Only a limited number of orally-administered vaccines have been licensed, such as the Dukoral vaccine, comprised of killed whole-cell Vibrio cholerae and cholera toxin B subunit (CTB). Thus far, mechanistic details underlying the resulting protective immune generated by this vaccine, including the requirement of Toll-like receptor (TLR) signaling, remain largely unknown. Herein, I investigated the involvement of TLR signaling in the induction of humoral immune responses following oral and intramuscular immunization with Dukoral or its components by using TLR-2-, TLR-4-, MyD88- and Trif-deficient mice. I showed that wild type and all groups of TLR-deficient mice generated similar levels of V. cholerae- and CTB-specific IgG1 and IgG2c serum antibodies, and fecal IgA antibodies, following oral immunization with Dukoral, and with CTB alone. Additionally, the agglutinating activity of V. cholerae-specific antibodies was also found to occur independently of MyD88 signaling. However, intramuscular immunization with Dukoral, as well as with CTB alone, required MyD88 signaling for the induction of CTB-specific IgG1and IgG2c serum antibodies. I also evaluated the involvement of TLR signaling in the induction of splenic cell-mediated immune responses following oral immunization with Dukoral. My results showed that CD4+ T-cell and CD19+ B cell proliferation occurred in a MyD88-dependent manner in response to stimulation by V. cholerae or CTB. In contrast, in response to CTB stimulation, Trif negatively regulated both CD4+ T-cell and CD19+ B-cell proliferation. Splenocytes from MyD88-/-, Trif-/-, TLR-2-/-, and TLR-4-/- mice were significantly inhibited in their ability to secrete IFN-γ in response to stimulation by V. cholerae. Furthermore, maturation of dendritic cells (DCs), as measured by increased cell-surface CD80, CD86, CD40, and MHCII expression and cytokine secretion was shown to occur in a MyD88-dependent manner in response to stimulation with Dukoral vaccine components. However, despite the impaired ability of MyD88-/- DCs to mature, MyD88-/- animals, and indeed all TLR-deficient animals tested, showed serum and fecal antibody responses comparable to those seen in wild-type animals. Taken together, my results suggest that humoral responses (antibody production and agglutinating ability), following oral immunization with Dukoral, were able to occur independently of TLR signaling and DC maturation. This TLR-independence in the generation of humoral responses was lost when the vaccine was administered parenterally. Cell-mediated immune responses (cell proliferation, DC maturation, and cytokine secretion) were found to be TLR-dependent.

Only a limited number of orally-administered vaccines have been licensed, such as the Dukoral vaccine, comprised of killed whole-cell Vibrio cholerae and cholera toxin B subunit (CTB). Thus far, mechanistic details underlying the resulting protective immune generated by this vaccine, including the requirement of Toll-like receptor (TLR) signaling, remain largely unknown. Herein, I investigated the involvement of TLR signaling in the induction of humoral immune responses following oral and intramuscular immunization with Dukoral or its components by using TLR-2-, TLR-4-, MyD88- and Trif-deficient mice. I showed that wild type and all groups of TLR-deficient mice generated similar levels of V. cholerae- and CTB-specific IgG1 and IgG2c serum antibodies, and fecal IgA antibodies, following oral immunization with Dukoral, and with CTB alone. Additionally, the agglutinating activity of V. cholerae-specific antibodies was also found to occur independently of MyD88 signaling. However, intramuscular immunization with Dukoral, as well as with CTB alone, required MyD88 signaling for the induction of CTB-specific IgG1and IgG2c serum antibodies. I also evaluated the involvement of TLR signaling in the induction of splenic cell-mediated immune responses following oral immunization with Dukoral. My results showed that CD4+ T-cell and CD19+ B cell proliferation occurred in a MyD88-dependent manner in response to stimulation by V. cholerae or CTB. In contrast, in response to CTB stimulation, Trif negatively regulated both CD4+ T-cell and CD19+ B-cell proliferation. Splenocytes from MyD88-/-, Trif-/-, TLR-2-/-, and TLR-4-/- mice were significantly inhibited in their ability to secrete IFN-γ in response to stimulation by V. cholerae. Furthermore, maturation of dendritic cells (DCs), as measured by increased cell-surface CD80, CD86, CD40, and MHCII expression and cytokine secretion was shown to occur in a MyD88-dependent manner in response to stimulation with Dukoral vaccine components. However, despite the impaired ability of MyD88-/- DCs to mature, MyD88-/- animals, and indeed all TLR-deficient animals tested, showed serum and fecal antibody responses comparable to those seen in wild-type animals. Taken together, my results suggest that humoral responses (antibody production and agglutinating ability), following oral immunization with Dukoral, were able to occur independently of TLR signaling and DC maturation. This TLR-independence in the generation of humoral responses was lost when the vaccine was administered parenterally. Cell-mediated immune responses (cell proliferation, DC maturation, and cytokine secretion) were found to be TLR-dependent.

Only a limited number of orally-administered vaccines have been licensed, such as the Dukoral vaccine, comprised of killed whole-cell Vibrio cholerae and cholera toxin B subunit (CTB). Thus far, mechanistic details underlying the resulting protective immune generated by this vaccine, including the requirement of Toll-like receptor (TLR) signaling, remain largely unknown. Herein, I investigated the involvement of TLR signaling in the induction of humoral immune responses following oral and intramuscular immunization with Dukoral or its components by using TLR-2-, TLR-4-, MyD88- and Trif-deficient mice. I showed that wild type and all groups of TLR-deficient mice generated similar levels of V. cholerae- and CTB-specific IgG1 and IgG2c serum antibodies, and fecal IgA antibodies, following oral immunization with Dukoral, and with CTB alone. Additionally, the agglutinating activity of V. cholerae-specific antibodies was also found to occur independently of MyD88 signaling. However, intramuscular immunization with Dukoral, as well as with CTB alone, required MyD88 signaling for the induction of CTB-specific IgG1and IgG2c serum antibodies. I also evaluated the involvement of TLR signaling in the induction of splenic cell-mediated immune responses following oral immunization with Dukoral. My results showed that CD4+ T-cell and CD19+ B cell proliferation occurred in a MyD88-dependent manner in response to stimulation by V. cholerae or CTB. In contrast, in response to CTB stimulation, Trif negatively regulated both CD4+ T-cell and CD19+ B-cell proliferation. Splenocytes from MyD88-/-, Trif-/-, TLR-2-/-, and TLR-4-/- mice were significantly inhibited in their ability to secrete IFN-γ in response to stimulation by V. cholerae. Furthermore, maturation of dendritic cells (DCs), as measured by increased cell-surface CD80, CD86, CD40, and MHCII expression and cytokine secretion was shown to occur in a MyD88-dependent manner in response to stimulation with Dukoral vaccine components. However, despite the impaired ability of MyD88-/- DCs to mature, MyD88-/- animals, and indeed all TLR-deficient animals tested, showed serum and fecal antibody responses comparable to those seen in wild-type animals. Taken together, my results suggest that humoral responses (antibody production and agglutinating ability), following oral immunization with Dukoral, were able to occur independently of TLR signaling and DC maturation. This TLR-independence in the generation of humoral responses was lost when the vaccine was administered parenterally. Cell-mediated immune responses (cell proliferation, DC maturation, and cytokine secretion) were found to be TLR-dependent.

<p>Inledning</p><p>Vid Unitech Biopharma, Matfors (Sverige) sker tillverkning av rekombinant Kolera Toxin</p><p>subenhet B (rCTB-213), vilket är en av de aktiva substanserna i vaccinet Dukoral®.</p><p>Unitech Biopharma AB är ett bioteknikföretag fokuserade på legotillverkning av</p><p>rekombinanta proteiner och tillverkar rCTB för SBL Vaccin AB Solna, (Sverige).</p><p>Anläggningen där tillverkningen av denna produkt sker har alla nödvändiga tillstånd</p><p>(Läkemedelsverket, Länsstyrelsen, Arbetsmiljöverket) och uppfyller gällande cGMP-krav</p><p>samt är godkänd av läkemedelsmyndigheterna i EU och Kanada, WHO samt i ytterligare ca</p><p>35 andra länder.</p><p>Dukoral® är ett drickbart vaccin som stimulerar immunförsvaret i tarmen och skapar ett bra</p><p>skydd mot sjukdomen kolera. Vaccinet ger även skydd mot enterotoxinbildande stammar av</p><p>Escherichia coli (ETEC) vars värmekänsliga toxin (LT) delvis liknar koleratoxinet både</p><p>strukturellt, funktionellt och immunologiskt[34]. Vaccinet består förutom rCTB av tre olika</p><p>stammar inaktiverade Vibrio Cholerae bakterier, vilka produceras vid SBL-vaccin AB, där</p><p>även slutformulering av vaccinet sker.</p><p>Tillverkningsprocessen av Monovalent bulk rCTB-213 sker genom mikrobiell fermentering</p><p>av en genetiskt modifierad produktionsstam av Vibrio Cholerae, där huvudodlingssteget sker i</p><p>500 liters skala där hela tillvekningsprocessen sker under Good Manifacturing Practise (GMP)</p><p>förhållanden för att garantera en säker, effektiv och kvalitetsmässigt bra produkt.</p><p>Målet med detta examensarbete är att upprätta en processbeskrivning för</p><p>tillverkningsprocessen av Monovalent bulk rCTB-213. Beskrivningen skall baseras på den</p><p>process som görs idag och innefatta respektive processtegs mål, teori och kritiska parametrar.</p><p>Den kunskap som skapas genom att definiera och kartlägga (dvs. dokumentera arbetsflödet) i</p><p>en process har ett stort värde i sig, den är dessutom en utomordentlig plattform för</p><p>förbättringsarbete genom att den skapar en gemensam bild av vad som sker i processen i dag.</p><p>I detta examensarbete sker även en sammanställning av produktionen av Monovalent bulk</p><p>rCTB-213 för perioden februari 2004 - juni 2005.</p><p>Fakta om hur processen tidigare har betett sig måste användas som bas för</p><p>förbättringsarbete[1].</p><p>För att se om eventuell förekomst av variation för enskilda variabler kan urskiljas, utvärderas</p><p>processdata för variabler som dokumenterats av företaget för batcher tillverkade under</p><p>perioden februrari 2004 tom. juni 2005.</p><p>Under fermentationssteget regleras parametrarna temperatur, pH och andelen löst syre i</p><p>huvudfermentorn för att upprätthålla optimal fysisk miljö för tillväxt och rCTB produktion.</p><p>För att få en uppfattning om hur dessa parameterar förhållit sig vid odlingar som utförts under</p><p>perioden februari 2004 – juni 2005 utvärderas dessa variabler via</p><p>duglighetsanalys/processkapabilitetsstudie (Cpk). I denna studie beräknas de korrigerade</p><p>duglighetsindexen för de ovan nämda parametrarna, där den naturliga spridningen för</p><p>processen sätts i förhållande till vilka gränser som är angivna i registreringsdokument</p><p>(Process Manifacturing Description) för att få en uppfattning om det som är angivet i</p><p>registrerings- dokument efterlevs.</p>

Inledning Vid Unitech Biopharma, Matfors (Sverige) sker tillverkning av rekombinant Kolera Toxin subenhet B (rCTB-213), vilket är en av de aktiva substanserna i vaccinet Dukoral®. Unitech Biopharma AB är ett bioteknikföretag fokuserade på legotillverkning av rekombinanta proteiner och tillverkar rCTB för SBL Vaccin AB Solna, (Sverige). Anläggningen där tillverkningen av denna produkt sker har alla nödvändiga tillstånd (Läkemedelsverket, Länsstyrelsen, Arbetsmiljöverket) och uppfyller gällande cGMP-krav samt är godkänd av läkemedelsmyndigheterna i EU och Kanada, WHO samt i ytterligare ca 35 andra länder. Dukoral® är ett drickbart vaccin som stimulerar immunförsvaret i tarmen och skapar ett bra skydd mot sjukdomen kolera. Vaccinet ger även skydd mot enterotoxinbildande stammar av Escherichia coli (ETEC) vars värmekänsliga toxin (LT) delvis liknar koleratoxinet både strukturellt, funktionellt och immunologiskt[34]. Vaccinet består förutom rCTB av tre olika stammar inaktiverade Vibrio Cholerae bakterier, vilka produceras vid SBL-vaccin AB, där även slutformulering av vaccinet sker. Tillverkningsprocessen av Monovalent bulk rCTB-213 sker genom mikrobiell fermentering av en genetiskt modifierad produktionsstam av Vibrio Cholerae, där huvudodlingssteget sker i 500 liters skala där hela tillvekningsprocessen sker under Good Manifacturing Practise (GMP) förhållanden för att garantera en säker, effektiv och kvalitetsmässigt bra produkt. Målet med detta examensarbete är att upprätta en processbeskrivning för tillverkningsprocessen av Monovalent bulk rCTB-213. Beskrivningen skall baseras på den process som görs idag och innefatta respektive processtegs mål, teori och kritiska parametrar. Den kunskap som skapas genom att definiera och kartlägga (dvs. dokumentera arbetsflödet) i en process har ett stort värde i sig, den är dessutom en utomordentlig plattform för förbättringsarbete genom att den skapar en gemensam bild av vad som sker i processen i dag. I detta examensarbete sker även en sammanställning av produktionen av Monovalent bulk rCTB-213 för perioden februari 2004 - juni 2005. Fakta om hur processen tidigare har betett sig måste användas som bas för förbättringsarbete[1]. För att se om eventuell förekomst av variation för enskilda variabler kan urskiljas, utvärderas processdata för variabler som dokumenterats av företaget för batcher tillverkade under perioden februrari 2004 tom. juni 2005. Under fermentationssteget regleras parametrarna temperatur, pH och andelen löst syre i huvudfermentorn för att upprätthålla optimal fysisk miljö för tillväxt och rCTB produktion. För att få en uppfattning om hur dessa parameterar förhållit sig vid odlingar som utförts under perioden februari 2004 – juni 2005 utvärderas dessa variabler via duglighetsanalys/processkapabilitetsstudie (Cpk). I denna studie beräknas de korrigerade duglighetsindexen för de ovan nämda parametrarna, där den naturliga spridningen för processen sätts i förhållande till vilka gränser som är angivna i registreringsdokument (Process Manifacturing Description) för att få en uppfattning om det som är angivet i registrerings- dokument efterlevs.