In dieser Dissertation werden die Bindungseigenschaften von Rezeptor-Ligand-Komplexen mit Hilfe von Optischen Pinzetten untersucht. Aufgrund ihrer außerordentlichen Orts- (2nm) und Kraftauflösung (0,2pN) ist es möglich, diese spezifischen Interaktionen anhand einzelner Bindungsereignisse zu charakterisieren. Als Modellsysteme dienen die Wechselwirkungen zwischen den phosphorylierungsspezifischen, monoklonalen Antikörpern HPT-101 und HPT-104 und dem Morbus Alzheimer relevanten Tau-Peptid. Dieses pathogen veränderte Peptid wird krankheitsspezifisch an den Aminosäuren Threonin231 und Serin235 phosphoryliert, sodass die Detektion dieses Phosphorylierungsmusters mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern eine mögliche Früherkennung der Alzheimer-Krankheit darstellt. Eine notwendige Voraussetzung dafür ist jedoch die exakte Kenntnis der Bindungsstellen des Liganden am Rezeptor. Ziel des ersten Teils dieser Arbeit ist es, das Epitop des monoklonalen Antikörpers HPT-101 zu bestimmen. Dazu werden mögliche bindungsrelevante Aminosäuren durch ein Alanin ausgetauscht (Alanin-Scan) und so insgesamt sieben neue Tau-Isoformen aus dem ursprünglichen doppelt-phosphorylierten Peptid Tau[pThr231/pSer235] hergestellt. Die jeweiligen Interaktionen zwischen den modifizierten Peptiden und dem Antikörper werden mit der dynamischen Kraftspektroskopie untersucht und mit Hilfe eines literaturbekannten Modells analysiert. Die sich daraus ergebenden Bindungsparameter (Lebensdauer der Bindung, charakteristische Bindungslänge, freie Aktivierungsenergie und Affinitätskonstante) werden zusammen mit den relativen Bindungshäufigkeiten erstmals genutzt, um Kriterien für essentielle, sekundäre und nicht-essentielle Aminosäuren im Tau-Peptid zu definieren. Bemerkenswerterweise existieren für insgesamt drei dieser Parameter (Bindungslebensdauer, Bindungslänge und Affinitätskonstante) scharfe Klassengrenzen, mit denen eine objektive Einteilung des Epitops von Antikörper HPT-101 möglich ist. Die erhaltenen Ergebnisse sind in überzeugender Weise im Einklang mit ELISA-Messungen zu diesem Antikörper-Peptid-Komplexen, sie liefern jedoch einen tieferen Einblick in die Natur einer spezifischen Bindung, da den kraftspektroskopischen Messungen auch die Bindungskinetik zugänglich ist. Das zweite Projekt der vorliegenden Dissertation etabliert eine Methodik, um die Datenvarianz in der Bestimmung der relativen Bindungshäufigkeit zu reduzieren. Anhand einer Kombination aus Fluoreszenz- und kraftspektroskopischen Messungen werden die Wechselwirkungen zwischen dem monoklonalen Antikörper HPT-104 und dem fluoreszenzmarkierten Peptid Tau[Fl-pThr231] untersucht. Es wird gezeigt, dass durch Vorsortieren der Peptid-beschichteten Kolloide, entsprechend ihrer Oberflächenbeladung, die Datenvarianz in den Bindungshäufigkeitsmessungen signifikant reduziert wird.

Adhesion of biological cells to their environment is mediated by two-dimensional clusters of specific adhesion molecules which are assembled in the plasma membrane of the cells. Due to the activity of the cells or external influences, these adhesion sites are usually subject to physical forces. In recent years, the influence of such forces on the stability of cellular adhesion clusters was increasingly investigated. In particular, experimental methods that were originally designed for the investigation of single bond rupture under force have been applied to investigate the rupture of adhesion clusters. The transition from single to multiple bonds, however, is not trivial and requires theoretical modelling. <br><br> Rupture of biological adhesion molecules is a thermally activated, stochastic process. In this work, a stochastic model for the rupture and rebinding dynamics of clusters of parallel adhesion molecules under force is presented. In particular, the influence of (i) a constant force as it may be assumed for cellular adhesion clusters is investigated and (ii) the influence of a linearly increasing force as commonly used in experiments is considered. Special attention is paid to the force-mediated cooperativity of parallel adhesion bonds. Finally, the influence of a finite distance between receptors and ligands on the binding dynamics is investigated. Thereby, the distance can be bridged by polymeric linker molecules which tether the ligands to a substrate. / Adhäsionskontakte biologischer Zellen zu ihrer Umgebung werden durch zweidimensionale Cluster von spezifischen Adhäsionsmolekülen in der Plasmamembran der Zellen vermittelt. Aufgrund der Zellaktivität oder äußerer Einflüsse sind diese Kontakte normalerweise Kräften ausgesetzt. Der Einfluss mechanischer Kräfte auf die Stabilität zellulärer Adhäsionscluster wurde in den vergangenen Jahren verstärkt experimentell untersucht. Insbesondere wurden experimentelle Methoden, die zunächst vor allem zur Untersuchung des Reißssverhaltens einzelner Moleküle unter Kraft entwickelt wurden, zur Untersuchung von Adhäsionsclustern verwendet. Die Erweiterung von einzelnen auf viele Moleküle ist jedoch keineswegs trivial und erfordert theoretische Modellierung. <br><br> Das Reißen biologischer Adhäsionsmoleküle ist ein thermisch aktivierter, stochastischer Prozess. In der vorliegenden Arbeit wird ein stochastisches Modell zur Beschreibung der Reiß- und Rückbindedynamik von Clustern paralleler Adhäsionsmoleküle unter dem Einfluss einer mechanischen Kraft vorgestellt mit dem die Stabilität der Cluster untersucht wird. Im besonderen wird (i) der Einfluss einer konstante Kraft untersucht wie sie in zellulären Adhäsionsclustern angenommen werden kann und (ii) der Einfluss einer linear ansteigenden Kraft betrachtet wie sie gemeinhin in Experimenten angewendet wird. Besonderes Augenmerk liegt hier auf der durch die Kraft vermittelte Kooperativität paralleler Bindungen. Zuletzt wird der Einfluss eines endlichen Abstandes zwischen Rezeptoren und Liganden auf die Dynamik untersucht. Der Abstand kann hierbei durch Polymere, durch die die Liganden an das Substrat gebunden sind, überbrückt werden.

In dieser Dissertation werden die Bindungseigenschaften von Rezeptor-Ligand-Komplexen mit Hilfe von Optischen Pinzetten untersucht. Aufgrund ihrer außerordentlichen Orts- (2nm) und Kraftauflösung (0,2pN) ist es möglich, diese spezifischen Interaktionen anhand einzelner Bindungsereignisse zu charakterisieren. Als Modellsysteme dienen die Wechselwirkungen zwischen den phosphorylierungsspezifischen, monoklonalen Antikörpern HPT-101 und HPT-104 und dem Morbus Alzheimer relevanten Tau-Peptid. Dieses pathogen veränderte Peptid wird krankheitsspezifisch an den Aminosäuren Threonin231 und Serin235 phosphoryliert, sodass die Detektion dieses Phosphorylierungsmusters mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern eine mögliche Früherkennung der Alzheimer-Krankheit darstellt. Eine notwendige Voraussetzung dafür ist jedoch die exakte Kenntnis der Bindungsstellen des Liganden am Rezeptor. Ziel des ersten Teils dieser Arbeit ist es, das Epitop des monoklonalen Antikörpers HPT-101 zu bestimmen. Dazu werden mögliche bindungsrelevante Aminosäuren durch ein Alanin ausgetauscht (Alanin-Scan) und so insgesamt sieben neue Tau-Isoformen aus dem ursprünglichen doppelt-phosphorylierten Peptid Tau[pThr231/pSer235] hergestellt. Die jeweiligen Interaktionen zwischen den modifizierten Peptiden und dem Antikörper werden mit der dynamischen Kraftspektroskopie untersucht und mit Hilfe eines literaturbekannten Modells analysiert. Die sich daraus ergebenden Bindungsparameter (Lebensdauer der Bindung, charakteristische Bindungslänge, freie Aktivierungsenergie und Affinitätskonstante) werden zusammen mit den relativen Bindungshäufigkeiten erstmals genutzt, um Kriterien für essentielle, sekundäre und nicht-essentielle Aminosäuren im Tau-Peptid zu definieren. Bemerkenswerterweise existieren für insgesamt drei dieser Parameter (Bindungslebensdauer, Bindungslänge und Affinitätskonstante) scharfe Klassengrenzen, mit denen eine objektive Einteilung des Epitops von Antikörper HPT-101 möglich ist. Die erhaltenen Ergebnisse sind in überzeugender Weise im Einklang mit ELISA-Messungen zu diesem Antikörper-Peptid-Komplexen, sie liefern jedoch einen tieferen Einblick in die Natur einer spezifischen Bindung, da den kraftspektroskopischen Messungen auch die Bindungskinetik zugänglich ist. Das zweite Projekt der vorliegenden Dissertation etabliert eine Methodik, um die Datenvarianz in der Bestimmung der relativen Bindungshäufigkeit zu reduzieren. Anhand einer Kombination aus Fluoreszenz- und kraftspektroskopischen Messungen werden die Wechselwirkungen zwischen dem monoklonalen Antikörper HPT-104 und dem fluoreszenzmarkierten Peptid Tau[Fl-pThr231] untersucht. Es wird gezeigt, dass durch Vorsortieren der Peptid-beschichteten Kolloide, entsprechend ihrer Oberflächenbeladung, die Datenvarianz in den Bindungshäufigkeitsmessungen signifikant reduziert wird.

Ziel dieser Arbeit war es, die Morphologie und mechanischen Eigenschaften von einzelnen nativen Typ-I-Kollagenfibrillen bei verschiedenen Umgebungsbedingungen zu untersuchen. Um auf der Nanometerskala die mechanischen Eigenschaften der Fibrillenoberfläche und des Fibrillenvolumens bestimmen zu können, wurde die dynamische (MUSIC-Mode) und statische (FD) Rasterkraftmikroskopie (engl.: Atomic-Force-Microscopy – AFM) genutzt. Die dynamische Spektroskopie erlaubte Rückschlüsse auf die Änderung der mechanischen Eigenschaften von Oberflächen (unter Einbeziehung der ersten 10 nm) bei Variation der Umgebungsbedingungen, wohingegen die statische Kraftspektroskopie Einblicke in das mechanische Verhalten der Volumenphase des Materials (Bulk) gestattete. Es wurden einzelne ovine (vom Schaf stammende) Kollagenfibrillen hinsichtlich ihrer mechanischen und morphologischen Veränderung als Folge von variierten Umwelteinflüssen (Salzkonzentrations-änderung des umgebenden Mediums sowie beim Durchlaufen des Peroxo-essigsäure/Ethanol-Sterilisationsprozesses) untersucht. Im Einzelnen konnte mit dem MUSIC-Mode-AFM und der FD-Spektroskopie die Denaturierung einer Kollagenfibrille in Abhängigkeit der Salzkonzentration beobachtet werden. Ebenfalls konnte mittels der MUSIC-Mode und der FD-Spektroskopie für mehrere Fibrillen unterschiedlichen Durchmessers nachgewiesen werden, dass während des Entfettungsschrittes des Peroxoessigsäure/Ethanol-Sterilisationsprozesses irreversible Veränderungen ihres Quellverhaltens sowie ihrer mechanischen Eigenschaften auftreten.:1 Einleitung ...................................................................................... 8 2 Zielstellungen dieser Arbeit .......................................................... 9 3 Kollagen ...................................................................................... 10 3.1 Aufbau und Struktur .......................................................................... 10 3.2 Die Rolle des Wassers und der Einfluss des Salzes auf die mechanischen Eigenschaften von Kollagen .......................................... 14 3.3 Einfluss der Sterilisation auf Kollagen ................................................ 20 3.4 Bisherige Untersuchungen von Kollagen mit dem AFM – Stand der Technik .................................................................. 24 4 Methoden .................................................................................... 29 4.1 Rasterkraftmikroskop (Atomic Force Microscope–AFM) .................... 29 4.1.1 Statische Kraftspektroskopie ........................................................... 33 4.1.2 Dynamische Kraftspektroskopie ...................................................... 35 4.1.3 Kontaktmodelle ............................................................................... 39 4.1.4 Spitze-Probe Wechselwirkungen ...................................................... 41 4.2 Infrarotspektroskopie [152] .................................................................. 48 4.2.1 Funktionsweise des ATR-FTIR ....................................................... 50 4.2.2 IR-Spektroskopie an Proteinen ........................................................ 51 5 Experimenteller Teil ................................................................... 53 5.1 Herstellung der Kollagenproben .......................................................... 53 5.2 Durchführung der AFM-Messungen .................................................... 53 5.2.1 Durchführung der AFM-Messung zum Kapitel „Einfluss der NaCl-Konzentration auf Typ-I-Kollagen“ ................................................. 54 5.2.2 Durchführung der Untersuchungen zum Sterilisationsprozess ......... 55