The local microenvironment of hematopoietic stem cells (HSCs) in the bone marrow -referred to as stem cell niche- is thought to regulate the balance of stem cell maintenance and differentiation by a complex interplay of extrinsic signals including spatial constraints, extracellular matrix (ECM) components and cell-cell interactions. To dissect the role of niche ECM components, a set of well-defined matrix biomolecular coatings including fibronectin, laminin, collagen IV, tropocollagen I, heparin, heparan sulphate, hyaluronic acid and co-fibrils of collagen I with heparin or hyaluronic acid were prepared and analyzed with respect to adhesive interactions of human CD133+ HSCs in vitro. ECM molecule dependent adhesion areas as well as fractions of adherent HSCs were assessed by reflection interference contrast microscopy and differential interference contrast microscopy. HSCs, so far mostly classified as suspension cells, exhibited intense adhesive interactions with fibronectin, laminin, collagen IV, heparin, heparan sulphate, and collagen I based co-fibrils. An integrin mediated adhesion on fibronectin and a L-selectin mediated adhesion on heparin pointed to specific interactions based on different adhesion mechanisms. As a consequence of HSC adhesion to molecules of the vascular and the endosteal regions, both regions were confirmed as possible stem cell niches and adhesive signals were suggested as potential regulators of stem cell fate. Furthermore, the impact of a spatially organized ECM on the HSC behavior was analyzed by single cell tracking. These studies required the development of engineered three-dimensional, ECM coated microcavities with the option for single cell tracking. A semi-automated cell-tracking tool was established to accelerate data access from time-lapse image sequences. From this analysis it was possible to reveal the genealogy, localization, morphology and migration of single HSCs over a time period of 4 days. A decreased cycling frequency was observed depending on the HSC localization in the spatially constraining microcavities. Besides the revealed impact of spatial constraints on HSC fate, the newly engineered ECM-coated microcavity setup and the semi-automated cell tracking tool provide new options to study the cell fate in engineered microenvironments at single cell level for other cell types ex vivo. / Die lokale Mikroumgebung von Blutstammzellen (BSZ) im Knochenmark, bezeichnet als Stammzellnische, reguliert das Gleichgewicht von Stammzellerhaltung und -differenzierung durch ein komplexes Zusammenspiel von extrinsischen Signalen wie räumliche Beschränkungen, Komponenten der extrazellulären Matrix (EZM) und Zell-Zell Wechselwirkungen. Um die Rolle der EZM-Komponenten zu analysieren, wurden definierte Beschichtungen von Fibronektin, Laminin, Kollagen IV, monomerem Kollagen I, Heparin, Heparan Sulphat, Hyaluronsäure und Co-Fibrillen aus Kollagen I und Heparin oder Hyaluronsäure hergestellt und in vitro bezüglich der adhäsiven Wechselwirkungen von humanen CD133+ BSZ untersucht. Die Adhäsionsflächen und der Anteil adhärenter Zellen wurden in Abhängigkeit von der EZM-Beschichtung mittels Reflexions- Interferenz-Kontrast-Mikroskopie und Differentieller Interferenz Kontrast Mikroskopie bestimmt. BSZ, bisher als Suspensionszellen definiert, zeigten intensive adhäsive Wechselwirkungen mit Fibronektin, Laminin, Kollagen IV, Heparin, Heparan Sulphat und den Co-Fibrillen. Eine Integrin abhängige Adhäsion auf Fibronektin und eine L-Selektin abhängige Adhäsion auf Heparin, wiesen auf spezifische Wechselwirkungen hin, die auf unterschiedlichen Mechanismen basieren. Aufgrund der Adhäsion von BSZ sowohl zu Molekülen der vaskulären als auch der endostealen Knochenmarkregion, wurden beide Bereiche als mögliche Stammzellnische bestätigt. Adhäsive Signale sind potentielle Regulatoren der Stammzellentwicklung. Im Weiteren wurde der Einfluss einer räumlich beschränkenden EZM auf das Verhalten der BSZ durch Einzelzellverfolgung untersucht. Diese Studien erforderten die Entwicklung von dreidimensionalen EZM-beschichteten Mikrokavitäten, die das Verfolgen einzelner Zellen ermöglichten. Es wurde ein halbautomatischer Algorithmus für die Zellverfolgung etabliert, um die Datengenerierung von den Zeitreihenaufnahmen zu beschleunigen. Die Analysen ermöglichten Aussagen über die Genealogie, Lokalisierung, Morphologie und Migration einzelner BSZ während einer Analysenzeit von 4 Tagen. Eine verringerte Zellteilungsaktivität wurde in Abhängigkeit von der BSZ Lokalisierung innerhalb der räumlich einschränkenden Mikrokavitäten festgestellt. Neben diesen Erkenntnissen bieten die entwickelten Mikrokavitäten und die etablierte Einzelzellverfolgung neue Möglichkeiten auch andere Zelltypen auf Einzelzellniveau ex vivo zu untersuchen.

The local microenvironment of hematopoietic stem cells (HSCs) in the bone marrow -referred to as stem cell niche- is thought to regulate the balance of stem cell maintenance and differentiation by a complex interplay of extrinsic signals including spatial constraints, extracellular matrix (ECM) components and cell-cell interactions. To dissect the role of niche ECM components, a set of well-defined matrix biomolecular coatings including fibronectin, laminin, collagen IV, tropocollagen I, heparin, heparan sulphate, hyaluronic acid and co-fibrils of collagen I with heparin or hyaluronic acid were prepared and analyzed with respect to adhesive interactions of human CD133+ HSCs in vitro. ECM molecule dependent adhesion areas as well as fractions of adherent HSCs were assessed by reflection interference contrast microscopy and differential interference contrast microscopy. HSCs, so far mostly classified as suspension cells, exhibited intense adhesive interactions with fibronectin, laminin, collagen IV, heparin, heparan sulphate, and collagen I based co-fibrils. An integrin mediated adhesion on fibronectin and a L-selectin mediated adhesion on heparin pointed to specific interactions based on different adhesion mechanisms. As a consequence of HSC adhesion to molecules of the vascular and the endosteal regions, both regions were confirmed as possible stem cell niches and adhesive signals were suggested as potential regulators of stem cell fate. Furthermore, the impact of a spatially organized ECM on the HSC behavior was analyzed by single cell tracking. These studies required the development of engineered three-dimensional, ECM coated microcavities with the option for single cell tracking. A semi-automated cell-tracking tool was established to accelerate data access from time-lapse image sequences. From this analysis it was possible to reveal the genealogy, localization, morphology and migration of single HSCs over a time period of 4 days. A decreased cycling frequency was observed depending on the HSC localization in the spatially constraining microcavities. Besides the revealed impact of spatial constraints on HSC fate, the newly engineered ECM-coated microcavity setup and the semi-automated cell tracking tool provide new options to study the cell fate in engineered microenvironments at single cell level for other cell types ex vivo. / Die lokale Mikroumgebung von Blutstammzellen (BSZ) im Knochenmark, bezeichnet als Stammzellnische, reguliert das Gleichgewicht von Stammzellerhaltung und -differenzierung durch ein komplexes Zusammenspiel von extrinsischen Signalen wie räumliche Beschränkungen, Komponenten der extrazellulären Matrix (EZM) und Zell-Zell Wechselwirkungen. Um die Rolle der EZM-Komponenten zu analysieren, wurden definierte Beschichtungen von Fibronektin, Laminin, Kollagen IV, monomerem Kollagen I, Heparin, Heparan Sulphat, Hyaluronsäure und Co-Fibrillen aus Kollagen I und Heparin oder Hyaluronsäure hergestellt und in vitro bezüglich der adhäsiven Wechselwirkungen von humanen CD133+ BSZ untersucht. Die Adhäsionsflächen und der Anteil adhärenter Zellen wurden in Abhängigkeit von der EZM-Beschichtung mittels Reflexions- Interferenz-Kontrast-Mikroskopie und Differentieller Interferenz Kontrast Mikroskopie bestimmt. BSZ, bisher als Suspensionszellen definiert, zeigten intensive adhäsive Wechselwirkungen mit Fibronektin, Laminin, Kollagen IV, Heparin, Heparan Sulphat und den Co-Fibrillen. Eine Integrin abhängige Adhäsion auf Fibronektin und eine L-Selektin abhängige Adhäsion auf Heparin, wiesen auf spezifische Wechselwirkungen hin, die auf unterschiedlichen Mechanismen basieren. Aufgrund der Adhäsion von BSZ sowohl zu Molekülen der vaskulären als auch der endostealen Knochenmarkregion, wurden beide Bereiche als mögliche Stammzellnische bestätigt. Adhäsive Signale sind potentielle Regulatoren der Stammzellentwicklung. Im Weiteren wurde der Einfluss einer räumlich beschränkenden EZM auf das Verhalten der BSZ durch Einzelzellverfolgung untersucht. Diese Studien erforderten die Entwicklung von dreidimensionalen EZM-beschichteten Mikrokavitäten, die das Verfolgen einzelner Zellen ermöglichten. Es wurde ein halbautomatischer Algorithmus für die Zellverfolgung etabliert, um die Datengenerierung von den Zeitreihenaufnahmen zu beschleunigen. Die Analysen ermöglichten Aussagen über die Genealogie, Lokalisierung, Morphologie und Migration einzelner BSZ während einer Analysenzeit von 4 Tagen. Eine verringerte Zellteilungsaktivität wurde in Abhängigkeit von der BSZ Lokalisierung innerhalb der räumlich einschränkenden Mikrokavitäten festgestellt. Neben diesen Erkenntnissen bieten die entwickelten Mikrokavitäten und die etablierte Einzelzellverfolgung neue Möglichkeiten auch andere Zelltypen auf Einzelzellniveau ex vivo zu untersuchen.