Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:59Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-11-26Bitstream added on 2014-06-13T19:19:50Z : No. of bitstreams: 1 gregio_apb_dr_arafcf.pdf: 2113336 bytes, checksum: b9ebdb1987717c610b020ac89d1288cf (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O provável fator de início de tradução 5A (eIF5A) é altamente conservado de arqueas a mamíferos e sofre uma modificação pós-traducional única e essencial, em que uma lisina específica é convertida em um resíduo de hipusina. Este fator já foi relacionado a início de tradução, transporte nucleocitoplasmático, decaimento de mRNA e proliferação celular, mas a função crítica de eIF5A na célula ainda não foi totalmente esclarecida. Ainda que o papel de eIF5A na tradução geral tenha sido questionado, dados recentes de nosso laboratório, incluindo os resultados deste trabalho, restabelecem uma função para eIF5A na tradução e evidenciam a sua atuação na etapa de elongação ao invés de início. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi ampliar os estudos do papel de eIF5A na síntese proteica. Para isso, foram realizadas análises de interação genética e de perfil polissomal de linhagens que combinam o alelo mutante de eIF5A, tif51A-3, e de fatores envolvidos na etapa de início (eIF4E, eIF3 e eIF5B) ou elongação (eEF2) da tradução. As análises de perfil polissomal utilizando mutantes duplos de eIF5A e de fatores de início de tradução mostram uma diminuição do efeito de perda de polissomos característico de mutantes de início de tradução. Além disso, o perfil polissomal de mutantes de eIF5A é bastante semelhante ao do mutante de elongação. Foi também observado que a depleção de eIF5A provoca uma diminuição significativa na síntese proteica total e um aumento no tempo de trânsito ribossomal, confirmando os resultados obtidos nas análises de perfil polissomal. Também foi avaliada a influência de eIF5A no processo de elongação da tradução utilizando-se repórteres contendo a IRES do vírus CrPV, a qual é independente de todos os fatores de início de tradução conhecidos. Foi observada uma diminuição... / The putative eukaryotic translation initiation factor 5A (eIF5A) is highly conserved from archaea to mammals, essential for cell viability and it is the only cellular protein known to contain the essential amino acid hypusine. eIF5A has also been involved with nucleocitoplasmatic transport, mRNA decay and cell proliferation, however its critical function in the cell is not completely understood. Although a role for eIF5A in general translation has been questioned, our recent findings, including those described in this study, showed that eIF5A has a function in protein synthesis and it is related with the elongation step of translation instead of initiation. Therefore, the aim of this study was to investigate the role of eIF5A in protein synthesis. For this purpose, we tested genetic interactions and performed polysomal profile analysis of yeast strains that combine the eIF5A mutant tif51A-3 with translation initiation (eIF4E, eIF3 and eIF5B) or elongation (eEF2) mutants. The polysome profile analysis of the double mutants of eIF5A and canonical initiation mutants showed a decrease in polysome run-off. In addition, the polysome profile of eIF5A mutant is quite similar to that of the eEF2 mutant. Also, we observed that the depletion of eIF5A causes a significant decrease in total protein synthesis and an increase of the average ribosomal transit time. These results are in agreement with the polysome profile data. The influence of eIF5A in translation elongation was also evaluated using reporters containing the CrPV IRES, which is independent of all factors known to be involved in translation initiation. We observed a decrease in IRES activity in the eIF5A and eEF2 mutants, when compared to the wild type. In addition, two other conditional eIF5A mutants (tif51AK56A and tif51AQ22H/L93F) which produce stable eIF5A at the restrictive temperature were also analyzed... (Complete abstract click electronic access below)

Le ribosome est un complexe macromoléculaire impliqué dans la synthèse protéique de toutes les cellules vivantes. L’étape d’élongation de cette synthèse est un processus itératif débutant par la sélection au sein du ribosome d’un ARNt aminoacylé suivie par le transfert du peptide du site P- vers le site A- et de la translocation de l’ARNm et de l’ARNt. Le facteur d’élongation 2 (eEF2), qui catalyse la translocation, est l’un des acteurs majeur de cette étape d’élongation chez les eucaryotes. Cependant le mécanisme par lequel eEF2 induit ce processus est encore aujourd’hui inconnu. Dans cette étude structurale, nous présentons la première structure à haute résolution (3.1 Å) du complexe de pré-translocation résolu par cristallographie aux rayons X. La structure obtenue nous a permis d’identifier les différents composants du complexe de translocation et de proposer le rôle de l’His699 et celui de la diphtamide, modification post-traductionnelle d’eEF2, lors du stade de pré-translocation. / Elongation is the longest stage of protein synthesis that takes place on the ribosome and represents a cycle that begins with an aminoacyl-tRNA selection followed by the catalysis of peptide transfer from the P- to the A-site and mRNA-tRNA translocation. Elongation factor 2 (eEF2) is one of the key player of elongation cycle in eukaryotes that catalyzes translocation of mRNA and tRNA on the ribosome. However the mechanism how eEF2 induces translocation on the ribosome is unknown. Current work investigates the structural aspect of protein synthesis machinery in eukaryotes. In particular we present first high resolution structure of functional pretranslocation complex solved at 3.1 A by X-ray crystallography. The obtained structure allowed us to see several features of translocation complex and to propose the role of His699 and post translational modification of eEF2 diphthamide during at pretranslocation stage.

Ce travail porte sur l’étude de la fidélité de la traduction chez les eucaryotes d’un point de vue mécanistique et génomique. Au cours de ma thèse j'ai développé trois approches :Le premier projet porte sur l’étude du rôle du facteur de l’élongation eEF2 dans le maintien du cadre de lecture. La stratégie associe une mutagénèse aléatoire du gène EFT2 à un criblage phénotypique, elle permet d’isoler des mutants capables d’augmenter ou diminuer l’efficacité de recodage d’une séquence de décalage du cadre de lecture en -1.Le second projet décrit la mise au point d’un système de traduction en molécule unique qui permet d’étudier le ribosome eucaryote. La traduction est initiée grâce à l’IRES CrPV qui a pour caractéristique d’être totalement indépendante des facteurs d’initiation et de l’ARNt initiateur. L’élongation de la traduction est détectée grâce au départ d’un oligonucléotide fluorescent qui est décroché par l’activité hélicase du ribosome. Les résultats de ces expériences constituent une preuve de principe démontrant que l’étude de la traduction eucaryote en molécule unique est possible.Le troisième projet est une étude de génomique comparative qui permet de rechercher des événements de recodage ainsi que d’autres événements non-conventionnels de la traduction dans le génome de la levure Saccharomyces cerevisiae. L’approche est basée sur une recherche d’organisations génomiques conservées au sein de 19 génomes de levures. Les gènes candidats sont testés in vivo grâce à un vecteur double rapporteur. Cette étude a permis de mettre en évidence le gène VOA1 qui a été ensuite caractérisé plus en détails. / This report describes a study of translation fidelity in Eukarya. Two aspects are tested: the molecular mechanism of recoding and the research of recoding events at the genomic level. During my PhD I have developed three projects:The first project deals with the role of the elongation factor eEF2 in reading frame maintenance. The strategy is based on a random mutagenesis of EFT2 and a phenotypic screening in order to isolate mutants increasing or reducing -1 frameshifting efficiency.The second project describes the development of a single molecule translational system to study the eukaryotic ribosome. Translation initiation is mediated by the CrPV IRES which is initiation factor and initiation tRNA independent. Elongation is monitored with the dissociation of a fluorescent oligonucleotide by the helicase activity of the ribosome. This work is a proof of principle that studying eukaryotic ribosome with single molecule techniques is now feasible.The third project is a comparative genomic approach to search for recoding and unconventional translational events in the genome of yeast Saccharomyces cerevisiae. The approach is based on the detection of conserved genomic organization among 19 Fungi genomes. The candidate genes are then tested in vivo with a dual reporter system. This study allowed the characterization of VOA1 which was further analysed.

Ce travail porte sur l'étude de la fidélité de la traduction chez les eucaryotes d'un point de vue mécanistique et génomique. Au cours de ma thèse j'ai développé trois approches :Le premier projet porte sur l'étude du rôle du facteur de l'élongation eEF2 dans le maintien du cadre de lecture. La stratégie associe une mutagénèse aléatoire du gène EFT2 à un criblage phénotypique, elle permet d'isoler des mutants capables d'augmenter ou diminuer l'efficacité de recodage d'une séquence de décalage du cadre de lecture en -1.Le second projet décrit la mise au point d'un système de traduction en molécule unique qui permet d'étudier le ribosome eucaryote. La traduction est initiée grâce à l'IRES CrPV qui a pour caractéristique d'être totalement indépendante des facteurs d'initiation et de l'ARNt initiateur. L'élongation de la traduction est détectée grâce au départ d'un oligonucléotide fluorescent qui est décroché par l'activité hélicase du ribosome. Les résultats de ces expériences constituent une preuve de principe démontrant que l'étude de la traduction eucaryote en molécule unique est possible.Le troisième projet est une étude de génomique comparative qui permet de rechercher des événements de recodage ainsi que d'autres événements non-conventionnels de la traduction dans le génome de la levure Saccharomyces cerevisiae. L'approche est basée sur une recherche d'organisations génomiques conservées au sein de 19 génomes de levures. Les gènes candidats sont testés in vivo grâce à un vecteur double rapporteur. Cette étude a permis de mettre en évidence le gène VOA1 qui a été ensuite caractérisé plus en détails.

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