Les peptides vecteurs (CPP) présentent un grand intérêt pour l'internalisation de principes actifs dans les cellules. Les mécanismes permettant aux peptides de traverser la membrane restent sujets à discussion. Mieux comprendre leurs interactions avec la membrane pourrait permettre d'améliorer leur efficacité. L'organisation des lipides après interaction avec le peptide pénétratine a été étudiée par DSC et par fluorescence du Laurdan, sur des membranes modèles composées de lipides naturels. La pénétratine a induit de l'hétérogénéité dans la membrane, ce qui pourrait être un élément important pour déstabiliser la membrane durant son internalisation dans la cellule. En outre, le cholestérol est un régulateur parmi les plus importants des domaines membranaires. En raison de son affinité pour les lipides saturés, il peut former des domaines ordonnés. Grâce au cholestérol-pyrène, une sonde fluorescente, nous avons étudié les domaines liquides ordonnés (Lo) et désordonnés (Ld) de la membrane. Nous avons, par analyse statistique en composante principale, déterminé les longueurs d'onde d'émission caractéristiques des domaines Lo et Ld. Les peptides pénétratine, R9 et RW9 diminuent l'assemblage du cholestérol et RW9 augmente la fluidité de la membrane. RW9 a été le seul peptide capable de traverser des membranes (Ld) sur de vésicules lipidiques dans nos conditions expérimentales. Nous pouvons ainsi en déduire que la distribution des lipides dans la membrane est un factor important pour le passage des CPP. Notamment, l'interface entre les différents domaines semble jouer un rôle prépondérant pour l'internalisation. / Cell penetrating peptides are promising vectors for molecular drug delivery in eukaryotic cells. Despite of their discovery 20 years ago, the mechanisms of peptide membrane crossing are still controversial. Understanding then how they modify the membrane will allow later on a more efficient internalisation into the cell. Lipid organisation after penetratin interaction was studied by DSC and Laurdan fluorescence. Penetratin was able to induce membrane heterogeneity, which could be important for membrane destabilisation during cell internalisation. Furthermore, cholesterol is one of the most important regulators of membrane domains. Due to its strong affinity with saturated lipids, cholesterol presents the ability to form “rafts” (ordered domains). By cholesterol-pyrene, which is a probe that mimics cholesterol, we studied the liquid ordered (Lo) and liquid disordered (Ld) domains of the membrane. Firstly, we determined the wavelengths that characterise each of these domains by multivariable analysis and then, we verify the peptide effect (R9, RW9 and penetratin) in the distribution of these domains. RW9 were the only CPP able to cross the membrane (Ld). We can deduce that lipid distribution in the membrane is important for the peptide internalisation and the interfaces between these domains may play an important role during this process.

Les membranes modèles représentent un outil indispensable pour l'étude des membranes biologiques, elles ont en effet grandement contribué à leur description. Dans ce travail, nous nous sommes intéressés à l'étude de la coexistence de phases liquide-ordonnée (lo) et liquide-désordonnée (ld) au sein de membranes modèles de type LUV (« Large Unilamellar Vesicle »). Nous avons cherché en premier lieu à mettre au point une méthodologie permettant de détecter la formation de la phase lo et d'estimer quantitativement la fraction membranaire Φo en phase lo dans des LUVs de composition ternaire PC/SM/Chol (phosphatidylcholine / sphingomyéline / cholestérol), capable d'induire une coexistence de phase. Pour cela, les propriétés d'auto-extinction de fluorescence et de distribution sélective en fonction de la phase lipidique d'une sonde fluorescente unique (C12NBD-PC) ont été mises à profit. La deuxième partie de notre travail a été consacrée à l'étude de la solubilisation par le détergent Triton X-100 des membranes de LUVs présentant une coexistence de phase lo/ld. Nous avons cherché à démontrer qu'il était possible d'extraire la fraction membranaire se trouvant strictement en phase lo. Pour cela, les transitions de structure induites par l'interaction du Triton X-100 avec des LUVs à 4°C ont été étudiées par une procédure de séparation par gradient de densité. Nous avons tenté d'évaluer le rapport effectif approprié détergent/lipides nous permettant d'isoler les fractions résistantes correspondant aux domaines en phase lo existant au niveau de la membrane des LUVs avant l'addition de détergent.

La polyprotéine Gag du VIH-1 qui contient quatre principaux domaines (Matrix (MA), capside (CA), nucléocapside (NC), et P6) est l’orchestrateur privilégié de l'assemblage du virus HIV-1, assemblage qui a lieu pendant la phase tardive de la réplication. Il est bien connu que Gag interagit avec les lipides de la membrane plasmique de la cellule hôte et s’auto-assemble sur le feuillet interne de cette dernière afin de générer de nouvelles particules virales. Le bourgeonnement de ces particules virales hors de la cellule hôte est décrit comme étant dépendant de la machinerie cellulaire ESCRT. Différentes études structurales, fonctionnelles ainsi que des simulations de dynamique gros grain ont montré que la liaison de Gag à la membrane est médiée par une interaction duale. Une spécifique de nature éléctrostatique, qui associe une région hautement basique (HBR) du domaine MA de Gag au lipide acide,phosphatidyl inositol biphosphate (PI(4,5)P2) du feuillet interne de la membrane plasmique. Une de type hydrophobe, qui consiste en l’insertion du myristate de Gag dans la membrane plasmique. Savoir si Gag reconnait spécifiquement des domaines lipidiques pré-existants de type « rafts » ou si, au contraire, Gag tri ses lipides et les réorganise latéralement afin d’optimiser sa multimérisation et son bourgeonnement est une question à la fois fondamentale et d’actualité en virologie.Durant ma thèse, j’ai vérifié l’existence de la seconde hypothèse en utilisant des membranes modèles contenant du PI (4,5) P2 marqué de façon fluorescente et différent mutants et produits de la protéine Gag non-myristoylée. Ces expériences ont montré de fortes affinités de ces protéines pour les membranes contenant du PI (4,5) P2. S’appuyant sur les propriétés d’auto-extinction de fluorescence du marqueur choisit et à l’aide des différents variants de la protéine Gag, j'ai pu montré que la multimérisation de Gag génère l’existence de nanodomaines contenant du PI (4, 5) P2 et du cholestérol, la sphingomyéline étant au contraire exclue de ces domaines. En marquant la protéine Gag par un autre fluorophore, j’ai pu montrer par microscopie optique sur des vésicules lipidiques géantes (GUVs) que la protéine Gag partitionnait préférablement dans des microdomaines lipidiques de type liquide désordonnés (Ld). Par la suite, j’ai testé la capacité de la protéine Gag d’induire la formation de vésicules sur des membranes modèles (Bicouches supportés et GUVs) contenant du PI(4,5) P2 et de la phosphatidyl sérine (PS). En utilisant une microbalance à cristal de quartz (QCM-D) et des techniques de microscopie de fluorescence, j’ai suivi l'auto-assemblage de Gag dans le temps et ai montré que la protéine Gag était suffisante pour générer une courbure de la membrane et libérer des vésicules lipidiques. Grâce à différents produits de maturation de cette protéine, j’ai montré que la présence des domaines MA et CA est suffisante pour produire ces vésicules.L’ensemble de ces résultats suggèrent que la liaison et la multimérisation de la protéine Gag ne se produit pas dans des domaines lipidiques préexistants de type « raft », mais, au contraire, que la liaison et multimérisation de la protéine Gag génère l’existence de domaines lipidiques enrichis en PI (4,5) P2 et en cholestérol. La générescence de ces domaines lipidiques pourrait participer à la courbure de la membrane plasmique nécessaire au bourgeonnement du virus. / Gag polyprotein of HIV-1 is made of four main domains Matrix (MA), Capsid (CA), Nucleocapsid (NC), and P6 and is the prime orchestrator of virus assembly that occurs during the late phase of replication. It is well known that Gag interacts with host cell lipids and self-assemble along the inner-leaflet of the plasma membrane in order to generate virus like particles (VLPs). Budding of these VLPs out of the living cell is described to be ESCRT dependent. Structural, functional and simulation based studies has shown that Gag membrane binding is mediated by a bipartite interaction. One specific electrostatic interaction, between the highly basic region (HBR) of its MA domain and the host cell acidic lipid phosphatidyl inositol bisphophate (PI(4,5)P2), plus a hydrophobic interaction through Gag’s myristate insertion in the plasma membrane. It is still an opened question whether Gag would specifically recognize pre-existing lipid domains such as rafts to optimize its multimerization or, on the contrary, would reorganize lipids during its multimerization. During my Ph.D. I explored the second hypothesis using purified myr(-) Gag protein and model membranes containing fluorescently labelled PI(4,5)P2.Bonding experiments have shown strong affinities of these purified proteins towards PI(4,5)P2 containing lipid bilayers. Using PI(4,5)P2 fluorescence self-quenching properties, I found that multimerization Gag generates PI(4,5)P2/Cholesterol enriched nanoclusters. On the opposite, sphingomyelin was excluded from these nanoclusters. In addition to this, using a fluorescently labelled myr(-) Gag, I have observed its preferable partitioning into lipid disordered (Ld) phases of giant unilamellar vesicles (GUVs). Further, possibility of whether HIV-1 Gag alone, as a minimal system, can induce the formation of vesicles on PI(4,5)P2/PS containing supported lipid bilayers (SLBs) & GUVs was tested. Using quartz crystal microbalance (QCM-D) and fluorescence microscopy techniques, I monitored the self-assembly of HIV-1 Gag with time and found that Gag was sufficient to generate membrane curvature and vesicle release. Moreover, using mutants of this protein, I found that having MA and CA domain is enough for Gag to produce vesicle like structures. Taken together, these results suggest that binding and multimerization of Gag protein does not occur in pre-existing lipid domains (such as “rafts”) but this multimerization is more likely to induce PI(4,5)P2/Cholesterol nanoclusters. This nanophase separation could locally play a role in the membrane curvature needed for the budding of the virus.

Le peptide antimicrobien Cateslytine (bCGA RSMRLSFRARGYGFR ) inhibe la libération des catécholamines des cellules chromaffines. Des études biologiques ont montré que ce peptide est capable d’inhiber aussi la croissance de nombreux microorganismes notamment des bactéries, des levures ainsi que le parasite Plasmodium falciparum responsable de la malaria. Cependant, le mode d’action moléculaire demeurait inconnu. Afin de mieux comprendre le ciblage et la sélectivité de ce peptide sur les membranes de mammifères ou de microorganismes, nous avons donc envisagé la reconstitution du système biologique composé initialement de peptides en contact avec des cellules, en le substituant par des modèles de membrane, de composition mimant celle des différents microorganismes. Des études structurales ont été menées en utilisant la technique d’ATR-FTIR polarisé, le dichroïsme circulaire et la RMN à haute résolution. La dynamique membranaire a été étudiée en utilisant la RMN des solides du phosphore et du deutérium. Des expériences de patch-clamp ont été effectuées afin de mesurer des flux d’ions au travers de la membrane. Enfin, de la simulation par ordinateur a permis de comprendre cette interaction au niveau moléculaire. Trois résultats principaux sont ressortis de cette approche pluridisciplinaire : i) Des flux ioniques au travers de la membrane attestent de la présence de cannaux. ii) La formation de domaines membranaires rigides constitués de lipides chargés négativement est démontrée. iii) Une structuration des peptides en feuillets ß antiparallèles est observée sur des membranes chargées négativement mimant les microorganismes. L’ensemble de ces résultats conduit à la proposition d’un mode d’action dans lequel la déstabilisation membranaire est induite par les domaines rigides stabilisés par les agrégats de peptides structurés en feuillets ß. / The antimicrobial peptide Cateslytin (bCGA RSMRLSFRARGYGFR ) is a five positively charged arginin rich peptide known to inhibit the release of catecholamine in chromaffin granules. Although biological data showed that it is able to inhibit the growth of several microorganisms such as bacteria, yeast and Plasmodium falciparum parasite involved in malaria, the mechanism of action has not been yet studied. In order to better understand both targeting and selectivity of this peptide towards microorganisms, model membranes of variable compositions have been chosen to respectively mimic microorganisms or mammalian membranes. Structural studies have been performed using polarised ATR-FTIR, circular dichroïsm and high resolution NMR Membrane dynamics has been followed using deuterium labelled lipids and solid state NMR Patch clamp experiments were also performed on lipid vesicles to measure channe conductivity. All-atom molecular dynamics on hydrated peptide-lipid membrane systems was also used to assess the interaction from the atomic level. Main results from this interdisciplinary approach are three-fold. i) Electric current passages through membranes demonstrate permeation akin to pore formation. ii) Peptide-induced formation of rigid domains mainly made of negatively charged lipids is found. iii) Peptide antiparallel ß-sheets are observed preferentially with negatively charged lipids mimicking microorganism membranes. The general picture leads to the proposal that membrane destabilization/permeation is promoted by rigid domains stabilised by peptide ß-sheets.