Esta tese de doutorado aborda alguns aspectos do estudo de plantas medicinais e de princípios ativos naturais. Os procedimentos experimentais incluíram o estudo fitoquímico de uma planta medicinal da família Asteraceae, o desenvolvimento de um método analítico com validação das análises empregadas e o estudo de atividades biológicas relativas ao processo inflamatório. A primeira etapa compreendeu o estudo fitoquímico da planta medicinal Smallanthus sonchifolius (Asteraceae), envolvendo o isolamento de metabólitos secundários da classe dos terpenóides. Do extrato de lavagem foliar foram isoladas as seguintes lactonas sesquiterpênicas (LSTs): enidrina, uvedalina, sonchifolina, fluctuanina, polimatina B, (1Z,4E)-8β-metacriloilóxi-9α-acetoilóxi-germacra-1(10),4,11(13)-trien-6α,12-olido-14-oato de metila, (1Z,4E)-8β-angeloilóxi-14-oxo-germacra-1(10),4,11(13)-trien-6α,12-olido, (1Z,4E)-8β-metacriloilóxi-germacra-1(10),4,11(13)-trien-6α,12-olido-14-oato de metila, ácido (1Z,4E)-8β-angeloilóxi-germacra-1(10),4,11(13)-trien-6α,12-olido-14-óico e (1Z)-3α,4β-epóxi-8β-[(1Z,4E)-(2S,3R)-2-hidróxi-3-óxi-(8β-angeloilóxi-germacra-1(10),4,11(13)-trien-6α,12-olido)]-9α-acetoilóxi-germacra-1(10),11(13)-dien-6α,12-olido-14-oato de metila. A segunda etapa tratou do desenvolvimento de método e validação das análises para controle de qualidade químico de S. sonchifolius em cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Além disso, foi realizada a quantificação do principal metabólito secundário isolado nos extratos glandulares e de lavagem foliar, a LST enidrina. Esta substância compõe 0,97 % do peso seco das folhas de S. sonchifolius. A terceira etapa refere-se às atividades biológicas, as quais foram avaliadas empregando-se diversos ensaios. Também foi realizada a otimização de método para avaliação da secreção de elastase por neutrófilos humanos e o estudo da estimulação basal de neutrófilos. Ainda foram investigados os efeitos de produtos fitoterápicos, como gel de Arnica montana e extrato de Harpagophytum procumbens, e de metabólitos secundários, como LSTs e alcalóides, na atividade enzimática de elastase, na secreção de elastase por neutrófilos, na ativação do fator de transcrição NF-κB via EMSA, na produção de luciferase por meio de reporter gen assay e de interleucina-8 via ELISA. Com exceção de dois alcalóides, todas as substâncias e produtos testados apresentaram atividades de inibição dos processos inflamatórios investigados. / This Ph.D. thesis deals with some aspects of the study of medicinal plants and their biologically active natural compounds. The experimental procedures comprised the phytochemical study of a plant from the family Asteraceae, the development of an analytical method with validation of the employed analysis and the study of the biological activities related to the inflammatory process. The first step comprised the phytochemical study of the medicinal plant Smallanthus sonchifolius (Asteraceae) and the isolation of secondary metabolites. From the leaf rinse extract were isolated the sesquiterpene lactones (STLs) enhydrin, uvedalin, sonchifolin, fluctuanin, polymatin B, methyl (1Z,4E)-8β-metacryloyloxy-9α-acetoyloxy-germacra-1(10),4,11(13)-trien-6α,12-olide-14-ate, (1Z,4E)-8β-angeloyloxy-14-oxo-germacra-1(10),4,11(13)-trien-6α,12-olide, methyl (1Z,4E)-8β-metacryloyloxy-germacra-1(10),4,11(13)-trien-6α,12-olide-14-ate, (1Z,4E)-8β-angeloyloxy-germacra-1(10),4,11(13)-trien-6α,12-olide-14-oic acid, methyl (1Z)-3α,4β-epoxy-8β-[(1Z,4E)-(2S,3R)-2-hydroxy-3-oxy-(8β-angeloyloxy-germacra-1(10),4,11(13)-trien-6α,12-olide)]-9α-acetoyloxy-germacra-1(10),11(13)-dien-6α,12-olide-14-ate. The second part was related to the development and validation of a chromatographic method for the chemical quality control of S. sonchifolius using high performance liquid chromatography (HPLC). Furthermore, the quantification of the main secondary metabolite, the STL enhydrin on glandular and leaf rinse extracts was also performed. This compound comprises 0,97 % of dried leaves weight of the plant. The third part deals with biological activities, which were investigated through different assays. One method for the study of the elastase release from human neutrophils was evaluated and the basal stimulation of neutrophils was studied. The effects of phytoterapeutic agents, like Arnica montana gel and Harpagophytum procumbens extract, and of the secondary metabolites, like LSTs and alkaloids, on the enzymatic activity of elastase, on elastase release from neutrophils, on the activation of the transcription factor NF-κB through EMSA, on luciferase production through reporter gene assay and on interleucina-8 production through ELISA were also carried out. Both phytoterapeutic agents as well as the great majority of the tested compounds showed some inhibitory activity over the investigated inflammatory processes.

Esta tese de doutorado aborda alguns aspectos do estudo de plantas medicinais e de princípios ativos naturais. Os procedimentos experimentais incluíram o estudo fitoquímico de uma planta medicinal da família Asteraceae, o desenvolvimento de um método analítico com validação das análises empregadas e o estudo de atividades biológicas relativas ao processo inflamatório. A primeira etapa compreendeu o estudo fitoquímico da planta medicinal Smallanthus sonchifolius (Asteraceae), envolvendo o isolamento de metabólitos secundários da classe dos terpenóides. Do extrato de lavagem foliar foram isoladas as seguintes lactonas sesquiterpênicas (LSTs): enidrina, uvedalina, sonchifolina, fluctuanina, polimatina B, (1Z,4E)-8β-metacriloilóxi-9α-acetoilóxi-germacra-1(10),4,11(13)-trien-6α,12-olido-14-oato de metila, (1Z,4E)-8β-angeloilóxi-14-oxo-germacra-1(10),4,11(13)-trien-6α,12-olido, (1Z,4E)-8β-metacriloilóxi-germacra-1(10),4,11(13)-trien-6α,12-olido-14-oato de metila, ácido (1Z,4E)-8β-angeloilóxi-germacra-1(10),4,11(13)-trien-6α,12-olido-14-óico e (1Z)-3α,4β-epóxi-8β-[(1Z,4E)-(2S,3R)-2-hidróxi-3-óxi-(8β-angeloilóxi-germacra-1(10),4,11(13)-trien-6α,12-olido)]-9α-acetoilóxi-germacra-1(10),11(13)-dien-6α,12-olido-14-oato de metila. A segunda etapa tratou do desenvolvimento de método e validação das análises para controle de qualidade químico de S. sonchifolius em cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Além disso, foi realizada a quantificação do principal metabólito secundário isolado nos extratos glandulares e de lavagem foliar, a LST enidrina. Esta substância compõe 0,97 % do peso seco das folhas de S. sonchifolius. A terceira etapa refere-se às atividades biológicas, as quais foram avaliadas empregando-se diversos ensaios. Também foi realizada a otimização de método para avaliação da secreção de elastase por neutrófilos humanos e o estudo da estimulação basal de neutrófilos. Ainda foram investigados os efeitos de produtos fitoterápicos, como gel de Arnica montana e extrato de Harpagophytum procumbens, e de metabólitos secundários, como LSTs e alcalóides, na atividade enzimática de elastase, na secreção de elastase por neutrófilos, na ativação do fator de transcrição NF-κB via EMSA, na produção de luciferase por meio de reporter gen assay e de interleucina-8 via ELISA. Com exceção de dois alcalóides, todas as substâncias e produtos testados apresentaram atividades de inibição dos processos inflamatórios investigados. / This Ph.D. thesis deals with some aspects of the study of medicinal plants and their biologically active natural compounds. The experimental procedures comprised the phytochemical study of a plant from the family Asteraceae, the development of an analytical method with validation of the employed analysis and the study of the biological activities related to the inflammatory process. The first step comprised the phytochemical study of the medicinal plant Smallanthus sonchifolius (Asteraceae) and the isolation of secondary metabolites. From the leaf rinse extract were isolated the sesquiterpene lactones (STLs) enhydrin, uvedalin, sonchifolin, fluctuanin, polymatin B, methyl (1Z,4E)-8β-metacryloyloxy-9α-acetoyloxy-germacra-1(10),4,11(13)-trien-6α,12-olide-14-ate, (1Z,4E)-8β-angeloyloxy-14-oxo-germacra-1(10),4,11(13)-trien-6α,12-olide, methyl (1Z,4E)-8β-metacryloyloxy-germacra-1(10),4,11(13)-trien-6α,12-olide-14-ate, (1Z,4E)-8β-angeloyloxy-germacra-1(10),4,11(13)-trien-6α,12-olide-14-oic acid, methyl (1Z)-3α,4β-epoxy-8β-[(1Z,4E)-(2S,3R)-2-hydroxy-3-oxy-(8β-angeloyloxy-germacra-1(10),4,11(13)-trien-6α,12-olide)]-9α-acetoyloxy-germacra-1(10),11(13)-dien-6α,12-olide-14-ate. The second part was related to the development and validation of a chromatographic method for the chemical quality control of S. sonchifolius using high performance liquid chromatography (HPLC). Furthermore, the quantification of the main secondary metabolite, the STL enhydrin on glandular and leaf rinse extracts was also performed. This compound comprises 0,97 % of dried leaves weight of the plant. The third part deals with biological activities, which were investigated through different assays. One method for the study of the elastase release from human neutrophils was evaluated and the basal stimulation of neutrophils was studied. The effects of phytoterapeutic agents, like Arnica montana gel and Harpagophytum procumbens extract, and of the secondary metabolites, like LSTs and alkaloids, on the enzymatic activity of elastase, on elastase release from neutrophils, on the activation of the transcription factor NF-κB through EMSA, on luciferase production through reporter gene assay and on interleucina-8 production through ELISA were also carried out. Both phytoterapeutic agents as well as the great majority of the tested compounds showed some inhibitory activity over the investigated inflammatory processes.

Biotransformações são reações de compostos orgânicos realizadas por microrganismos, plantas ou enzimas isoladas. A transformação de um composto em particular pode ser realizada em grupos funcionais com ou sem degradação de seu esqueleto. Neste trabalho foram utilizados fungos endofíticos e de solo na biotransformação da lactona sesquiterpênica enidrina e do diterpeno afidicolina. A enidrina possui atividade antidiabética e anti-inflamatória. A afidicolina possui pronunciada atividade antitumoral, antiviral e leishmanicida. Foram realizados experimentos de biotransformação da enidrina e da afidicolina com os fungos endofíticos Penicillium crustosum VR4, Papulospora immersa SS13, Fusarium oxysorium SS50 e com o fungo de solo Rhizopus stolonifer. A biotransformação da enidrina com fungo endofítico Papulospora immersa SS13 levou à obtenção de um derivado di-hidroxilado, produzido pela abertura do epóxido presente no éster da cadeia lateral desta lactona sesquiterpênica. Este produto só havia sido previamente obtido na literatura por semi-síntese a partir da enidrina. Os experimentos de biotransformação da afidicolina não levaram ao isolamento e identificação de produtos. Reações semi-sintéticas com a afidicolina foram mais eficientes para a obtenção de derivados deste diterpeno. Foram obtidos cinco derivados semi-sintéticos da afidicolina: dois derivados mono-éteres de silício, um di-éter de silício, um derivado tetra-acetilado e um tri-acetilado. Ainda, na purificação dos produtos reacionais isolou-se o produto natural 3-desoxiafidicolina. Todos os derivados afidicolanos foram submetidos ao ensaio frente a Leishmania major. A afidicolina, a 3-desoxiafidicolina e a afidicolina tri-acetilada exibiram as atividades leishmanicidas mais significativas. Foram calculadas as lipofilicidades dos derivados afidicolanos. A maior atividade observada para o derivado tri-acetilado da afidicolina pode estar relacionada com sua maior capacidade de cruzar as membranas celulares. Este trabalho levou ao isolamento de um produto de biotransformação da enidrina e à identificação de novos derivados afidicolanos naturais e semi-sintéticos com atividade leishmanicida. / Biotransformations are reactions of organic compounds made by intact microbial cells, plant cells or enzymes isolated. The transformation of a particular compound can be carried out at functional groups, with or without degradation of the carbonic skeleton. In this work endophytic and soil fungal strains were applied for the biotransformation of the bioactive terpenes enhydrin (sesquiterpene lactone) and aphidicolin (diterpene). Enhydrin shows anti-diabetic and anti-inflammatory activity. Aphidicolin has been reported as an antiviral, antitumoral and leishmanicidal hit. The endophytes Penicillium crustosum VR4, Papulospora immersa SS13, Fusarium oxysporium SS50 and the soil fungus Rhizopus stolonifer have been screened for the biotransformation of enhydrin and aphidicolin. The biotransformation of enhydrin, catalyzed by the endophytic P. immersa SS13, led to the isolation of a dihydroxy-derivative, a product of the sesquiterpene lactone side chain epoxide opening. This product had only been obtained previously by chemical means. The biotransformation experiments using aphidicolin as substrate were not successful in the production of derivatives. The derivatives of aphidicolin were more efficiently prepared through semi-synthetic approaches. Five aphidicolin semi-synthetic derivatives were obtained: two silicon mono-silyl ether derivatives, one silicon bis-silyl ether derivative, one tetra-acetylated derivative and one triacetylated derivative. During the purification of synthetic mixtures, the natural product 3-deoxyaphidicolin was also isolated. All the aphidicolane derivatives have been assayed against Leishmania major. Aphidicolin, 3-deoxyaphidicolin and triacetylated aphidicolin showed the higher leishmanicidal activities. The lipophilicities of aphidicolane derivatives were calculated. The higher activity presented by the triacetylated aphidicolin may be due to its higher ability to cross the cell membranes. This work led to the isolation of one biotransformation product of enhydrin and to the identification of new natural and semi-synthetic leishmanicidal aphidicolanes.

Biotransformações são reações de compostos orgânicos realizadas por microrganismos, plantas ou enzimas isoladas. A transformação de um composto em particular pode ser realizada em grupos funcionais com ou sem degradação de seu esqueleto. Neste trabalho foram utilizados fungos endofíticos e de solo na biotransformação da lactona sesquiterpênica enidrina e do diterpeno afidicolina. A enidrina possui atividade antidiabética e anti-inflamatória. A afidicolina possui pronunciada atividade antitumoral, antiviral e leishmanicida. Foram realizados experimentos de biotransformação da enidrina e da afidicolina com os fungos endofíticos Penicillium crustosum VR4, Papulospora immersa SS13, Fusarium oxysorium SS50 e com o fungo de solo Rhizopus stolonifer. A biotransformação da enidrina com fungo endofítico Papulospora immersa SS13 levou à obtenção de um derivado di-hidroxilado, produzido pela abertura do epóxido presente no éster da cadeia lateral desta lactona sesquiterpênica. Este produto só havia sido previamente obtido na literatura por semi-síntese a partir da enidrina. Os experimentos de biotransformação da afidicolina não levaram ao isolamento e identificação de produtos. Reações semi-sintéticas com a afidicolina foram mais eficientes para a obtenção de derivados deste diterpeno. Foram obtidos cinco derivados semi-sintéticos da afidicolina: dois derivados mono-éteres de silício, um di-éter de silício, um derivado tetra-acetilado e um tri-acetilado. Ainda, na purificação dos produtos reacionais isolou-se o produto natural 3-desoxiafidicolina. Todos os derivados afidicolanos foram submetidos ao ensaio frente a Leishmania major. A afidicolina, a 3-desoxiafidicolina e a afidicolina tri-acetilada exibiram as atividades leishmanicidas mais significativas. Foram calculadas as lipofilicidades dos derivados afidicolanos. A maior atividade observada para o derivado tri-acetilado da afidicolina pode estar relacionada com sua maior capacidade de cruzar as membranas celulares. Este trabalho levou ao isolamento de um produto de biotransformação da enidrina e à identificação de novos derivados afidicolanos naturais e semi-sintéticos com atividade leishmanicida. / Biotransformations are reactions of organic compounds made by intact microbial cells, plant cells or enzymes isolated. The transformation of a particular compound can be carried out at functional groups, with or without degradation of the carbonic skeleton. In this work endophytic and soil fungal strains were applied for the biotransformation of the bioactive terpenes enhydrin (sesquiterpene lactone) and aphidicolin (diterpene). Enhydrin shows anti-diabetic and anti-inflammatory activity. Aphidicolin has been reported as an antiviral, antitumoral and leishmanicidal hit. The endophytes Penicillium crustosum VR4, Papulospora immersa SS13, Fusarium oxysporium SS50 and the soil fungus Rhizopus stolonifer have been screened for the biotransformation of enhydrin and aphidicolin. The biotransformation of enhydrin, catalyzed by the endophytic P. immersa SS13, led to the isolation of a dihydroxy-derivative, a product of the sesquiterpene lactone side chain epoxide opening. This product had only been obtained previously by chemical means. The biotransformation experiments using aphidicolin as substrate were not successful in the production of derivatives. The derivatives of aphidicolin were more efficiently prepared through semi-synthetic approaches. Five aphidicolin semi-synthetic derivatives were obtained: two silicon mono-silyl ether derivatives, one silicon bis-silyl ether derivative, one tetra-acetylated derivative and one triacetylated derivative. During the purification of synthetic mixtures, the natural product 3-deoxyaphidicolin was also isolated. All the aphidicolane derivatives have been assayed against Leishmania major. Aphidicolin, 3-deoxyaphidicolin and triacetylated aphidicolin showed the higher leishmanicidal activities. The lipophilicities of aphidicolane derivatives were calculated. The higher activity presented by the triacetylated aphidicolin may be due to its higher ability to cross the cell membranes. This work led to the isolation of one biotransformation product of enhydrin and to the identification of new natural and semi-synthetic leishmanicidal aphidicolanes.