O complexo distrofina-glicoproteínas associadas (DGC) localiza-se no sarcolema das células musculares esqueléticas e cardíacas e tem como função principal proporcionar ligação mecânica entre o citoesqueleto intracelular e a matriz extracelular. Estudos prévios realizados em nosso laboratório, focalizando o complexo DGC, demonstraram perda de proteínas importantes desse complexo. As situações avaliadas anteriormente foram: infecção experimental por Trypanosoma cruzi (T. cruzi) e sépsis experimental. Em ambas as situações verificou-se a perda da distrofina acompanhada por disfunção contrátil e aumento nos níveis da calpaína, protease dependente de cálcio implicada na proteólise da distrofina. Todavia, o mecanismo responsável pela ativação das calpaínas e proteólise da distrofina na infecção experimental por T. cruzi e na sépsis experimental não está totalmente definido. O objetivo desse trabalho foi avaliar in vitro o mecanismo responsável pela ativação das calpaínas nas culturas de cardiomiócitos desafiadas com o soro dos animais infectados experimentalmente com T. cruzi ou com o soro dos animais submetidos à sépsis grave experimental. Camundongos C57BL/6 foram submetidos à sépsis grave ou infectados com a cepa Y de T. cruzi. No pico de expressão das citocinas pró-inflamatórias, 12 dias após inoculação do parasito ou 6 horas após a indução da sépsis, o sangue foi coletado e o soro separado. Corações de camundongos recém-nascidos foram isolados para o cultivo dos cardiomiócitos. No quinto dia após o início das culturas, as células foram estimuladas com 10% do soro de animais infectados com T. cruzi ou o soro de animais submetidos à sépsis grave durante 24 horas. Após, as células foram coletadas para análises de Western blotting e imunofluorescência para verificar a expressão da distrofina e calpaína-1. Avaliou-se também, por imunofluorescência, a expressão do NF-B. Os cardiomiócitos foram estimulados e tratados com o dantrolene, inibidor da liberação de cálcio do retículo sarcoplasmático, ou ALLN, inibidor da calpaína-1, e após coletados para verificar a expressão da distrofina e calpaína-1 por Western blotting e imunofluorescência. Nossos resultados mostraram uma redução significativa na expressão da distrofina com desarranjo das miofibrilas contráteis e formação de bolhas citoplasmáticas, além de um aumento nos níveis da calpaína-1 e do NF-B. O tratamento com dantrolene nas culturas estimuladas com o soro de animais infectados experimentalmente com T. cruzi ou com o soro dos animais submetidos à sépsis grave, recuperou a expressão da distrofina e reduziu os níveis da calpaína-1. O tratamento com ALLN nos cardiomiócitos estimulados com o soro de animais infectados experimentalmente com T. cruzi recuperou a expressão da distrofina e não alterou os níveis da calpaína-1. Nas culturas estimuladas com o soro dos animais submetidos à sépsis grave, o tratamento com o ALLN recuperou a expressão da distrofina e reduziu os níveis da calpaína-1. Nossos resultados demonstraram que citocinas pró-inflamatórias presentes no soro dos animais infectados experimentalmente com T. cruzi como também no soro dos animais submetidos à sépsis grave induziriam um aumento no influxo de cálcio com consequente ativação das calpaínas, as quais atuariam na ativação do NF-B e na degradação da distrofina. Esse mecanismo poderia ser responsável pela proteólise da distrofina cardíaca observada na infecção experimental por Trypanosoma cruzi como também sépsis experimental. Mais estudos são necessários para elucidar este mecanismo, principalmente em relação a inibidores dos canais de cálcio, das citocinas pró-inflamatórias e das calpaínas, com o objetivo de fornecer novas vias de intervenção na prevenção de alterações cardíacas observadas na doença de Chagas e na sépsis. / The dystrophin-glycoprotein complex (DGC), located in the sarcolemma of cardiac and skeletal muscle cells and concentrated along the plasma membrane in costameric structures provides a framework that connects the intracellular cytoskeleton to the extracellular matrix. Previous studies from our laboratory clearly demonstrated disruption of DGC proteins in experimentally-induced T. cruzi infection and experimental sepsis. Both situation presented dystrophin disruption associated with contractile dysfunction and increased calpain levels, calcium dependent protease responsible for dystrophin proteolysis. However, the mechanism responsible for calpain activation and dystrophin proteolysis in experimentally-induced T. cruzi infection and experimental sepsis is not totally understood. The aim of this study was to evaluate in vitro the mechanism responsible for calpain activation in cultured cardiomyocytes challenged with serum from animals experimentally infected with T. cruzi or subjected to severe sepsis. Mice C57BL/6 were subjected to sepsis induction or infected with Y strain from T. cruzi. At the peak of proinflammatory cytokines expression, 12 days after parasite inoculation or 6 hours after sepsis induction, the blood was collected and the serum separated. Hearts from newborn mice were isolated for culture of cardiomyocytes. After 5 days of incubation, the cardiac cells were stimulated with 10% of serum from animals experimentally infected with T. cruzi or subjected to severe sepsis during 24 hours, and collected for Western blotting and immunofluorescence analysis to verify dystrophin and calpain-1 expression. The expression of NF-B was evaluated by immunofluorescence. The treatments with dantrolene, inhibitor of calcium release from sarcoplasmic reticulum, or ALLN, calpain-1 inhibitor, were performed in cultured cardiomyocytes stimulated during 24 hours with serum from animals infected with T. cruzi or subjected to severe sepsis, and dystrophin and calpain-1 expression were analyzed by Western blotting and immunofluorescence. Our results demonstrated loss of dystrophin associated with myofibers derangement and presence of cytoplasmic blebs as well increase of calpain-1 and NF-B expression. The dantrolene treatment in cultures stimulated with serum from animals infected with T. cruzi or subjected to severe sepsis recovey dystrophin expression and reduced calpain-1 levels. The ALLN treatment in cardiomyocytes stimulated with serum from animals infected with T. cruzi recovery dystrophin expression and preserved calpain-1 levels. In cultures stimulated with serum from animals subjected to severe sepsis, the ALLN treatment recovery dystrophin expression and decreased calpain-1 levels. Our results demonstrated that proinflammatory cytokines in serum from mice infected with T. cruzi or subjected to severe sepsis could induce an increase calcium influx with calpain activation, which could act in NF-B activation and dystrophin disruption. Possibly, this mechanism could be responsible to dystrophin proteolysis observed in experimentally-induced acute T. cruzi infection and experimental sepsis. More studies are needed to elucidate this mechanism, especially in relation to calcium channel blockers and inhibitors of pro-inflammatory cytokines and calpains, which may provide new routes for intervention to prevent cardiac damage in Chagas disease and sepsis.

A sépsis e o choque séptico representam uma síndrome complexa de intensa resposta inflamatória sistêmica, com múltiplas anormalidades fisiológicas e imunológicas, comumente causadas por infecção bacteriana. A principal conseqüência dessa resposta é o comprometimento de muitos órgãos e tecidos. A disfunção cardíaca, decorrente de um prejuízo na contratilidade miocárdica, tem sido reconhecida como um fator importante que contribui para os altos índices de mortalidade observados na sépsis. Dados recentes do nosso laboratório indicam que alterações estruturais no miocárdio podem ser responsáveis pela disfunção cardíaca observada na sépsis. Considerando que a maquinaria contrátil interna das miofibras deve permanecer intimamente conectada com a membrana e a matriz extracelular, o presente estudo foi proposto para avaliar alterações nas comunicações intercelulares e acoplagem mecânica entre os cardiomiócitos vizinhos e avaliar a expressão de proteínas do arcabouço celular e da matriz extracelular (especificamente a laminina-?2) durante a sépsis grave. Nossos resultados mostraram que há uma diminuição na expressão das proteínas envolvidas na formação das gap junctions (conexina43) e junções aderentes (N-caderina), o que resultaria na perda da integridade estrutural dos discos intercalares, alterando o acoplamento mecânico e eletro-químico entre os cardiomiócitos vizinhos. Além disso, demonstramos que há redução na expressão de distrofina e das proteínas que constituem o complexo de glicoproteínas associadas a distrofina (CGD) durante a sépsis experimental. A redução ou perda da expressão de distrofina é o evento primário que ocorre seguido pela degeneração miofilamentar, caracterizada pela lise dos filamentos de actina e miosina. A diminuição na expressão das glicoproteínas associadas à distrofina: -distroglicana e laminina foram considerados eventos secundários. Os resultados sugerem que durante a sépsis induzida por ligação e perfuração do ceco (CLP), há perda de proteínas importantes envolvidas tanto no remodelamento do disco intercalar quanto na expressão de glicoproteínas envolvidas na ligação mecânica entre o citoesqueleto intracelular e a matriz extracelular. Embora estudos funcionais sejam necessários para determinar o efeito direto dessas alterações sobre o miocárdio podemos sugerir que as alterações estruturais são parcialmente responsáveis pela depressão miocárdica observada na sépsis. / Sepsis and septic shock represent a complex syndrome of systemic inflammatory response, with multiple physiological and immunological abnormalities, commonly caused by bacterial infection. The most important consequence of the response is the involvement of many organs and tissues. Cardiac dysfunction, caused by impairment in myocardial contractility, has been recognized as an important factor that contributes to the high mortality observed in sepsis. Evidence from our laboratory indicates that myocardial structural changes could be responsible for sepsis-induced myocardial dysfunction. Taking into account that the contractile machinery inside the myofibers must remain intimately connected with the membrane and extracellular matrix, the present investigation sought to evaluate changes in intercellular communications and mechanical coupling between the neighbor cardiomyocytes and the expression of the cell scaffold protein and extracellular matrix (specifically merosin laminin-2 chain) during the severe sepsis. Our results showed a decrease in the expression of proteins involved in formation of gap junctions (connexin-43) and adherens junctions (N-cadherin). These alterations may result in the loss of intercalated disc structural integrity, changing the mechanical and electrical-chemical coupling between neighboring cardiomyocytes. Additionally, we demonstrated the decrease of dystrophin and dystrophin-glycoprotein complex (DGC) components resulting from severe septic injury. The reduction or loss of dystrophin is the primary event that occurs followed by miofilamentar degeneration characterized by actin and myosin lysis. The decrease of glycoproteins associated with dystrophin: -dystroglican and laminin were considered secondary events. The results suggest that during experimental severe sepsis induced by cecal ligation and puncture (CLP), there is loss of important proteins involved in both the remodeling of the intercalated disc and the glycoproteins expression implicated in the mechanical link between the intracellular cytoskeleton and extracellular matrix. Although the functional studies are needed to determine the direct effect of these alterations on myocardium, we can suggest that myocardial structural changes may be partly responsible for sepsis-induced cardiac depression.

A sépsis e o choque séptico representam uma síndrome complexa de intensa resposta inflamatória sistêmica, com múltiplas anormalidades fisiológicas e imunológicas, comumente causadas por infecção bacteriana. A principal conseqüência dessa resposta é o comprometimento de muitos órgãos e tecidos. A disfunção cardíaca, decorrente de um prejuízo na contratilidade miocárdica, tem sido reconhecida como um fator importante que contribui para os altos índices de mortalidade observados na sépsis. Dados recentes do nosso laboratório indicam que alterações estruturais no miocárdio podem ser responsáveis pela disfunção cardíaca observada na sépsis. Considerando que a maquinaria contrátil interna das miofibras deve permanecer intimamente conectada com a membrana e a matriz extracelular, o presente estudo foi proposto para avaliar alterações nas comunicações intercelulares e acoplagem mecânica entre os cardiomiócitos vizinhos e avaliar a expressão de proteínas do arcabouço celular e da matriz extracelular (especificamente a laminina-?2) durante a sépsis grave. Nossos resultados mostraram que há uma diminuição na expressão das proteínas envolvidas na formação das gap junctions (conexina43) e junções aderentes (N-caderina), o que resultaria na perda da integridade estrutural dos discos intercalares, alterando o acoplamento mecânico e eletro-químico entre os cardiomiócitos vizinhos. Além disso, demonstramos que há redução na expressão de distrofina e das proteínas que constituem o complexo de glicoproteínas associadas a distrofina (CGD) durante a sépsis experimental. A redução ou perda da expressão de distrofina é o evento primário que ocorre seguido pela degeneração miofilamentar, caracterizada pela lise dos filamentos de actina e miosina. A diminuição na expressão das glicoproteínas associadas à distrofina: -distroglicana e laminina foram considerados eventos secundários. Os resultados sugerem que durante a sépsis induzida por ligação e perfuração do ceco (CLP), há perda de proteínas importantes envolvidas tanto no remodelamento do disco intercalar quanto na expressão de glicoproteínas envolvidas na ligação mecânica entre o citoesqueleto intracelular e a matriz extracelular. Embora estudos funcionais sejam necessários para determinar o efeito direto dessas alterações sobre o miocárdio podemos sugerir que as alterações estruturais são parcialmente responsáveis pela depressão miocárdica observada na sépsis. / Sepsis and septic shock represent a complex syndrome of systemic inflammatory response, with multiple physiological and immunological abnormalities, commonly caused by bacterial infection. The most important consequence of the response is the involvement of many organs and tissues. Cardiac dysfunction, caused by impairment in myocardial contractility, has been recognized as an important factor that contributes to the high mortality observed in sepsis. Evidence from our laboratory indicates that myocardial structural changes could be responsible for sepsis-induced myocardial dysfunction. Taking into account that the contractile machinery inside the myofibers must remain intimately connected with the membrane and extracellular matrix, the present investigation sought to evaluate changes in intercellular communications and mechanical coupling between the neighbor cardiomyocytes and the expression of the cell scaffold protein and extracellular matrix (specifically merosin laminin-2 chain) during the severe sepsis. Our results showed a decrease in the expression of proteins involved in formation of gap junctions (connexin-43) and adherens junctions (N-cadherin). These alterations may result in the loss of intercalated disc structural integrity, changing the mechanical and electrical-chemical coupling between neighboring cardiomyocytes. Additionally, we demonstrated the decrease of dystrophin and dystrophin-glycoprotein complex (DGC) components resulting from severe septic injury. The reduction or loss of dystrophin is the primary event that occurs followed by miofilamentar degeneration characterized by actin and myosin lysis. The decrease of glycoproteins associated with dystrophin: -dystroglican and laminin were considered secondary events. The results suggest that during experimental severe sepsis induced by cecal ligation and puncture (CLP), there is loss of important proteins involved in both the remodeling of the intercalated disc and the glycoproteins expression implicated in the mechanical link between the intracellular cytoskeleton and extracellular matrix. Although the functional studies are needed to determine the direct effect of these alterations on myocardium, we can suggest that myocardial structural changes may be partly responsible for sepsis-induced cardiac depression.