El desenvolupament post-embrionàri dels insectes està controlat per dos hormones, les esteroidals i l’hormona juvenil (HJ). La 20-hidroxiecdisona (20E), és la principal hormona esteroidal dels insectes, indueix i controla el procés de la muda. En canvi, l’HJ determina la naturalesa d’aquesta muda. En presencia d’HJ, el pic de 20E produeix una muda entre estadis juvenils. En canvi, quan desapareix l’HJ, la 20E indueix una muda a l’estadi adult. A nivell molecular, la 20E actua mitjançant la unió a un heterodímer format per dos membres de la família dels receptors nuclears, el receptor d'ecdisona (EcR) i ultraespiracle (USP). El receptor activat inicia una cascada gènica de resposta a la 20E coneguda com a model d’Ashburner. Els gens activats per la 20E són principalment receptors nuclears, com ara E75, HR3, HR4 i Ftz-F1 i factors de transcripció, E74 o BR-C. Aquest via de senyalització ha estat àmpliament estudiada en insectes holometàbols com D.melanogaster, pel contrari, la caracterització dels mecanismes moleculars d'acció dels ecdisteroides en els insectes hemimetàbols, o de desenvolupament directe, és pràcticament inexistent. La caracterització de la funció i mecanismes d’acció d’aquestes hormones en insectes hemimetàbols permetrà entendre els canvis que s’han produït en aquestes vies que han permès l’evolució fins a una metamorfosi completa. La panerola Blattella germanica s'utilitza com a model per estudiar el desenvolupament, hemimetàbol. Prèviament, i amb l'objectiu d'estudiar la cascada gènica de resposta a la 20E a B. germanica, s'han clonat i caracteritzat els dos membres del receptor de la 20E en aquest insecte (BgEcR-A i BgRXR) i els receptors nuclears BgE75, BgHR3, BgHR4 i BgFTZ-F1 i el factor de transcripció Br-C. Gràcies al silenciament de l'expressió gènica mitjançant RNAi in vivo s'han pogut estudiar les funcions d'aquests gens, i s'ha demostrat l’existència d’un eix gènic que regula els processos controlats per la 20E. En la present tesi doctoral s’ha clonat i caracteritzat l’últim gens primerenc que manca a B.germanica, el factor de transcripció E74. A més, també s’ha clonat i caracteritzat Seven Up, un receptor nuclear que regula la via de senyalització de la 20E en insectes holometàbols. Així, s’ha clonat dos isoformes d’E74 anomenades BgE74A i BgE74B i s’ha demostrat que són necessàries per tal que es produeixi correctament l’ècdisi. La interferència d’aquest factor durant la darrera fase nimfal produeix problemes greus en el desplegament de les ales i tegmines, en la integritat de les quetes i en les estructures d’adhesió i afecta el procés de pigmentació. L’enzim dopa decarboxilasa (BgDdc) està implicat en pigmentació i la seva interferència durant la sisena fase nimfal fa que emergeixin adults amb pigmentació més clara. BgE74 és necessari perquè BgDdc s’expressi correctament. S’han clonat dos isoformes del receptor nuclear Seven up: BgSvpA i BgSvpB. Les seves funcions no són redundants. BgSvpB regula la síntesi d’HJ en els corpora allata durant l’estadi adult de B.germanica a traves de la regulació de dos gens claus de la via, BgHMG-S i BgHMG-R. A més, BgSvpB és necessari per al desenvolupament dels corpora allata durant la darrera fase nimfal. La interferència del receptor nuclear produeix una clara disminució en la divisió cel•lular dels corpora allata durant la darrera fase nimfal. Aquestes dues funcions de BgSvpB s’ha demostrat que són independents. / In insects, post-embryonic development is under the control of ecdysteroids and juvenile hormones. At the molecular level, 20-hydroxyecdysone (20E) acts through binding to its receptor, a heterodimer of the ecdysone receptor (EcR) and Ultraspiracle (USP). Both proteins belong to the nuclear receptor family. Once 20E binds to its receptor, activates a subset of genes that mediate and amplify the hormonal response. The mechanism of action of ecdysteroids in hemimetabolan insects is poorly understood. To study at the molecular level the 20E response, the Ecdysone receptor (BgEcR-BgRXR), and the nuclear receptors, BgHR3, BgFTZ-F1, BgHR4 and E75A-D of the hemimetabolan insect Blattella germanica have been cloned and characterized using RNAi in vivo. Here, first we report the cloning of two isoforms of E74 from the hemimetabolous direct developing insect Blattella germanica, namely BgE74A and BgE74B. Although BgE74 knockdown nymphs ecdysed properly into adults, they all showed clear deficiencies in the extension of the fore- and hindwings, as well as malformations in their leg bristles and locomotor structures. In addition to the described morphological abnormalities, all BgE74 knockdown nymphs that molted into adults presented defects in the cuticle pigmentation. The expression of BgDdc, an enzyme involved in insect cuticle pigmentation, was reduced in the BgE74 knockdowns. Secondly, we have cloned and characterized two isoforms of Seven-up, another nuclear receptor involved in 20E response in Drosophila, and named them BgSvpA and BgSvpB. Surprisingly, using RNAi in vivo we show that BgSvpB is not related with 20E action but is necessary to produce juvenile hormone (JH) in the corpora allata during the adult stage, through the regulation of two key enzims of JH biosynthesis, BgHMG-S and BgHMG-R. Moreover, BgSvpB is required for cell proliferation of the corpora allata during nymphal development.

En los insectos, las diferentes transiciones que se producen a lo largo del desarrollo, tanto embrionario como post-embrionario, se encuentran reguladas por pulsos de ecdisteroides, en particular por la 20 hidroxiecdisona (20E). Esta señal se transduce mediante factores de transcripción de la família de los receptores nucleares, en concreto, la 20E se une al heterodímero formado por el receptor de la ecdisona (EcR) y el producto del gen ultraespiraculo (USP) y, una vez unida, activa una pequeña serie de genes tempranos, que, a su vez, amplifican esta señal mediante la inducción de los denominados genes tardíos que controlan la respuesta biológica a la hormona. Dentro de esta cascada génica, cabe destacar el eje funcional formado por los receptores nucleares EcR-HR3-FTZ F1 el cual interviene en la coordinación de las mudas larvarias, así como en el inicio de la metamorfosis en Drosophila melanogaster. Es importante subrayar que no se conoce si la jerarquía de factores nucleares inducidos por la 20E también existe y opera en insectos más primitivos con un desarrollo hemimetábolo como es nuestro insecto modelo Blattella germanica. En la presente tesis doctoral iniciamos la caracterización del eje funcional EcR-HR3-FTZ F1 en el dictióptero Blattella germanica. Así pues, hemos llevado a cabo el clonaje de los ortólogos de los receptores nucleares HR3 y FTZ-F1 en B. germanica obteniendo tres isoformas de HR3 (BgHR3 A, BgHR3 B1 y BgHR3 B2) y dos de FTZ F1 (BgFTZ F1A y BgFTZ F1B). Hemos caracterizado los patrones de expresión de estos transcritos y del receptor de la ecdisona (BgEcR A), que se había clonado previamente en nuestro laboratorio, en las dos últimas fases ninfales así como durante la embriogénesis de B. germanica. Además, analizamos el papel regulador que estos receptores nucleares desempeñan durante el desarrollo ninfal de B. germanica, y especialmente en el proceso de la muda. Para ello, hemos utilizado la técnica del RNA de interferencia (RNAi) in vivo mediada por la inyección intraabdominal de RNAs de doble cadena (dsRNA) de cada uno de los genes a estudiar. Cuando estos dsRNAs eran inyectados en hembras recién emergidas a sexto estadio ninfal, la mayoría de las ninfas interferidas no eran capaces de completar la écdisis y morían transcurridas 24-48 h. El análisis fenotípico de estos individuos mostró que presentaban duplicación de las estructuras de origen ectodérmico y que presentaban alteraciones en los niveles de ecdisteroides hemolinfáticos. No obstante, un cierto porcentaje de las ninfas tratadas con dsBgEcR A y dsBgFTZ F1 eran capaces de completar la muda imaginal, esto nos permitió estudiar procesos que se ven afectados por estos dos factores de transcripción durante la vida adulta. Los individuos interferidos con dsBgEcR A que mudaban a adulto presentaban claros defectos en la extensión de los dos pares de alas, por su parte, las ninfas tratadas con dsBgFTZ F1 también presentaban alas mal posicionadas, aunque correctamente extendidas. El segundo fenotipo observado en todos los individuos tratados con dsBgEcR A y dsBgFTZ F1 que mudaban a adulto es que la glándula protorácica no degeneraba. Ampliamos el análisis funcional de cada uno de los receptores nucleares que estamos analizando, BgEcR A, BgHR3 y BgFTZ F1 al periodo embrionario de B. germanica. El análisis de los embriones interferidos para BgEcR A y BgFTZ F1 mostró que estos individuos progresaron hasta las 48 h de desarrollo embrionario, presentando, sin embargo, considerables malformaciones que impidieron su posterior desarrollo. Mientras que aquellos que eran silenciados para BgHR3, que fueron capaces de progresar hasta las 96 h de desarrollo, presentaron defectos en el desarrollo de la región cefálica, desde un nivel poco severo en el que únicamente se apreció una cierta reducción o pérdida de los lóbulos cefálicos hasta embriones que presentaban la pérdida de todos los segmentos cefálicos. / Ecdysteroids control molting in insects. The active form of ecdysteroids, 20 hydroxyecdisone (20E), exerts its function through the activation of a small set of transcription factors. In turn, these genes induce the expression of a larger set of other genes that control the biological response to the hormone. The orphan nuclear receptors EcR, HR3 and FTZ F1 have been shown to act as crucial members of the 20E-regulatory hierarchy in coordinating molting in the holometabolous insects Drosophila melanogaster and Manduca sexta. However, little is known on the role of these factors on primitive insects. Here, we report the cloning and characterization of BgHR3 and BgFTZ F1 in the hemimetabolous species Blattella germanica. Moreover, we use in vivo RNAi mediated by double-strand RNA (dsRNA) treatment to define BgEcR A, BgHR3 and BgFTZ F1 functions during molting in B. germanica. When dsRNAs were injected at the beginning of the last larval instar, treated larvae had normal appearance and movements until the end of the instar. However, by the molting time most of them did not molt, became motionless and became arrested. Phenotypic analysis reveal that treated specimens had two pairs of mouth appendages, double tubular tracheae and produce a new cuticle. Moreover, the dsBgHR3-treated animals have higher ecdysteroids levels, whereas those of dsBgEcR A and dsBgFTZ F1-treated are lower than controls. Some of the nymphs treated with dsBgEcR A and dsBgFTZ F1 progressed through a complete molting. Interestingly, these knockdowns showed defects in wing extension and the prothoracic gland did not degenerated. Also, we have studied BgEcR A, BgHR3 and BgFTZ F1 functions during B. germanica embryogenesis. Using RNAi parental we found that dsBgEcR-A and dsBgFTZ-F1 treated animals progress up to the 12% of development and resulted in germ bands showing severe phenotypes. While, those interfered with dsBgHR3 could progress up to the 25% of development but they shown defects in the cephalic regions which ranged in severity from reduction or loss of cephalic lobes to the complete loss of the cephalic segments.

El desenvolupament post-embrionàri dels insectes està controlat per les hormones esteroidees, les quals regulen les transicions entre les diferents etapes de que consta el seu cicle vital. En els insectes holometàbols, o de metamorfosi completa, un augment en els nivells de 20-hidroxiecdisona (20E, la forma activa dels ecdisteroides) senyalitza la muda a la següent fase larvària. Així mateix, un altre increment de 20E senyalitza l'entrada a la fase de pupa. A més, la presència de 20E durant la metamorfosi indueix la destrucció dels teixits larvàris i la formació de les estructures adultes. A nivell molecular, la 20E actua mitjançant la unió a un heterodímer format per dos membres de la família dels receptors nuclears, el receptor d'ecdisona (EcR) i ultraespiracle (USP). El receptor activat inicia una cascada gènica de resposta a la 20E que media i amplifica el senyal ecdisteroidal. Els gens activats per la 20E són factors de transcripció com E74 o BR-C i numerosos receptors nuclears.Pel contrari, la caracterització dels mecanismes moleculars d'acció dels ecdisteroides en els insectes hemimetàbols, o de desenvolupament directe, es pràcticament inexistent. En aquests insectes, el creixement i la maduració es donen simultàneament al llarg de successives fases nimfals. La panerola Blattella germanica s'utilitza com a model per estudiar aquest tipus de desenvolupament, el que permetrà entendre les bases moleculars de l'evolució de la metamorfosi.Prèviament, i amb l'objectiu d'estudiar la cascada gènica de resposta a la 20E a B. germanica, s'han clonat i caracteritzat els dos membres del receptor de la 20E en aquest insecte (BgEcR-A i BgRXR) i els receptors nuclears BgHR3 i BgFTZ-F1. Gràcies al silenciament de l'expressió gènica mitjançant RNAi in vivo s'han pogut estudiar les funcions d'aquests gens, i s'ha vist la seva implicació en els processos regulats per la 20E.En la present tesi doctoral s'han clonat i caracteritzat dos nous membres de la família dels receptors nuclears implicats en la resposta a la 20E, BgE75 i BgHR4. S'ha demostrat l'existència d'un eix gènic format pels receptors nuclears BgE75, BgHR3, BgHR4 i BgFTZ-F1, i s'ha vist que aquests factors presenten uns patrons d'expressió característics i repetitius al llarg del desenvolupament de B. germanica. En segon lloc, s'ha observat que la 20E regula de manera directe l'expressió de BgHR4 i de totes les isoformes de BgE75, excepte BgE75D.Mitjançant RNAi in vivo s'ha pogut estudiar la funció de BgE75 i s'ha comprovat que les diferents isoformes de BgE75 actuen de manera redundant. A més, BgE75 és indispensable pel desenvolupament nimfal d'aquesta panerola. La interferència de BgE75 durant la última fase nimfal resulta en la degeneració prematura de la glàndula protoràcica, el teixit encarregat de sintetitzar ecdisteroides. Com a conseqüència aquestes nimfes tenen una deficiència en els nivells d'ecdisteroides circulants la qual cosa els impedeix mudar a la fase adulta. Remarcablement, les nimfes interferides per BgE75 no muden, però inicien el programa genètic propi de la fase adulta.Per la seva banda, el receptor nuclear BgHR4 també és necessari pel desenvolupament nimfal de B. germanica, concretament en el procés d'ècdisi al final de les fases nimfals. Aquest efecte el produeix a dos nivells, induint l'expressió de BgFTZ-F1 i inhibint, a la vegada, l'expressió de BgE75.Per últim, hem demostrat l'efecte antiapoptòtic de la hormona juvenil durant el desenvolupament nimfal de B. germanica. Es necessari que la Hormona Juvenil estigui absent durant la última fase nimfal perquè l'eix gènic format pels receptors nuclears BgE75, BgHR3, BgHR4 i BgFTZ-F1 indueixi la degeneració de la glàndula protoràcica en la transició nimfa-adult. / In insects, post embryonic development is under control of ecdysteroids. At the molecular level, 20-hydroxyecdysone (20E) acts through binding to its receptor, a heterodimer of the ecdysone receptor (EcR) and Ultraspiracle (USP). Both proteins belong to the nuclear receptor family. Once 20E binds to its receptor, the complex activates directly a subset of 20E-induced genes that mediate and amplify the response to this hormone.However, the mechanism of action of ecdysteroids in direct developing insects is poorly understood. To study at the molecular level the 20E response, the Ecdysone receptor (BgEcR-BgRXR), and the nuclear receptors, BgHR3 and BgFTZ-F1, of the direct developing insect B. germanica have been cloned and characterized using RNAi in vivo. In this thesis we have cloned and characterized BgE75 and BgHR4, two nuclear receptors involved in the 20E response. We demonstrate the presence of a genic cascade composed by the nuclear receptors BgE75-BgHR3-BgHR4 and BgFTZ-F1. These genes have a characteristic and repetitive patern of expresion during B. germanica development. We also demonstrate that 20E activates directly BgHR4 and all the BgE75 isoforms except BgE75D. Using RNAi in vivo we show that BgE75 is necessary during post embryonic development and we prove that the different isoforms of BgE75 act in a redundant way. Knocking down BgE75 in the last nymphal instar we observe a premature degeneration of the prothoracic gland, the tissue responsible for the synthesis of ecdysteroids. As a consequence, the circulant ecdysteroids are low, and the knockdown nymphs can not molt into the adult stage. Remarcably these knockdown nymphs initiate the adult genetic program although they are unable to molt.BgHR4 nuclear receptor is also necessary for B. germanica nymphal development, specifically during ecdysis at the end of each nymphal instar. This effect is caused because BgHR4 induces BgFTZ-F1 expression and, at the same time, represses BgE75.Finally we have shown the antiapoptotic effect of the Juvenile Hormone (JH) during the nymphal development of B. germanica. JH must be absent during the last nymphal instar to allow the BgE75-BgHR3-BgHR4-BgFTZ-F1 hierarchy to induce prothoracic gland degeneration during the nymphal-adult transition.

Pluripotent cells are unique due to their developmental potential and the possibility to study them is the key step to understand human development. These cells are characterized by their ability to originate all the cellular lineages within an adult organism. Within embryonic milieu, pluripotent cells represent a dynamic fraction of the total cell number. Moreover, their physiological existence is constrained to early stages of embryonic development. In vitro culture of the different types of mammalian pluripotent cells, and singularly embryonic stem cells (ESC), enables the characterization of the pluripotent state. In the four articles included in this thesis we have addressed two different aspects of the molecular characterization of mammalian pluripotent cells. First, we investigated the establishment of the trophectoderm and the inner cell mass in the embryo measuring transcript abundance and protein presence of the transcription factors known to play a role in the earliest cellular differentiation process. In addition we have evaluated of genomic stability of human ESC lines during long-term culture, observing the accumulation of sukaryotypic aberrations such as loss of heterozygosity that affect loci comprising genes involved in genomic stability maintenance. We also checked the genomic status of two human ESC lines derived from embryos that had been diagnosed as abnormal after genetic preimplantation diagnosis (PGD). The molecular analysis of these cells ruled out the hypothesized self-correction of the aneuploidies between the PGD and the establishment of the cell lines. / Les cèl·lules pluripotents són úniques atesa la seva plasticitat durant el desenvolupament i la possibilitat d'estudiar-les és un pas essencial per poder comprendre el desenvolupament embrionari. Aquestes cèl·lules es caracteritzen per la seva habilitat per donar lloc a tots els llinatges cel·lulars de l'organisme. Dins de l'embrió, les cèl·lules pluripotents representen una fracció dinàmica del nombre total de cèl·lules i la seva existència fisiològica està constreta a els estadis més primerencs del desenvolupament embrionari. El cultiu in vitro dels diferents tipus de cèl·lules pluripotents en mamífers, i en especial les cèl·lules mare embrionàries, permet la caracterització d'aquest estat cel·lular. En els quatre capítols inclosos en aquesta tesi, hem tractat dos aspectes diferents de la caracterització molecular de les cèl·lules pluripotents. Primer, hem investigat l'establiment del trofectoderm i de la massa cel·lular interna en l'embrió mesurant l'abundància dels trànscrits i la presència de proteina dels factors de transcripció implicats en el primer process de diferenciació cel·lular conegut. A més, hem avaluat l'estabilitat genòmica de dues línies de cèl·lules mare en cultiu durant més de 40 passis. Com a resultat, hem observat l'acumulació de aberracions genòmiques a nivell subcariotípic, en especial pèrdua d'heterozigositat que afecta a locus que contenen gens implicats en el manteniment de l'estabilitat genòmica. També hem comprovat l'estatus genòmic de dos linies de cèl·lules mare embrionàries humanes derivades a partir d'embrions trobats aneuploids per un diagnòstic genètic preimplantacional. L'anàlisi molecular d'aquestes cèl·lules va descartar la hipòtesi d'una autocorrecció de les aneuploidies detectades entre el diagnòstic preimplantacional i la derivació de les línies a partir d'aquests embrions.