Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2017-03-10T18:05:39Z No. of bitstreams: 1 2016_TainãRappPy-Daniel_Parcial.pdf: 977532 bytes, checksum: f1c0bbe9f6abd87299d6b2e7aae744a4 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-04-06T21:53:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_TainãRappPy-Daniel_Parcial.pdf: 977532 bytes, checksum: f1c0bbe9f6abd87299d6b2e7aae744a4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-06T21:53:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_TainãRappPy-Daniel_Parcial.pdf: 977532 bytes, checksum: f1c0bbe9f6abd87299d6b2e7aae744a4 (MD5) / Estudos de desenvolvimento são contribuições importantes para a interpretação de padrões evolutivos responsáveis pelas atuais linhagens filogenéticas. Os squamatas são um grupo altamente diversificado que ainda é pouco representado em investigações embriológicas. O presente estudo descreve a sequência de desenvolvimento in ovo de Tropidurus torquatus. Fêmeas grávidas foram coletadas por meio de laço em ambientes antropizados de Brasília, Brasil, e mantidas em terrários até o momento de oviposição. Uma vez ocorrida a desova, os ovos foram transferidos para uma incubadora com temperatura de 30ºC (± 0,1º C). Coletas diárias dos embriões foram realizadas desde o momento de oviposição até eclosão, a qual ocorreu após aproximadamente 75 dias, resultando em um total de 209 embriões obtidas em duas estações reprodutivas. Foram estabelecidos 15 estágios de desenvolvimento com base em características de morfologia externa amplamente utilizadas na literatura de lagartos, como estruturas visuais, arcos faríngeos, fusão dos primórdios faciais, desenvolvimento dos membros, pigmentação e escamas. A organogenese já estava em andamento no momento de oviposição, com embriões condizendo com o estágio 28 descrito em outros estudos. Comparações com outros lagartos mostram uma sequência embrionária conservada, contudo diferenças no tempo de desenvolvimento foram encontradas em características como os arcos faríngeos, sacos endolinfáticos, pigmentação e escamas. Ao contrário da maioria das series de desenvolvimento de lagartos, os membros pelvinos da espécie alvo se desenvolvem antes que membros torácicos. O desenvolvimento dos primórdios do falo e lábio cranial da cloaca são comparados com os de outros lagartos. O esqueleto de espécimes adultos foi descrito e serviu de base para as descrições de desenvolvimento esquelético. O condrocrânio de T. torquatus apresentou redução de elementos orbitotemporais como as tenias marginais e a pila antótica Os elementos dermais aparentemente possuem uma sequência de ossificação conservada entre lagartos, ocorrendo maiores variações no padrão de ossificação dos elementos condrais. As vértebras ossificaram-se em um gradiente crânio-caudal, mas mostraram uma dissociação em relação às costelas cuja ossificação não seguiu este gradiente. Um centro de ossificação independente para as costelas das vértebras sacrais e caudais não foi visualizado. Nos membros, constatamos a formação do uma condensação cartilagínea contínua em forma de “Y”, seguido pelo desenvolvimento do arcabouço dos membros que consiste na formação do eixo primário e arco digital. Os elementos autopodiais do membro pelvino desenvolveram-se com certa antecedência em relação aos membros torácicos. Todos os distais do carpo foram vistos, o distal do carpo I permanecendo em contato estreito com o seu respectivo metacarpo. O distal do carpo V não demonstrou uma conexão embrionária com dcIV. Quanto aos distais do tarso, apenas a condensação condrogênica do dtI não foi visualizada. Encontramos uma conexão embrionária entre o distal do tarso V e o distal do tarso IV, indicando que o dtV provavelmente não tem uma origem independente. Os distais do tarso II e V consistiram em condensações transitórias que logo se fusionaram aos seus metatarsos. Foi possível distinguir a participação de três elementos condrogênicos na formação do proximal do tarso: o fibular, o intermédio-central e o tibial. A sequência de ossificação do autopódio não refletiu a sequência condrogênica de desenvolvimento do eixo primário e do arco digital. Exemplos de ossificações pós-embrionárias incluem a diminuição na área da fontanela parietal, ossificação de elementos do autopódio torácico, surgimento de centros de ossificações secundários nas epífises dos ossos longos e fusão dorsal dos arcos vertebrais e da sutura neurocentral. Espera-se que o presente estudo possa contribuir como fonte de dados para futuras investigações evolutivas e de desenvolvimento relacionadas à tropidurídeos e squamatas. / Developmental studies are an important contribution to the interpretation of evolutionary patterns responsible for extant phylogenetic lineages. Squamates are a highly diverse group that is still underrepresentated in embryological investigations. The present study describes the sequence of in ovo development of Tropidurus torquatus. Gravid females were collected by noose in antropized surroundings of Brasília, Brazil, and maintained in terrariums until oviposition. Once deposition occurred, eggs were transferred to a 30ºC (± 0,1º C) temperature incubator. Daily collection of embryos were accomplished from oviposition to hatching, which took place after approximately 75 days, resulting in a total of 209 embryos obtained in two reproductive seasons. Fifteen developmental stages were established based on external morphological characteristics widely used in lizard literature such as visual structures, pharyngeal arches, facial primordial fusion, limb development, pigmentation and scales. Organogenesis was already in progression at the moment of oviposition, at which embryos resemble stage 28 of other studies. Comparisons with other lizards show a conserved embryonic sequence, however developmental timing differences were found in features such as the pharyngeal arches, endolymphatic sacs, pigmentation and scales. The order of T. torquatus fore- and hindlimb formation differs from that most commonly observed in lizards. The development of the phallic and cranial lip of the cloaca anlages are compared with that of other lizards. The adult skeleton of T. torquatus was describes and served as a guide for the developmental descriptions. The chondrocranium of T. torquatus presented reduction of orbitotemporal elements such as the teania marginalis and pila antotica. Dermal elements apparently show a conserved ossification sequence amongst lizards, main variations occurring in the ossification sequence of chondral elements. Vertebrae ossify in a cranial-caudal gradient, but are dissociated from the ossification of the ribs which do not follow this gradient. An independent center of ossification for the sacral and caudal ribs was not visualized. In the limbs, a continuous cartilaginous condensation forming a “Y” was first seen, followed by the development of the limb understructure which consists in the formation of the primary axis and the digital arch. The autopodial elements of the hindlimbs developed slightly earlier than the forelimbs. All distal carpals were seen, distal carpal I remaining in close contact with its metacarpal. The dcV did not show an embryonic connection with dcIV. In regard to the distal tarsals, only the chondrogenic condensation of distal tarsal I was not visualized. We found an embryonic connection between distal tarsal V and distal tarsal IV, indicating that dtV is probably not a de novo condensation. The distal tarsal II and V consisted in transitory condensations that rapidly fused with their respective metatarsal. Three chondrogenic elements were identified as constituents of the tarsus: fibular, intermedium-central and tibial. The sequence of ossification of the autopodium did not reflect the chondrogenic sequence of primary axis development. Examples of post-embryonic ossifications include a reduction in the area of the parietal fontanel, ossification of forelimb autopodial elements, development of secondary centers of ossifications of long bone epiphysis and dorsal fusion of vertebral arches and neurocentral sutures. The present study intends to contribute as a source of data for future investigations concerned with the evolution and development of tropidurids and squamates.

Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-03-13T15:36:17Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE Jemima Barros.pdf: 4966940 bytes, checksum: 56ba1595a7420a415141ae182e1e62ac (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-13T15:36:17Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE Jemima Barros.pdf: 4966940 bytes, checksum: 56ba1595a7420a415141ae182e1e62ac (MD5) Previous issue date: 2014 / CAPES / Os tumores embrionários constituem importante causa de morte em crianças, cujos fatores de risco, possíveis causas e mecanismos etiopatogênicos são pouco conhecidos. Visando contribuir para identificação de fatores de suscetibilidade e prognóstico, esse estudo teve por objetivo avaliar fatores biológicos, clínicos, moleculares e citogenéticos em crianças com neuroblastoma, retinoblastoma, tumor de Wilms e meduloblastoma, atendidas no Centro de Oncohematologia Pediátrica do Hospital Universitário Oswaldo Cruz. Foram estudados 51 pacientes com neuroblastoma, 141 com retinoblastoma, 97 com tumor de Wilms e 51 com meduloblastoma quanto ao sexo, idade, queixas, localização do tumor, estadiamento, metástases, níveis de desidrogenase láctica e amplificação do gene n-myc, e analisados quanto à sobrevida. Análises moleculares e citogenéticas foram realizadas em amostras de sangue periférico, tumor fresco e parafinado. Alguns fatores influenciaram de forma estatisticamente significante para menor sobrevida e pior prognóstico dos pacientes, entre eles: o sexo feminino, o estadiamento e os níveis de desidrogenase láctica em pacientes com neuroblastoma; a disseminação da doença e o estadiamento em pacientes com retinoblastoma; metástases e recidivas em pacientes com meduloblastoma. Nenhum dos parâmetros estudados parece influenciar na sobrevida de pacientes com tumor de Wilms. Apenas o alelo MTR 2756A parece ter influência para uma menor sobrevida em pacientes com retinoblastoma. Outros marcadores não apresentaram informação preditiva significativa no prognóstico de tumores neuroblastoma, retinoblastoma, tumor de Wilms e meduloblastoma. Polimorfismos dos genes MTHFR, MTR, SLC19A1 e TYMS foram analisados em pacientes com os tumores estudados e em controles. Os polimorfismos do gene SLC19A1 (p=0,0286) em neuroblastoma e do gene MTHFR A1298C (p=0,0270) em tumor de Wilms mostraram-se estatisticamente significantes, indicando que os portadores dos genótipos AA e do alelo C apresentam 5,17 e 2,8 vezes mais chance de desenvolver neuroblastoma e tumor de Wilms, respectivamente. A análise citogenética clássica revelou um caso de retinoblastoma agressivo associado a alterações cromossômicas não relatadas anteriormente, bem como alterações comuns ao neuroblastoma, envolvendo regiões 2p, 1q e 17q. As técnicas de extração e FISH em amostras parafinadas foram aplicadas em 41, 28 e 10 pacientes com retinoblastoma, tumor de Wilms e neuroblastoma respectivamente. 24,4% apresentaram deleção de RB1, sendo 60% bilaterais, sugerindo associação com à forma hereditária da doença. Alterações envolvendo WT1 e WT2 foram observadas em 10,7% dos casos. Um caso revelou três sinais WT1 e WT2, podendo estar associado à dissomia uniparental e duplicações. A análise de dados clínicos, moleculares e citogenéticos em crianças com neuroblastoma, retinoblastoma, tumor de Wilms e meduloblastoma permitiu determinar fatores prognósticos e identificar fatores de risco para a sobrevida desses pacientes, contribuindo para a identificação de características de tumores sólidos na infância. Entretanto, novos estudos são necessários para avaliar o impacto dessas variáveis no tratamento de crianças com câncer.

Os tumores embrionários do Sistema Nervoso Central (SNC) são os mais comuns em crianças de zero a quatro anos e a principal causa de mortalidade infantil. O tratamento convencional desses tumores malignos resulta em diversas sequelas que afetam significativamente a qualidade de vida dos sobreviventes. Diferentes estudos têm demonstrado que a ativação de genes tipicamente expressos em células-tronco, como o fator de pluripotência OCT4A, confere características mais primitivas e agressivas às células tumorais, frequentemente associadas ao prognóstico clínico desfavorável. Fundamentado na hipótese da existência das células-tronco tumorais (CTT) e sua contribuição na progressão tumoral, o presente estudo pré-clínico teve como objetivo identificar novos biomarcadores moleculares em tumores embrionários agressivos do SNC e avaliar novas abordagens terapêuticas capazes de destruir as CTT. A análise de proteomica e sequenciamento de microRNAs (miRNAs) presentes em microvesículas (MVs) derivadas de quatro linhagens celulares de meduloblastoma (DAOY, CHLA-01-MED, D283-MED e USP13-MED) identificou 464 proteínas e 10 miRNAs comumente expressos nas células tumorais com superexpressão de OCT4A. O estudo global de interação dessas proteínas e miRNAs exclusivamente expressas nas MVs derivadas das células tumorais com maior agressivas revelaram alteração em vias de sinalização como ERK, PI3K/AKT/mTOR, EGF/EGFR, e principalmente vias envolvidas com a auto renovação de células-tronco embrionárias (CTE). Dentre os fatores encontrados expressos nas MVs derivadas de células com superexpressão de OCT4A, quatro proteínas (UBE2M, HNRNPCL2, HNRNPCL3, HNRNPCL4) e cinco miRNAs (miR-4449, miR-500b, miR-3648, miR-1291, miR-3607) não apresentam relatos de expressão em tecidos normais, plasma ou soro sanguíneo. O miR-367, importante para a manutenção do estado pluripotente em CTE, também apresentou aumento dos níveis de expressão nas MVs derivadas de linhagens celulares de tumores embrionários do SNC com superexpressão de OCT4A. A inibição do miR-367 diminuiu significativamente a proliferação e invasão celular, a atividade clonogênica e a capacidade de gerar neuroesferas em todas as linhagens celulares de tumores embrionários do SNC. Em modelo pré-clínico de camundongos Balb/C Nude submetido ao xenoenxerto de tumores embrionários com superexpressão de OCT4A, foi demostrado que injeções seriadas do miR-367 inhibitor diretamente no líquido cefaloraquidiano foram capazes de inibir a progressão tumoral e aumentar significativamente a sobrevida in vivo. Neste mesmo estudo, foi comprovado que o SUZ12, componente do complexo PRC2 envolvido com o silenciamento epigenético de fatores de pluripotência, incluindo o gene POU5F1 que codifica o OCT4A, é alvo direto do miR-367. Por fim, visto que o vírus ZIKA (ZIKV) infecta preferencialmente células progenitoras neurais (NPCs), enquanto neurônios não são susceptíveis a infecção, inibindo a proliferação das células alvo, como também induzindo a diferenciação prematura e morte por apoptose, o efeito oncolítico do ZIKV também foi avaliado em tumores embrionários do SNC cujas células tumorais apresentam propriedades de células-tronco. A ZIKV infectou seletivamente e causou morte celular nas células tumorais de origem neural, porém o mesmo não foi observado nas células oriundas de tumor humanos mais comuns como tumor próstata, colorretal e mama. Em ensaio de cultura 3D, o ZIKV foi capaz de destruir as esferas de tumores embrionários do SNC com mais eficiência quando comparadas com neuroesferas normais formadas a partir de NPCs. Em ensaio in vivo, uma única injeção intracerebroventricular contendo mil partículas virais do ZIKV brasileiro foi capaz de aumentar significativamente a sobrevida de camundongos com tumores embrionários de origem humana, diminuir o tamanho do tumor, os sítios metastáticos, e apresentar remissão completa do tumor em vários animais. Adicionalmente, células tumorais com fenótipo molecular similar às NPCs e com ativação anormal da via de sinalização Wnt apresentaram maior suscetibilidade aos efeitos oncolíticos do ZIKV. Portanto, ao realizar a modulação da via Wnt, foi observado uma alteração significativa na infecção e morte celular causada pelo ZIKV. Deste modo, podemos concluir que diversas proteínas e miRNAs foram encontradas presentes exclusivamente em MVs derivadas de células tumorais com superexpressão de OCT4A e poderiam ser utilizadas como biomarcadores de agressividade em meduloblastoma. Adicionalmente, os ensaios in vitro e in vivo evidenciaram o miR-367, envolvido na regulação da auto renovação de CTE, como oncomiR e possível alvo terapêutico no tratamento de tumores embrionários do SNC. Além disso, o ZIKV demostrou potente e seletivo efeito oncolítico nas células tumorais do SNC com caráter progenitor e apresentou níveis de infecção mais proeminente nas células com alta expressão basal de Wnt/β -catenina. Portanto, os resultados pré-clínicos encontrados no presente estudo evidenciam novos biomarcadores de células tumorais agressivas com perfil de células-tronco, que podem ser explorados em futuras pesquisas translacionais de refinamento do diagnóstico clínico, estratificação de pacientes, detecção precoce de recidiva tumoral, além de revelar novas abordagens terapêuticas direcionadas às CTTs, beneficiando os pacientes afetados com tumores embrionários do SNC cujas terapias convencionais não são efetivas / Embryonal tumors of central nervous system (CNS) are the most fatal pediatric tumors occurring in young children. Treatment of these aggressive CNS tumors may also result in serious long-term sequelae, affecting the patient\'s quality of life. Several studies have demonstrated that activation of genes encoding proteins typically expressed in stem cells, such as the pluripotency factor OCT4A, confers more primitive and aggressive features to tumor cells. These stem-like features in cancer cells are often associated with unfavorable clinical prognosis. The aim of this preclinical study was to identify new molecular markers of aggressive embryonal CNS tumor cells and evaluate new therapeutic approaches capable of killing these stem-like tumor cells of the CNS. The rationale of this study considered the existence of the so called cancer stem cells (CSC) and their contribution to tumor progression. Proteome analysis and miRNA sequencing of microvesicles (MVs) derived from four distinct medulloblastoma cell lines (DAOY, CHLA-01-MED, D283-MED, and USP13-MED) identified a common set of 464 proteins and 10 microRNAs associated with aggressive OCT4A-overexpressing tumor cells. The interactome mapping of these exclusive proteins and miRNAs revealed ERK, PI3K/AKT/mTOR, EGF/EGFR, and embryonic stem cell (ESC) self-renewal as the main oncogenic signaling pathways altered in these aggressive medulloblastoma cells. Of these MV cargos, four proteins (UBE2M, HNRNPCL2, HNRNPCL3, HNRNPCL4) and five miRNAs (miR-4449, miR-500b, miR-3648, miR-1291, miR-3607) have not been previously reported in MVs from normal tissues. The miR-367 was another new ESC-related miRNA found up-regulated in embryonal CNS tumor cells overexpressing OCT4A. Inhibition of miR-367 in these cells significantly reduced their proliferative and invasive behavior, clonogenic activity, and tumorsphere generation capability. Therapeutic targeting of miR-367 in vivo, through direct injections of a specific inhibitor in the cerebrospinal fluid (CSF) of Balb/C Nude mice bearing OCT4A-overexpressing tumor xenografts, inhibited tumor development and improved overall survival. miR-367 was also shown to target SUZ12, one of the core components of the PRC2 complex known to be involved in epigenetic silencing of pluripotency-related genes, including POU5F1 encoding OCT4A. Finally, considering that the Zika virus (ZIKV) prominently infects and kills neural stem and progenitor cells (NPCs), we also tested whether ZIKV would have the same effects in CNS embryonal tumors, given that these tumors are originated from NPC aberrations and are comprised by cells with neural stem cell-like features. When evaluating the oncolytic properties of Brazilian ZIKV strain against human breast, prostate, colorectal and embryonal CNS tumor cell lines, a selective infection of CNS tumor cells, followed by a massive tumor cell death, was verified. Notably, ZIKV was more efficient in destroying embryonal CNS tumorspheres than normal stem cell neurospheres. A single intracerebroventricular injection of ZIKV in BALB/c nude mice bearing orthotopic human embryonal CNS tumor xenografts resulted in significantly longer survival, decreased tumor burden, fewer metastasis and complete remission in some animals. Tumor cells closely resembling neural stem cells at the molecular level and with activated Wnt signaling were more susceptible to ZIKV oncolytic effects. Furthermore, modulation of Wnt signaling pathway significantly affected ZIKV-induced tumor cell death and viral shedding. In conclusion, several proteins and miRNA were identified exclusively in MVs from OCT4A-overexpressing tumor cells, which might serve as biomarkers of aggressive stem-like medulloblastoma cells. The miR-367 involved in ESC self-renewal displayed properties typical of oncomiRs as indicated by in vitro and in vivo assays, supporting its eligibility as a therapeutic target in embryonal CNS tumor cells. Also, ZIKV displayed potent and selective oncolytic effects toward human embryonal CNS tumor cells, at low infection rates. These effects were more prominent in tumors generated by neural stem-like cancer cells with high Wnt/β-catenin basal activity. Altogether, these preclinical findings open opportunities of future translational studies to evaluate new putative biomarkers of aggressive stem-like tumor cells in refining diagnosis, patient stratification, and early detection of relapsed disease, while also revealing novel therapeutic approaches targeting these stem-like tumor cells that could benefit patients affected by CNS tumors lacking effective treatment

Linfedema é uma condição crônica que predispõe a uma substancial morbidade e perda da função do órgão ou tecido afetado. Ele não tem cura e em longo prazo leva a dificuldades físicas e psicológicas ao paciente, tornando-se um grande desafio para os médicos. Infelizmente, é triste constatar que aproximadamente 400 anos após a descoberta dos vasos linfáticos, não há cura para o linfedema, sendo o tratamento baseado em drenagem linfática manual através de massagem e limitadas intervenções de fisioterapia, ambas visando redução do volume de edema, o que fornece alívio parcial para os indivíduos afetados que não garantem o desaparecimento da fibrose, aparentemente irreversível. Por isso, estudos que proporcionem novas intervenções, como a terapia celular com células-tronco, são de grande interesse. Neste trabalho tivemos como objetivo realizar terapia celular de linfedema murino utilizando células-tronco da membrana amniótica. Em um primeiro momento, a obtenção do modelo de insuficiência linfática foi feita com base em Tabibiazar et al., 2006 onde uma microablação de 2 mm em toda a circunferência foi feita na cauda do animal. Entretanto, após 30 dias de indução uma regressão espontânea foi observada inviabilizando a utilização deste modelo. Após vasta pesquisa na literatura outro modelo de indução de linfedema (Shimizu et al., 2012) foi encontrado, onde os autores fazem uma microablação cirúrgica, mantendo um flap de 4 mm na região ventral. Neste trabalho os autores obtiveram um linfedema estável por no mínimo 30 dias. Com base nestes achados, o modelo de linfedema murino induzido baseado em Shimizu foi realizado e após a comprovação desta estabilidade por 60 dias, esse modelo foi utilizado para indução do linfedema. Após esta caracterização, os animais que tiveram o linfedema induzido foram submetidos a terapia celular utilizando 0,5X106 células-tronco da membrana amniótica humana (MAh) ou saco vitelino canino (SVc) no momento da indução. Animais sem lesão, com lesão (SHAM) e tratados apenas com solução fisiológica (placebo) também foram analisados. O monitoramento do linfedema na cauda foi feito através de acompanhamento clínico, registro fotográfico e mensura do diâmetro caudal a cada 2-3 dias. Ao final do estudo, os animais foram eutanasiados, tiveram suas caudas removidas e foram submetidos a avaliação dos efeitos terapêuticos da terapia celular através de análise do exsudato, análises histológicas (HE, picrossírius) e imuno-histoquímicas. A histológica obtida por coloração de HE além de apresentar o melhor resultado quando comparado com as demais técnicas, possibilitou avaliar as alterações patológicas pertinentes de cada amostra, revelando efeitos benéficos da terapia quando comparados com SHAM e placebo. Já, a coloração Picrossírius permitiu visualizar além das alterações estruturais, a inversão da predominância da expressão de colágeno do tipo I, por colágeno do tipo III nos tecidos estruturalmente comprometidos. O resultado do conjunto de análises das amostras apresentou o padrão linfedematoso esperado para os grupos SHAM e placebo, porém também mostrou um processo inflamatório muito menor e mais curto nos grupos MAh, e SVc, permitindo sugerir que a terapia celular causou um impacto favorável e os animais apresentaram resultados muito próximos aos padrões exibidos pelo grupo controle. / Lymphedema is a chronic condition, which predisposes to substantial morbidity and loss of function of the affected organ or tissue. It has no cure and, in the long term, leads patients to physical and psychological problems, which is a major challenge for doctors. Unfortunately, it is sad to realize that, approximately 400 years after the discovery of the lymphatic vessels, there is no cure for lymphedema. The treatment is based on manual lymphatic drainage through massage and limited physiotherapy interventions. Both techniques aim at reducing the volume of the edema, which provides partial relief for affected individuals, but do not guarantee the disappearance of the fibrosis, which is, apparently, irreversible. Therefore, studies that provide new interventions, such as stem cell therapy, are of great interest. In this study, we carried out induced murine lymphedema using human amniotic membrane stem cells. At first, we obtained the model of lymphatic insufficiency based on Tabibiazar et al., 2006, in which a 2 mm microablation throughout the circumference was made in the tail of the animal. However, after 30 days of induction, a spontaneous regression was observed, making this model unusable. After extensive literature research, another model of lymphedema induction (Shimizu et al., 2012) was found. In this model, the authors perform a surgical microablation, maintaining a 4 mm flap in the ventral region. The authors obtained stable lymphedema for at least 30 days. Based on these findings, the model of induced murine lymphedema, based on Shimizu et al., 2012, was performed and, after proving this stability for 60 days, this model was used for the induction of murine lymphedema. After this characterization, the animals that have had induced lymphedema were subjected to cell therapy using 0.5X106 human amniotic membrane stem cells (MAh) or canine yolk sac (SVc) at the time of induction. Animals without lesion, with lesion (SHAM) and treated only with solution were also analyzed. The monitoring of lymphedema in the tail was done through clinical follow-up, photographic record and caudal diameter measurement every 2-3 days. At the end of the study, the animals were euthanized, had their tails removed, and were subjected to evaluation of the therapeutic effects of the cell therapy through exudate analysis, histological analysis (HE, picrosirius) and immunohistochemistry analysis. The histological obtained by HE staining, besides presenting the best result when compared to the other techniques, allowed to evaluate the pertinent pathological alterations of each sample, revealing beneficial effects of the therapy when compared to SHAM and placebo. Picrosirius staining allowed to visualize, in addition to the structural alterations, the reversal of the predominance of type I collagen expression by type III collagen in structurally compromised tissues. The result of the sample analysis showed the expected lymphomatoid pattern for the SHAM and placebo groups, but also showed a much shorter and shorter inflammatory process in the MAh and SVc groups, suggesting that the cell therapy had an impact and the animals presented results very close to the standards presented by the control group.

Linfedema é uma condição crônica que predispõe a uma substancial morbidade e perda da função do órgão ou tecido afetado. Ele não tem cura e em longo prazo leva a dificuldades físicas e psicológicas ao paciente, tornando-se um grande desafio para os médicos. Infelizmente, é triste constatar que aproximadamente 400 anos após a descoberta dos vasos linfáticos, não há cura para o linfedema, sendo o tratamento baseado em drenagem linfática manual através de massagem e limitadas intervenções de fisioterapia, ambas visando redução do volume de edema, o que fornece alívio parcial para os indivíduos afetados que não garantem o desaparecimento da fibrose, aparentemente irreversível. Por isso, estudos que proporcionem novas intervenções, como a terapia celular com células-tronco, são de grande interesse. Neste trabalho tivemos como objetivo realizar terapia celular de linfedema murino utilizando células-tronco da membrana amniótica. Em um primeiro momento, a obtenção do modelo de insuficiência linfática foi feita com base em Tabibiazar et al., 2006 onde uma microablação de 2 mm em toda a circunferência foi feita na cauda do animal. Entretanto, após 30 dias de indução uma regressão espontânea foi observada inviabilizando a utilização deste modelo. Após vasta pesquisa na literatura outro modelo de indução de linfedema (Shimizu et al., 2012) foi encontrado, onde os autores fazem uma microablação cirúrgica, mantendo um flap de 4 mm na região ventral. Neste trabalho os autores obtiveram um linfedema estável por no mínimo 30 dias. Com base nestes achados, o modelo de linfedema murino induzido baseado em Shimizu foi realizado e após a comprovação desta estabilidade por 60 dias, esse modelo foi utilizado para indução do linfedema. Após esta caracterização, os animais que tiveram o linfedema induzido foram submetidos a terapia celular utilizando 0,5X106 células-tronco da membrana amniótica humana (MAh) ou saco vitelino canino (SVc) no momento da indução. Animais sem lesão, com lesão (SHAM) e tratados apenas com solução fisiológica (placebo) também foram analisados. O monitoramento do linfedema na cauda foi feito através de acompanhamento clínico, registro fotográfico e mensura do diâmetro caudal a cada 2-3 dias. Ao final do estudo, os animais foram eutanasiados, tiveram suas caudas removidas e foram submetidos a avaliação dos efeitos terapêuticos da terapia celular através de análise do exsudato, análises histológicas (HE, picrossírius) e imuno-histoquímicas. A histológica obtida por coloração de HE além de apresentar o melhor resultado quando comparado com as demais técnicas, possibilitou avaliar as alterações patológicas pertinentes de cada amostra, revelando efeitos benéficos da terapia quando comparados com SHAM e placebo. Já, a coloração Picrossírius permitiu visualizar além das alterações estruturais, a inversão da predominância da expressão de colágeno do tipo I, por colágeno do tipo III nos tecidos estruturalmente comprometidos. O resultado do conjunto de análises das amostras apresentou o padrão linfedematoso esperado para os grupos SHAM e placebo, porém também mostrou um processo inflamatório muito menor e mais curto nos grupos MAh, e SVc, permitindo sugerir que a terapia celular causou um impacto favorável e os animais apresentaram resultados muito próximos aos padrões exibidos pelo grupo controle. / Lymphedema is a chronic condition, which predisposes to substantial morbidity and loss of function of the affected organ or tissue. It has no cure and, in the long term, leads patients to physical and psychological problems, which is a major challenge for doctors. Unfortunately, it is sad to realize that, approximately 400 years after the discovery of the lymphatic vessels, there is no cure for lymphedema. The treatment is based on manual lymphatic drainage through massage and limited physiotherapy interventions. Both techniques aim at reducing the volume of the edema, which provides partial relief for affected individuals, but do not guarantee the disappearance of the fibrosis, which is, apparently, irreversible. Therefore, studies that provide new interventions, such as stem cell therapy, are of great interest. In this study, we carried out induced murine lymphedema using human amniotic membrane stem cells. At first, we obtained the model of lymphatic insufficiency based on Tabibiazar et al., 2006, in which a 2 mm microablation throughout the circumference was made in the tail of the animal. However, after 30 days of induction, a spontaneous regression was observed, making this model unusable. After extensive literature research, another model of lymphedema induction (Shimizu et al., 2012) was found. In this model, the authors perform a surgical microablation, maintaining a 4 mm flap in the ventral region. The authors obtained stable lymphedema for at least 30 days. Based on these findings, the model of induced murine lymphedema, based on Shimizu et al., 2012, was performed and, after proving this stability for 60 days, this model was used for the induction of murine lymphedema. After this characterization, the animals that have had induced lymphedema were subjected to cell therapy using 0.5X106 human amniotic membrane stem cells (MAh) or canine yolk sac (SVc) at the time of induction. Animals without lesion, with lesion (SHAM) and treated only with solution were also analyzed. The monitoring of lymphedema in the tail was done through clinical follow-up, photographic record and caudal diameter measurement every 2-3 days. At the end of the study, the animals were euthanized, had their tails removed, and were subjected to evaluation of the therapeutic effects of the cell therapy through exudate analysis, histological analysis (HE, picrosirius) and immunohistochemistry analysis. The histological obtained by HE staining, besides presenting the best result when compared to the other techniques, allowed to evaluate the pertinent pathological alterations of each sample, revealing beneficial effects of the therapy when compared to SHAM and placebo. Picrosirius staining allowed to visualize, in addition to the structural alterations, the reversal of the predominance of type I collagen expression by type III collagen in structurally compromised tissues. The result of the sample analysis showed the expected lymphomatoid pattern for the SHAM and placebo groups, but also showed a much shorter and shorter inflammatory process in the MAh and SVc groups, suggesting that the cell therapy had an impact and the animals presented results very close to the standards presented by the control group.

Submitted by biblioteca unifenas (biblioteca@unifenas.br) on 2018-03-05T22:12:22Z No. of bitstreams: 1 Sávio Carneiro Martins Dissertacao.pdf: 1917056 bytes, checksum: 1e6b06de6f8c419963c162ad0230fffa (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-05T22:12:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sávio Carneiro Martins Dissertacao.pdf: 1917056 bytes, checksum: 1e6b06de6f8c419963c162ad0230fffa (MD5) Previous issue date: 2015-03-30 / Due to the importance of in vitro embryo production (IVEP) to accelerate genetic improvement is important the search for technological innovation that can enhance the in vitro embryo development. Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) have been widely used as a feeder layer to support embryonic stem cells due to their release of growth factors. Mesenchymal stem cells (MSCs) from different sources were also found to release bioactive factors that can support cell growth. This study aims to investigate the effect of co-culture of MSC from rat bone marrow or MEF as a feeder source for in vitro production of bovine embryos. Cumulus oophorus complexes were matured into three groups: control (CTRL), co-culture with monolayer of mesenchymal cells of rats (MSC) or co-cultured with monolayer of embryonic fibroblasts of mice (MEF). Fertilization was performed in control condition for all groups, and in vitro fertilized embryos were cultured from fourth day on in CTRL, co-culture with MSC or co-cultured with MEF, so that the following groups were performed: (CTRL / CTRL) - maturation and embryo development in CTRL conditions; (CTRL / MSC) - maturation in CTRL and embryo development with MSC from the fourth day on after the beginning of the in vitro embryo culture; (CTRL / MEF) - maturation CTRL and embryo development with MEF from the fourth day on after the beginning of the in vitro embryo culture; (MSC / CTRL) - MSC during maturation and embryo development in CTRL; (MSC / MSC) - maturation and embryo development in MSC from the fourth day on after the beginning of the in vitro embryo culture; (MEF / CTRL) - maturation and embryo development in MEF and CTRL (MEF / MEF) - maturation and embryo development in MEF from the fourth day on after the beginning of embryo development in vitro. No significant difference was found among the oocytes matured in CTRL, MSC and MEF conditions for metaphase II and apoptosis rates and for cleavage rate in embryos at 4th day after the beginning of the in vitro culture. The number of cells in the inner cell mass, trophoblast cells, apoptotic cells and total cells were similar (P> 0.05) in the embryos from all experimental groups. The rates of blastocyst formation, expanded, hatched and the total of blastocysts did not differ among experimental groups (P> 0.05) at 7th day of embryo development. At eighth day of embryo culture we observed a difference (P <0.05) in hatched blastocyst rate which was higher in the CTRL /CTRL group when compared to MSC/MSC group, however, the proportion of blastocyst, expanded and total blastocysts was not different (P> 0.05). We conclude that there was no significant improvement in bovine embryo development using co-cultures of MSC from rats or MEF when compared to control culture system. However more studies investigating the use of stem cells from other sources or their conditioned medium are needed to better understand the effect of these cells on embryonic development. / Diante da importância da produção in vitro de embriões (PIVE) na expansão do melhoramento genético, é importante a busca de inovações tecnológicas que possam potencializar o desenvolvimento embrionário in vitro. Fibroblastos embrionários de camundongo (MEFs) têm sido amplamente utilizados como camada alimentadora para suportar as células-tronco embrionárias, devido à sua liberação de fatores de crescimento. As células-tronco mesenquimais (MSCs) identificadas a partir de diferentes fontes, também liberam fatores bioativos que possam suportar o crescimento celular. Este estudo tem como objetivo investigar o efeito da co-cultura de MSC de medula óssea de rato ou MEF como fonte alimentadora na produção in vitro de embriões bovinos. Complexo cumulus oophorus foram maturados em três grupos distintos: Controle (CTRL), co-cultura com monocamada de células mesenquimais de ratos (MSC) ou co-cultura com monocamada de fibroblastos embrionários de camundongos (MEF). A fecundação foi realizada em condição controle para todos os grupos e os embriões fecundados in vitro foram também cultivados a partir do quarto dia em CTRL, co-cultura com MSC ou co-cultura com MEF, formando os seguintes grupos experimentais: (CTRL/CTRL) – maturação e cultivo embrionário em condições CTRL; (CTRL/MSC) – maturação em CTRL e cultivo embrionário em MSC a partir do quarto dia após o início do cultivo embrionário in vitro; (CTRL/MEF) – maturação em CTRL e cultivo embrionário em MEF a partir do quarto dia após o início do cultivo embrionário in vitro; (MSC/CTRL) – maturação em MSC e cultivo embrionário em CTRL; (MSC/MSC) – maturação e cultivo embrionário em MSC a partir do quarto dia após o início do cultivo embrionário in vitro; (MEF/CTRL) – maturação em MEF e cultivo embrionário em CTRL e (MEF/MEF) – maturação e cultivo embrionário em MEF a partir do quarto dia após o início do cultivo embrionário in vitro. Nenhuma diferença significativa foi encontrada entre os oócitos dos grupos CTRL, MSC e MEF, na taxa de estruturas em metáfase II, apoptose e clivagem nos embriões de 4 dias após o início do cultivo in vitro. O número de células da massa celular interna, células do trofoblasto, células em apoptose e células totais foram iguais (P>0,05) entre os embriões dos diferentes grupos experimentais. As taxas de embriões em estágio de blastocisto, blastocisto expandido, blastocisto eclodido e blastocistos totais dos grupos experimentais não se diferiram (P>0,05) no sétimo dia de cultivo embrionário. No oitavo dia de cultivo embrionário houve diferença (P<0,05) da taxa de blastocisto eclodido, sendo maior no grupo CTRL/CTRL quando comparado ao grupo MSC/MSC; no entanto, a proporção de blastocisto, blastocisto expandido e blastocistos totais não foram diferentes (P>0,05) entre os grupos experimentais. Concluímos que não houve melhora significativa no desenvolvimento embrionário bovino utilizando co-culturas com MSC de ratos ou MEF de camundongos, quando comparado com sistema de cultura controle. Entretanto, mais estudos investigando o uso de células-tronco de outras fontes ou seu meio condicionado são necessários para se entender melhor o efeito destas células no desenvolvimento embrionário.