interactions between proteins typically associated with c-di-GMP signaling pathways of Pseudomonas aeruginosa by employing bacterial two-hybrid system assays. To make that possible, two DNA libraries were constructed and interaction essays were performed in a strategic way so that all possibilities of interaction between target proteins were explored. The results obtained from these experiments allowed the construction of a broad map of interactions that, although still primitive, indicates that, chances are, the mechanisms previously described are both recurrent and relevant to signaling regulation in this organism. Some of the interaction partners found are particularly interesting and will be further investigated in future studies.

Made available in DSpace on 2016-05-19T13:08:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 199.pdf: 2457764 bytes, checksum: f3219878be3144c523ae28e85c474b10 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / Os tripanossomatídeos são caracterizados por processos moleculares diferenciados como a transcrição policistrônica e regulação pós-transcricional da expressão gênica. Em mamíferos, a tradução se inicia com a ligação do complexo eIF4F (formado pelos eIF4A, eIF4E e eIF4G) a extremidade 5' dos mRNAs, o que facilita seu reconhecimento pelo ribossomo. A atividade do eIF4F é reforçada pela proteína de ligação a cauda poli-A (PABP), na extremidade 3' dos mRNAs, que interage com o eIF4G. Dois complexos do tipo eIF4F foram identificados em tripanossomatídeos: o primeiro formado pelos EIF4G3, EIF4E4 e EIF4AI com a PABP1; e um outro baseado na interação do EIF4G4 com o EIF4E3 e o EIF4A1. Este trabalho buscou caracterizar as interações entre as subunidades destes complexos e sua associação com PABPs de Leishmania, avaliando o efeito de mutações em motivos específicos. Proteínas recombinantes foram geradas fusionadas a GST e avaliadas quanto a sua habilidade de interagir com parceiros marcados radioativamente em ensaios do tipo pull-down. Para o EIF4G3, mutações individuais em dois resíduos vizinhos (I8A e R9A), afetaram a interação com o EIF4E4 e a mutação de ambos os resíduos equivalentes do EIF4G4 (IL25-26AA) também impediu sua ligação ao EIF4E3, sugerindo um motivo comum para a ligação aos seus parceiros. As proteínas EIF4E3 e EIF4E4 foram avaliadas quanto à capacidade de interagir com a PABP2 e PABP1 respectivamente, e mutações em motivos conservados nas regiões N-terminais dos EIF4E (Boxes A, B e C) aboliram sua interação com os homólogos da PABP. Para identificar que regiões da PABP1 estão relacionadas às interações com o parceiro EIF4E4, foram obtidas proteínas PABP1 mutantes em motivos conservados e observou-se que a mutação no motivo TGM, C-terminal, aboliu sua interação com o EIF4E4. Com estas abordagens conseguiu-se avançar na definição das interações entre as referidas subunidades do eIF4F e PABP, identificando-se diferenças relevantes em relação a outros eucariotos