Submitted by Fernanda Rodrigues de Lima (fernanda.rlima@ufpe.br) on 2018-08-01T22:32:58Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Hayana Millena de Arruda Azevedo.pdf: 6064909 bytes, checksum: 10bd5990f9b0024b2cb4fac0db7716f6 (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-08-03T18:37:26Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Hayana Millena de Arruda Azevedo.pdf: 6064909 bytes, checksum: 10bd5990f9b0024b2cb4fac0db7716f6 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-03T18:37:26Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Hayana Millena de Arruda Azevedo.pdf: 6064909 bytes, checksum: 10bd5990f9b0024b2cb4fac0db7716f6 (MD5) Previous issue date: 2013-08-23 / FACEPE / O feijão-caupi (Vigna unguiculata) vem aumentando gradativamente seu potencial produtivo. Contudo, a área colhida, a produção e a produtividade oscilam muito em virtude das variações climáticas, bem como os ataques de pragas e patógenos. Estudos moleculares aliados a ferramentas biotecnológicas, como a transgenia e a mutagênese, podem contribuir na redução dos problemas gerados pelos estresses. O presente trabalho teve como objetivo inserir um gene ligado à defesa na cultivar BRS Tumucumaque de feijão-caupi, conferindo-lhe maior tolerância a estresses bióticos. Para obtenção dos resultados, foi utilizada a metodologia de transferência direta de genes via Biobalística. Foram bombardeados cerca de 700 embriões e cinco exemplares (0,7%) passaram por todas as etapas da pressão de seleção, chegando à aclimatação. Uma vez aclimatadas, realizou-se a análise por PCR. Para confirmação da transformação foi feito uso do conjunto de primers pAHAS 124/pAHAS 500. Os primersforam utilizados para amplificar uma sequência de 624 pb e, em conjunto com a sequência codificante, cerca de 750 pb. Em um segundo momento, também objetivou-se gerar mutantes com características de tolerância a estresse salino, fazendo uso da mutagênese in vitro através de irradiação por raios gama sobre o desenvolvimento in vitro da cv. BR14-Mulato.Inicialmente, foi estabelecido um protocolo apropriado para pressão de seleção in vitro das sementes irradiadas, fazendo-se uso das concentrações de 172 mM, 258 mM, 344 mM e 0 mM, chegando-se, então, à conclusão de que a concentração de 172 mM seria a mais apropriada. Por fim, sementes foram irradiadas com três doses de radiação gama (100 Gy, 150 Gy e 200 Gy), além do material controle (0 Gy), e seus tecidos foram isolados e inoculados, simultaneamente, em meios de cultura com e sem sal. Como resultado, foi obtido um possível variante somaclonal advindo de material não irradiado e inoculado em meio não seletivo, sendo transferido, posteriormente, para meio contendo NaCl, sobrevivendo a este. Outro resultado de grande importância foi a obtenção de um provável mutante sólido provocado pela dose de 150 Gy que, inicialmente, formou calo embriogênico na ausência de NaCl, sendo posto sob pressão de seleção na etapa conseguinte. / Cowpea (Vigna unguiculata) is gradually increasing its productive potential. However, the harvested area, production and productivity of this crop oscillate due to climate changes, as well as attacks by pests and pathogens. Molecular studies aiming the isolation of genes combined with biotechnological tools, such as transgenesis and mutagenesis, can contribute effectively in reducing the problems caused by stress. The present work aimed to insert a defense gene in thecowpea cultivar BRS Tumucumaque,conferring increased tolerance to biotic stresses. To obtain these results, we used the methodology of direct gene transfer via biolistic. About 700 embryos were bombarded and five samples (0.7%) went through all the stages of selection pressure, reaching acclimation. Once acclimated, they were analyzed by PCR. For confirmation of the transformation a set of primers (AHAS124/pAHAS500) were used. In conjunction with the coding sequence, the pair showed a band of approximately 750 bp.In a second moment, was also aimed to generate mutants with characteristics of salt stress tolerance, making use of in vitro mutagenesis through gamma irradiation on the development in vitro of the cv. BR14-Mulato, from determining the minimum concentration of sodium chloride (NaCl) capable of inhibiting in vitro regeneration of tissues and subsequent choice of the radiation level capable of generating genetic variation.Initially, was established an appropriate protocol for selection pressure of the irradiated seeds, making use of concentrations of 172 mM, 258 mM, 344 mM and 0 mM, coming then to the conclusion that the concentration of 172 mM would be more appropriate. Finally, seeds were irradiated with three doses of gamma radiation (100 Gy, 150 Gy and 200 Gy), and their tissues were isolated and inoculated simultaneously in culture media with and without salt. As a result, were obtained a possible somaclonal variation arising from non-irradiated materials and inoculated onto non-selective medium, being transferred later to medium containing NaCl, surviving this. Another was the achievementof a mutant caused by the dose of 150 Gy, which originally formed embryogenic callus in the absence of NaCl and later placed under selection pressure in the next step.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Pós Graduação em Biologia Molecular, 2012. / Submitted by Elna Araújo (elna@bce.unb.br) on 2012-06-22T23:14:38Z No. of bitstreams: 1 2012_NicolauBritodaCunha.pdf: 2706379 bytes, checksum: 1687039afa393cb383e4bbc8641a75af (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-06-25T12:15:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_NicolauBritodaCunha.pdf: 2706379 bytes, checksum: 1687039afa393cb383e4bbc8641a75af (MD5) / Made available in DSpace on 2012-06-25T12:15:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_NicolauBritodaCunha.pdf: 2706379 bytes, checksum: 1687039afa393cb383e4bbc8641a75af (MD5) / As plantas superiores apresentam diversas vantagens para a produção de biomoléculas recombinantes quando comparadas com os demais sistemas de expressão heteróloga, incluindo baixo risco de contaminação com oncogenes, príons, vírus e outros patógenos humanos, além de alta capacidade de escalonamento, baixos custos de produção e sistemas de cultivo e produção agronômica em larga escala. Plantas transgênicas também permitem a exploração de diversos órgãos vegetais com alto conteúdo protéico, tais como sementes e tubérculos, para a expressão de diferentes proteínas recombinantes. Dentre os vegetais comumente cultivados, as plantas de soja são excelentes acumuladoras naturais de proteínas e se constituem em uma fonte de biomassa abundante e barata. Sob condições controladas de cultivo em casa de vegetação, o ciclo agronômico de plantas de soja pode ser manipulado para maximizar a produção de sementes em larga escala em áreas relativamente pequenas. No presente trabalho foram obtidas diferentes linhagens transgênicas de soja contendo os genes da pró-insulina humana, do hormônio do crescimento humano e do fator IX de coagulação sangüínea, sob o controle de seqüências regulatórias específicas para o direcionamento do acúmulo para os vacúolos das sementes. As linhagens obtidas foram caracterizadas do ponto de vista molecular e a expressão recombinante foi caracterizada nos níveis transcricional e traducional. Sementes contendo o hGH e o FIX apresentaram níveis de acúmulo da ordem de 2,9 e 0,23% PST respectivamente, o que reflete um potencial de produção de até 9 e 0,8 g de proteína recombinante por Kg de sementes. O seqüenciamento N-terminal de frações das duas proteínas por nanoLC-MSE demonstrou que os peptídeos trípticos de ambas apresentaram as seqüências de aminoácidos e as massas moleculares esperadas. Ensaios de função biológica com o hGH e o FIX demonstraram diferentes níveis de atividade detectável e que o acúmulo dessas proteínas nos PSVs, mesmo por um período de tempo prolongado (até sete anos), é uma alternativa interessante para garantir a estabilidade protéica pós-traducional. Essa estratégia molecular de expressão pode constituir uma alternativa interessante para o desenvolvimento de produtos biotecnológicos mais baratos e eficientes para sua utilização como reagentes terapêuticos e diagnósticos. _________________________________________________________________________________ ABSTARCT / Plants present various advantages for the production of biomolecules, including low risk of contamination with prions, viruses and other pathogens, scalability, low production costs, and available agronomical systems. Plants are also versatile vehicles for the production of recombinant molecules because they allow protein expression in various organs, such as tubers and seeds, which naturally accumulate large amounts of protein. Among crop plants, soybean is an excellent protein producer. Soybean plants are also a good source of abundant and cheap biomass and can be cultivated under controlled greenhouse conditions. Under containment, the plant cycle can be manipulated and the final seed yield can be maximized for large-scale protein production within a small and controlled area. In this study we obtained different transgenic soybean lines containing the genes that codify the human proinsulin, the human growth hormone (hGH) and the human coagulation factor IX (FIX), under control of tissue-specific regulatory sequences that target the expression to the PSVs. The transgenic lines were characterized on the transcriptional and translational levels, and the recombinant expression of the hGH and the FIX reached 2.9 and 0.23% TSP respectively, which indicate a potential to produce up to 9 and 0.8 g of recombinant protein/Kg seeds. The N-terminal sequencing with nanoLC-MSE demonstrated that all the tryptic fragments analyzed showed the expected sequences and the molecular masses. The biological activities of the recombinant hGH and the FIX were also determined, and demonstrated that targeting to the PSVs was an interesting expression tool to elevate the post-translational stability. This strategy for the improved molecular expression can constitute an important alternative for the development of cheaper and safer biotechnological products that can be used as therapeutic tools and diagnose reagents in the future.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-06-05T14:44:35Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1067093 bytes, checksum: e638533c1c54b6ee80abd013e3fc495c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-05T14:44:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1067093 bytes, checksum: e638533c1c54b6ee80abd013e3fc495c (MD5) Previous issue date: 2005-02-23 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Antiquitina é uma família de proteínas altamente conservada na evolução que pertence à superfamília de aldeído desidrogenase (ALDH), mas cuja função biológica é desconhecida. Baseado em homologia estrutural e analogia do padrão de expressão, foi isolado um gene da soja, homólogo a antiquitina de humanos, designado GmTP-55, que codifica uma proteína de 55,562 kDa, apresentando um domínio conservado de desidrogenases. A proteína TP-55 apresenta 82% de identidade de seqüência com a proteína 26g de ervilha, induzida por déficit hídrico, e 60% de homologia com a proteína antiquitina de humanos, pertencentes a família ADLH7A1 (conhecida como antiquitina) da superfamília de ALDH. O acúmulo da proteína TP-55 em plantas de soja foi observado na raiz e predominantemente no caule, sob condições de déficit hídrico e estresse salino. Com a finalidade de examinar a função do homólogo da antiquitina in vivo, plantas transgênicas de tabaco (Nicotiana tabacum) e Arabidopsis thaliana expressando constitutivamente o cDNA GmTP-55 foram obtidas e submetidas a diversas condições de estresses abióticos. Enquanto que, em arabidopsis, a expressão do transgene foi confirmada por RT-PCR, em Arabidopsis, a expressão da proteína quimérica TP-55-GFP foi avaliada por microscopia de fluorescência, demonstrando seu acúmulo predominantemente no núcleo e no citoplasma. A expressão ectópica do gene viiGmTP-55 tanto em arabidopsis quanto em tabaco conferiu as plantas transgênicas tolerância a estresse salino durante a germinação e a déficit hídrico durante o desenvolvimento. A eficiência de germinação das sementes transgênicas em concentrações crescentes de NaCl foi muito superior do que a dos controles não transformados. Assim também, em condições de seca progressiva, as plantas transgênicas de tabaco mantiveram a turgidez foliar em altos níveis, contrastando com o aparecimento de murcha foliar das plantas controle. As plantas transgênicas também exibiram uma maior tolerância a estresses oxidativos, que foram induzidos por meio de tratamento com H 2 O 2 e paraquat. Tanto as sementes de arabidopsis quanto as de tabaco expressando GmTP-55 germinaram eficientemente em meio contendo 15 μM de H 2 O 2 , enquanto a germinação das sementes controle foi drasticamente reduzida nas mesmas condições. Similarmente, os discos foliares de tabacos transgênicos tratados com paraquat apresentaram uma redução significativa de lesões necróticas quanto comparadas com as plantas controle. Considerando que o denominador comum resultante dos estresses salino, hídrico e oxidativo seria a produção de ROS e aldeídos tóxicos derivados, estes resultados sugerem que o gene TP-55, homólogo da antiquitina, esteja envolvido em respostas celulares adaptativas relacionadas com detoxificação de aldeídos. / Antiquitin is an evolutionarily conserved protein family of unknown function that belongs to the aldehyde dehydrogenase (ALDH) superfamily. Based on structural homology and expression pattern analogy, we have isolated an antiquitin homolog gene from soybean, designated GmTP-55 that encodes a dehydrogenase motif- containing 55.562 kDa protein. The predicted encoded protein, TP-55, shares 82% sequence identity with the water-stress induced 26g protein from peas and 60% homology with human antiquitin that belongs to the ADLH7A1 (known as antiquitin) family of the ALDH superfamily. Accumulation of TP-55 in soybean was detected in roots and mostly in stems under water deficit and salt stress. To examine the role of antiquitin in vivo, we have obtained transgenics tobacco (Nicotiana tabacum) and Arabidopsis thaliana plants constitutively expressing GmTP-55 and analyzed their response to a variety of abiotic stress conditions. While in tobacco the transgene expression was confirmed by RT-PCR, in Arabidopsis, the expression of the TP-55-GFP chimerical protein was evaluated by fluorescence microscopy that demonstrated its major accumulation in the nucleus and cytoplasm. Ectopic expression of GmTP-55 in both Arabidopsis and tobacco conferred tolerance to salinity during germination and to water stress during plant growth. Under increasing salt concentration the germination efficiency of transgenic seeds were much greater than that of untransformed seeds. ixLikewise, under progressive drought, the transgenic tobacco kept the shoot turgidity to a normal level, which was in contrast to the leaf wilt phenotype of control plants. The transgenic plants also exhibited an enhanced tolerance to oxidative stresses that were induced by H 2 O 2 and paraquat treatments. Both Arabidopsis and tobacco seeds expressing GmTP-55 germinated efficiently in medium supplemented with H 2 O 2 15 μM, whereas the germination of control seeds was drastically reduced under the same condition. Likewise, transgenic tobacco leaf discs treated with paraquat presented a significant reduction in the necrotic lesions as compared to the control leaves. Since the common denominator resulting from salinity, dehydration and oxidative stress is the production of ROS and derived toxic aldehydes, our results suggested that the antiquitin homolog gene might be involved in adaptive responses related to aldehyde detoxification.