No description available.

No description available.

No description available.

No description available.

No description available.

No / Prolonged hyperglycaemia impairs vascular reactivity and inhibits voltage-activated K+ (Kv) channels. We examined acute effects of altering glucose concentration on the activity and inhibition by endothelin-1 (ET-1) of Kv currents of freshly isolated rat arterial myocytes. Peak Kv currents recorded in glucose-free solution were reversibly reduced within 200 s by increasing extracellular glucose to 4 mm. This inhibitory effect of glucose was abolished by protein kinase C inhibitor peptide (PKC-IP), and Kv currents were further reduced in 10 mm glucose. In current-clamped cells, membrane potentials were more negative in 4 than in 10 mm glucose. In 4 mmd-glucose, 10 nm ET-1 decreased peak Kv current amplitude at +60 mV from 23.5 ± 3.3 to 12.1 ± 3.1 pA pF−1 (n = 6, P < 0.001) and increased the rate of inactivation, decreasing the time constant around fourfold. Inhibition by ET-1 was prevented by PKC-IP. When d-glucose was increased to 10 mm, ET-1 no longer inhibited Kv current (n = 6). Glucose metabolism was required for prevention of ET-1 inhibition of Kv currents, since fructose mimicked the effects of d-glucose, while l-glucose, sucrose or mannitol were without effect. Endothelin receptors were still functional in 10 mmd-glucose, since pinacidil-activated ATP-dependent K+ (KATP) currents were reduced by 10 nm ET-1. This inhibition was nearly abolished by PKC-IP, indicating that endothelin receptors could still activate PKC in 10 mmd-glucose. These results indicate that changes in extracellular glucose concentration within the physiological range can reduce Kv current amplitude and can have major effects on Kv channel modulation by vasoconstrictors.

Récemment plusieurs récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) ont été caractérisés au niveau des membranes intracellulaires, dont la membrane nucléaire. Notre objectif était de déterminer si les sous-types de récepteurs β-adrénergiques (βAR) et leurs machineries de signalisation étaient fonctionnels et localisés à la membrane nucléaire des cardiomyocytes. Nous avons démontré la présence des β1AR et β3AR, mais pas du β2AR à la membrane nucléaire de myocytes ventriculaires adultes par immunobuvardage, par microscopie confocale, et par des essais fonctionnels. De plus, certains partenaires de signalisation comme les protéines GαS, Gαi, l’adénylate cyclase II, et V/VI y étaient également localisés. Les sous-types de βAR nucléaires étaient fonctionnels puisqu'ils pouvaient lier leurs ligands et activer leurs effecteurs. En utilisant des noyaux isolés, nous avons observé que l'agoniste non-sélectif isoprotérénol (ISO), et que le BRL37344, un ligand sélectif du β3AR, stimulaient l'initiation de la synthèse de l’ARN, contrairement à l'agoniste sélectif du β1AR, le xamotérol. Cette synthèse était abolie par la toxine pertussique (PTX). Cependant, la stimulation des récepteurs nucléaires de type B de l’endothéline (ETB) causaient une réduction de l'initiation de la synthèse d’ARN. Les voies de signalisations impliquées dans la régulation de la synthèse d’ARN par les RCPGs ont ensuite été étudiées en utilisant des noyaux isolés stimulés par des agonistes en présence ou absence de différents inhibiteurs des voies MAP Kinases (proteines kinases activées par mitogènes) et de la voie PI3K/PKB. Les protéines impliquées dans les voies de signalisation de p38, JNK, ERK MAP Kinase et PKB étaient présents dans les noyaux isolés. L'inhibition de PKB par la triciribine, inhibait la synthèse d’ARN. Nous avons ensuite pu mettre en évidence par qPCR que la stimulation par l’ISO entrainait une augmentation du niveau d'ARNr 18S ainsi qu’une diminution de l'expression d’ARNm de NFκB. En contraste, l’ET-1 n’avait aucun effet sur le niveau d’expression de l’ARNr 18S. Nous avons ensuite montré que la stimulation par l’ISO réduisait l’expression de plusieurs gènes impliqués dans l'activation de NFκB, tandis que l’inhibition de ERK1/2 et PKB renversait cet effet. Un microarray global nous a ensuite permis de démontrer que les βARs et les ETRs nucléaires régulaient un grand nombre de gènes distincts. Finalement, les βARs et ETRs nucléaires augmentaient aussi une production de NO de noyaux isolés, ce qui pouvait être inhibée par le LNAME. Ces résultats ont été confirmés dans des cardiomyocytes intacts en utilisant des analogues cagés et perméables d’ISO et de l'ET-1: l'augmentation de NO nucléaire détectée par DAF2-DA, causée par l'ET-1 et l'ISO, pouvait être prévenue par le LNAME. Finalement, l’augmentation de l’initiation de la transcription induite par l'ISO était aussi bloquée par le L-NAME ou par un inbitheur de PKG, le KT5823, suggérant que la voie NO-GC-PKG est impliquée dans la régulation de la transcription par les βAR. En conclusion, les βARs et les ETRs nucléaires utilisent des voies de signalisation différentes et exercent ainsi des effets distincts sur l’expression des gènes cardiaques. Ils représentent donc une avenue intéressante pour le développement de drogues pharmacologiques. / Recently several G protein-coupled receptors (GPCRs) have been shown to localize to intracellular membranes, in particular the nuclear membrane. As such, we sought to determine if the β-adrenergic receptor (βAR) subtypes and their associated signalling machinery are functionally localized to nuclear membranes. We demonstrated the presence of β1AR and the β3AR, but not the β2AR, in adult ventricular myocyte nuclei by western blotting, confocal microscopy and functional assays. Downstream signalling partners such as GαS, Gαi and adenylyl cyclase II and V/VI were also present. Nuclear-localized βARs were functional with respect to ligand binding and effector activation. In isolated nuclei, the non-selective βAR agonist isoproterenol (ISO) and the β3AR-selective ligand BRL37344, but not the β1AR-selective xamoterol, stimulated transcription initiation in a pertussis toxin (PTX)-sensitive manner. In contrast, stimulation of type B endothelin receptors (ETB), another GPCR family shown to be present on the nuclear membrane, decreased de novo RNA synthesis. To investigate the signalling pathway(s) involved in GPCR-mediated regulation of RNA synthesis, nuclei were isolated from intact adult rat hearts and treated with receptor agonists in the presence or absence of inhibitors of the PI3K/PKB and mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathways. Components of p38, JNK, and ERK1/2 MAPK cascades as well as PKB were detected in nuclear preparations. Inhibition of PKB with triciribine converted the activation of the βAR from stimulatory to inhibitory with regards to transcription initiation. Analysis by qPCR indicated isoproterenol treatment increased 18S rRNA but decreased NFκB mRNA. In contrast, ET-1 had no effect on 18S rRNA expression. Further investigation using pathway-specific PCR arrays revealed that isoproterenol treatment also reduced the expression of several other genes involved in the activation of NFκB and that ERK1/2 and PKB inhibitors attenuated this effect. Subsequent genome-wide microarray analysis has revealed that nuclear βAR and ETB regulated a host of genes in an overlapping but distinct manner. Moreover, both ET-1 and ISO produced an L-NAME-sensitive increase in NO production in isolated cardiac nuclei. These observations were confirmed in intact cardiomyocytes using novel caged analogues of ISO and ET-1 and the cell-permable NO-sensitive fluorescent dye, DAF-2 DA. Briefly, both ET-1 and isoproterenol increased NO production, and this increase was prevented upon preincubation with L-NAME. Moreover, the ability of isoproterenol to increase transcription initiation in isolated nuclei was blocked by L-NAME or the PKG inhibitor KT5823, indicating the NO-GC-PKG pathway is involved in the regulation of gene expression by nuclear βARs. Hence, we have shown that βARs and ETRs in the nuclear membrane activate distinct signalling pathways, resulting in different effects on gene transcription and thus represent potentially important targets for drug development.

Récemment plusieurs récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) ont été caractérisés au niveau des membranes intracellulaires, dont la membrane nucléaire. Notre objectif était de déterminer si les sous-types de récepteurs β-adrénergiques (βAR) et leurs machineries de signalisation étaient fonctionnels et localisés à la membrane nucléaire des cardiomyocytes. Nous avons démontré la présence des β1AR et β3AR, mais pas du β2AR à la membrane nucléaire de myocytes ventriculaires adultes par immunobuvardage, par microscopie confocale, et par des essais fonctionnels. De plus, certains partenaires de signalisation comme les protéines GαS, Gαi, l’adénylate cyclase II, et V/VI y étaient également localisés. Les sous-types de βAR nucléaires étaient fonctionnels puisqu'ils pouvaient lier leurs ligands et activer leurs effecteurs. En utilisant des noyaux isolés, nous avons observé que l'agoniste non-sélectif isoprotérénol (ISO), et que le BRL37344, un ligand sélectif du β3AR, stimulaient l'initiation de la synthèse de l’ARN, contrairement à l'agoniste sélectif du β1AR, le xamotérol. Cette synthèse était abolie par la toxine pertussique (PTX). Cependant, la stimulation des récepteurs nucléaires de type B de l’endothéline (ETB) causaient une réduction de l'initiation de la synthèse d’ARN. Les voies de signalisations impliquées dans la régulation de la synthèse d’ARN par les RCPGs ont ensuite été étudiées en utilisant des noyaux isolés stimulés par des agonistes en présence ou absence de différents inhibiteurs des voies MAP Kinases (proteines kinases activées par mitogènes) et de la voie PI3K/PKB. Les protéines impliquées dans les voies de signalisation de p38, JNK, ERK MAP Kinase et PKB étaient présents dans les noyaux isolés. L'inhibition de PKB par la triciribine, inhibait la synthèse d’ARN. Nous avons ensuite pu mettre en évidence par qPCR que la stimulation par l’ISO entrainait une augmentation du niveau d'ARNr 18S ainsi qu’une diminution de l'expression d’ARNm de NFκB. En contraste, l’ET-1 n’avait aucun effet sur le niveau d’expression de l’ARNr 18S. Nous avons ensuite montré que la stimulation par l’ISO réduisait l’expression de plusieurs gènes impliqués dans l'activation de NFκB, tandis que l’inhibition de ERK1/2 et PKB renversait cet effet. Un microarray global nous a ensuite permis de démontrer que les βARs et les ETRs nucléaires régulaient un grand nombre de gènes distincts. Finalement, les βARs et ETRs nucléaires augmentaient aussi une production de NO de noyaux isolés, ce qui pouvait être inhibée par le LNAME. Ces résultats ont été confirmés dans des cardiomyocytes intacts en utilisant des analogues cagés et perméables d’ISO et de l'ET-1: l'augmentation de NO nucléaire détectée par DAF2-DA, causée par l'ET-1 et l'ISO, pouvait être prévenue par le LNAME. Finalement, l’augmentation de l’initiation de la transcription induite par l'ISO était aussi bloquée par le L-NAME ou par un inbitheur de PKG, le KT5823, suggérant que la voie NO-GC-PKG est impliquée dans la régulation de la transcription par les βAR. En conclusion, les βARs et les ETRs nucléaires utilisent des voies de signalisation différentes et exercent ainsi des effets distincts sur l’expression des gènes cardiaques. Ils représentent donc une avenue intéressante pour le développement de drogues pharmacologiques. / Recently several G protein-coupled receptors (GPCRs) have been shown to localize to intracellular membranes, in particular the nuclear membrane. As such, we sought to determine if the β-adrenergic receptor (βAR) subtypes and their associated signalling machinery are functionally localized to nuclear membranes. We demonstrated the presence of β1AR and the β3AR, but not the β2AR, in adult ventricular myocyte nuclei by western blotting, confocal microscopy and functional assays. Downstream signalling partners such as GαS, Gαi and adenylyl cyclase II and V/VI were also present. Nuclear-localized βARs were functional with respect to ligand binding and effector activation. In isolated nuclei, the non-selective βAR agonist isoproterenol (ISO) and the β3AR-selective ligand BRL37344, but not the β1AR-selective xamoterol, stimulated transcription initiation in a pertussis toxin (PTX)-sensitive manner. In contrast, stimulation of type B endothelin receptors (ETB), another GPCR family shown to be present on the nuclear membrane, decreased de novo RNA synthesis. To investigate the signalling pathway(s) involved in GPCR-mediated regulation of RNA synthesis, nuclei were isolated from intact adult rat hearts and treated with receptor agonists in the presence or absence of inhibitors of the PI3K/PKB and mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathways. Components of p38, JNK, and ERK1/2 MAPK cascades as well as PKB were detected in nuclear preparations. Inhibition of PKB with triciribine converted the activation of the βAR from stimulatory to inhibitory with regards to transcription initiation. Analysis by qPCR indicated isoproterenol treatment increased 18S rRNA but decreased NFκB mRNA. In contrast, ET-1 had no effect on 18S rRNA expression. Further investigation using pathway-specific PCR arrays revealed that isoproterenol treatment also reduced the expression of several other genes involved in the activation of NFκB and that ERK1/2 and PKB inhibitors attenuated this effect. Subsequent genome-wide microarray analysis has revealed that nuclear βAR and ETB regulated a host of genes in an overlapping but distinct manner. Moreover, both ET-1 and ISO produced an L-NAME-sensitive increase in NO production in isolated cardiac nuclei. These observations were confirmed in intact cardiomyocytes using novel caged analogues of ISO and ET-1 and the cell-permable NO-sensitive fluorescent dye, DAF-2 DA. Briefly, both ET-1 and isoproterenol increased NO production, and this increase was prevented upon preincubation with L-NAME. Moreover, the ability of isoproterenol to increase transcription initiation in isolated nuclei was blocked by L-NAME or the PKG inhibitor KT5823, indicating the NO-GC-PKG pathway is involved in the regulation of gene expression by nuclear βARs. Hence, we have shown that βARs and ETRs in the nuclear membrane activate distinct signalling pathways, resulting in different effects on gene transcription and thus represent potentially important targets for drug development.

Η εξέλιξη της χρόνιας νεφρικής νόσου χαρακτηρίζεται από προοδευτική απώλεια της νεφρικής λειτουργίας και εναπόθεση εξωκυττάριας ύλης που οδηγεί σε γενικευμένη ίνωση του νεφρικού ιστού. Στους μηχανισμούς που ενοχοποιούνται για την εξέλιξη της βλάβης αυτής προς ίνωση συμμετέχουν κυτταροκίνες και αυξητικοί παράγοντες που προέρχονται από ενδοθηλιακά, επιθηλιακά σωληναριακά κύτταρα και κύτταρα του διάμεσου νεφρικού ιστού. Η ίνωση του διάμεσου νεφρικού χώρου είναι μία κοινή διαδικασία που χαρακτηρίζεται από την de novo ενεργοποίηση μυοϊνοβλαστών με αποτέλεσμα την αυξημένη εναπόθεση εξωκυττάριας ύλης. Τα επιθηλιακά σωληναριακά κύτταρα είναι πηγή προέλευσης των ενεργοποιημένων μυοϊνοβλαστών μέσω μιας διαδικασίας που ονομάζεται επιθηλιακή προς μεσεγχυματική μετάπτωση. Διάφοροι μεσολαβητές της νεφρικής βλάβης όπως είναι και η κυκλοσπορίνη ερχόμενοι σε επαφή με κύτταρα του εγγύς εσπειραμένου σωληναρίου οδηγούν σε ενεργοποίηση προϊνωτικών παραγόντων εκκρίνοντας εξωκυττάρια ύλη. Μεταξύ αυτών των μεσολαβητών της νεφρικής βλάβης, ιδιαίτερο ρόλο φαίνεται ότι διαδραματίζουν το νιτρικό οξείδιο και η ενδοθηλίνη, δύο παράγοντες που μετέχουν σε φυσιολογικές, αλλά και παθοφυσιολογικές κυτταρικές διαδικασίες. Τα συστήματα νιτρικού οξειδίου και ενδοθηλίνης αλληλεπιδρούν μεταξύ τους σε επίπεδο υποδοχέων στο κυτταρικό επίπεδο προκαλώντας αλλαγές του αγγειακού τόνου και ενεργοποίηση ή αναστολή προϊνωτικών σημάτων. Ο σκοπός της εργασίας ήταν η μελέτη της έκφρασης των συστημάτων νιτρικού οξειδίου και ενδοθηλίνης σε σωληναριακά νεφρικά κύτταρα κάτω από την επίδραση της κυκλοσπορίνης. Χρησιμοποιήθηκαν ανθρώπινες κυτταροκαλλιέργειες νεφρικών επιθηλιακών κυττάρων του εγγύς εσπειραμένου σωληναρίου (ΗΚ-2) τα οποία επωάσθηκαν σε θεραπευτικές και τοξικές συγκεντρώσεις κυκλοσπορίνης (CsA) και ακολούθησε η ανίχνευση του νιτρικού οξειδίου (NO), της ενδοθηλιακής και επαγώγιμης συνθετάσης του ΝΟ (e-NOS, i-NOS) και της ενδοθηλίνης-1 (ET-1) με τους Α και Β υποδοχείς της (ΕΤ-Α, ΕΤ-Β). Το ΝΟ μετρήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο Griess, ενώ η συσσώρευση της ενδοθηλίνης και των Α και Β υποδοχέων της καθώς και οι συνθετάσες του ΝΟ ανιχνεύθηκαν τόσο σε επίπεδο μεταγράφου (m-RNA) χρησιμοποιώντας RT-PCR, όσο και σε επίπεδο πρωτεΐνης με Western Blot ανάλυση. Πειράματα πραγματοποιήθηκαν επίσης χρησιμοποιώντας ταυτόχρονα στο επωαστικό μέσο εκτός από κυκλοσπορίνη και ειδικούς αναστολείς του ΝΟ (L-NAME) και των υποδοχέων της ενδοθηλίνης (BQ123, BQ 788), ενώ ακολούθησε η ανίχνευση των συνθετασών του ΝΟ και των υποδοχέων της ενδοθηλίνης αντίστοιχα. Από τα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν προκύπτει ότι η κυκλοσπορίνη ασκεί τοξική δράση σε νεφρικά σωληναριακά κύτταρα και επάγει τη συσσώρευση της ΕΤ-1,του ΝΟ, των συνθετασών του ΝΟ και των Α και Β υποδοχέων της ΕΤ-1. Η επαγωγή του ΕΤ-Α υποδοχέα είναι ανεξάρτητη από την παρουσία ή μη ΝΟ, σε αντίθεση με τον ΕΤ-Β υποδοχέα η επαγωγή του οποίου καταστέλλεται πλήρως όταν αναστέλλεται το σύστημα του νιτρικού οξειδίου (L-NAME). Η επαγωγή της e-NOS από την κυκλοσπορίνη είναι απόλυτα εξαρτώμενη από το σύστημα της ΕΤ-1, σε αντίθεση με την i-NOS η οποία επάγεται σε σημαντικό βαθμό ακόμη και όταν το σύστημα ενδοθηλίνης αδρανοποιείται πλήρως με ειδικούς αναστολείς (BQ123 και BQ788). / The progression of renal fibrosis is characterized by loss of kidney function and deposition of extracellular matrix components. The mechanism implicated in the development of renal fibrosis involves cytokines and growth factors originating from endothelial, tubular epithelial and interstitial cells. Activated myofibloblasts derive from differentiated tubular epithelial cells trough a process called epithelial to mesenchymal transition. Various kidney injury mediators like cyclosporine-A (CsA) are entering the luminal space of the tubules causing activation of profibrotic factors such as nitric oxide (NO) and endothelin-1 (ET-1). A cross talk exists between endothelin and NO systems in the regulation of vascular tone and inflammatory process. Aim of this study was to investigate the effect of cyclosporine-A on the expression of Nitric Oxide and endothelin-1 on cultured renal tubular cells. Human tubular epithelial cells (HK-2) were cultured in the presence of CsA at various concentrations (0 -1,000 ng/ml). RT-PCR was used to determine NO synthases (eNOS, iNOS) and endothelin receptors (ETR-A, ETR-B) and Western Blot analysis for the subsequent proteins. Similar experiments were also carried out using specific NO (L-NAME) and endothelin receptor (BQ123, BQ 788) inhibitors. At therapeutic concentrations, CsA exerts a significant cytotoxic effect on tubular epithelial cells. A dose dependent activation of NO synthases eNOS and iNOS and endothelin receptors ET-A and ETR-B was observed, even at therapeutic concentrations of CsA. An interaction between NO and ET-1 systems under the influence of CsA was also observed, since blockage of NO production was followed by down-regulation of ET-B while blocking of endothelin pathway with ET receptor antagonists, was followed by down-regulation of eNOS expression.

Background: Pulmonary hypertension (PH) is a rare condition characterized by endothelial dysfunction and vascular remodelling, leading to increased pulmonary vascular resistance (PVR) and right ventricular heart failure. Endothelial dysfunction is associated with an imbalance between vasoconstrictor compounds, such as endothelin and thromboxane A2, and vasodilator compounds, such as prostacyclin and nitric oxide (NO). Asymmetric dimethylarginine (ADMA), a methyl derivate of L-arginine, inhibits synthesis of NO. Vardenafil, a phosphodiesterase type 5 inhibitor (PDE5-inhibitors), causes vasodilation through the NO/cGMP pathway. Aim: This thesis investigates the pharmacological effects and diagnostic utility of vardenafil in PH patients. In addition, to evaluate the change of L-arginine and dimethylarginines before and during PAHspecific therapy in PAH patients compared to patients with left ventricular heart failure (LVHF) and healthy subjects. Methods: The pharmacokinetics and hemodynamic effects of vardenafil were examined during right heart catheterization (RHC) in 16 PH patients and plasma concentrations were measured for up to nine hours after oral administration. In 20 PH patients, acute vasoreactivity test with vardenafil was performed during RHC. Hemodynamic responses were recorded, responders were defined and followed for up to seven years. Additionally, plasma ADMA, symmetric dimethylarginine (SDMA), L-arginine, L-citrulline and L-ornithine levels before and after PAH drug treatment were monitored in 21 PAH patients and compared to values measured in 14 LVHF patients and 27 healthy subjects. Results: Vardenafil concentrations increased rapidly to maximum plasma concentration (tmax 1h) and elimination half-life was 3.4 h. Patients co-medicated with bosentan had reduced vardenafil concentration. Significant acute hemodynamic responses were observed for mean pulmonary artery pressure (mPAP) (p&lt;0.001), pulmonary vascular resistance (PVR) (p&lt;0.001), cardiac output (CO) (p=0.015), cardiac index (CI) (p=0.010), systemic vascular resistance (SVR) (p&lt;0.001) and PVR/SVR (p=0.002) and were related to plasma vardenafil concentrations. PAH patients had significantly higher ADMA and SDMA levels and significantly lower L-arginine levels and L-arginine/ADMA ratio compared with healthy subjects (p&lt;0.001). L-arginine was also lower in PAH patients compared to patients with LVHF (p&lt;0.05). WHO functional class and six minutes walking distance (6MWD) correlated to Larginine and L-arginine/ADMA ratio in PAH at baseline (p&lt;0.05). At follow-up, patients on mono- or combinationtherapy with endothelin receptor antagonists (ERA) had lower ADMA levels than patients without ERA (p&lt;0.05). In contrast, patients on PDE5-inhibitors had higher ADMA levels compared to patients without PDE5-inhibitors (p&lt;0.05). Conclusion: Vardenafil is safe in acute vasoreactivity test in PH patients. Cardiopulmonary hemodynamic response was related to plasma drug concentrations. There was a high inter-individual variability of vardenafil pharmacokinetics and co-medication with bosentan caused a pharmacokinetic drug interaction. Baseline L-arginine and dimethylarginines levels were different in PAH patients compared to LVHF patients and healthy controls. PAH-specific treatment influenced L-arginine and dimethylarginines. Our data suggest that L-arginine might be useful for differentiating PAH from LVHF, and L-arginine/ADMA ratios were related to the severity of PAH and might be useful for follow-up evaluations of PAH patients.