Abstract Lipids are necessary for living organisms and have various roles as, energy sources, hormone precursors and as components of membrane structures. Fatty acid β-oxidation is a pathway of energy metabolism, in which the fatty acyl-CoAs are degraded in several steps. Peroxisomal β-oxidation systems are found in all eukaryotes studied thus far, but the existence of a mitochondrial system is established in mammals only. Multifunctional enzyme type 2 (MFE-2) has been characterized from various species and is responsible for catalyzing the second and third steps in the R-specific peroxisomal β-oxidation pathway. MFE-2 accepts a wide range of substrates and displays great variation in domain organization and overall molecular mass. The crystal structures of individual domains of MFE-2 from several species have been determined previously. In this study, the structural knowledge of MFE-2 is further extended from the domain level to the assembly of the full-length enzyme. The crystal structure of Drosophila melanogaster MFE-2 (DmMFE-2) was solved at 2.15 Å resolution. The enzyme is a homodimer with 3R-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase and 2E-enoyl-CoA hydratase 2 activities residing on each of the polypeptide subunits. Kinetic data combined with information from the structure, suggest that the catalytic domains of DmMFE-2 work as separate entities. It also appears that the enzyme does not assemble into dimers in vitro when the catalytic subunits are introduced in a solution as stand-alone proteins. The data were confirmed by two different methods, static light scattering and small-angle X-ray scattering. However, the primary use of SAXS was not to monitor the formation of dimers in solution, but instead it was used for structure determination of the human MFE-2. During the process, the structural information from DmMFE-2 was used as a scaffold for the human homolog. After collecting a wide range of SAXS data and numerous calculations, a plausible low resolution solution structure of human MFE-2 was obtained. The model reveals the overall assembly of the enzyme and the locations of the C-terminal SCP-2L domains (an unspecific lipid carrier), thus enabling further hypotheses regarding the possible role of the SCP-2L domain in the enzymatic reaction. / Tiivistelmä Lipidit eli rasva-aineet ovat välttämättömiä eliöille ja niillä on lukemattomia rooleja mm. energianlähteinä, kalvojen rakenteina ja hormonien esiasteina. Rasvahappoja hajotetaan monivaiheisella metaboliareitillä, jota kutsutaan β-oksidaatioksi. Peroksisomaalinen rasvojen hajotusreitti on löydetty kaikista tähän asti tutkituista aitotumallisista, mutta mitokondrioissa tapahtuva rasvojen β-oksidaatio on löydetty vain nisäkkäiltä. Peroksisomaalinen monitoiminen entsyymi tyyppi 2 (MFE-2) katalysoi toisen ja kolmannen reaktion R-spesifisellä rasvahappojen hajotusreitillä ja se on karakterisoitu useilta eri lajeilta. MFE-2 muodostaa lajista riippuen hyvin erilaisia ja molekyylimassaltaan erikokoisia alayksikköyhdistelmiä, jotka pystyvät katalysoimaan erityyppisten substraattien hapetuksen. Eri lajien MFE-2:n yksittäisten alayksiköiden kiderakenteet ovat olleet tunnettuja jo vuosia. Tässä tutkimuksessa rakennetietämys laajenee MFE-2:n osalta alayksikkötasolta kokopitkän entsyymin tasolle, sillä banaanikärpäsen MFE-2:n (DmMFE-2) kiderakenne selvitettiin 2.15 ångströmin erotuskyvyllä. Tämä homodimeerinen entsyymi kantaa samassa polypeptidissä sekä 3R-hydroksiasyyli-KoA-dehydrogenaasi, että 2E-enoyyli-KoA-hydrataasi 2 -aktiivisuuksia. Kiderakenteen ja reaktiokinetiikan perusteella tehtiin johtopäätös, jonka mukaan DmMFE-2:n alayksiköt toimivat itsenäisinä kokonaisuuksinaan. Staattisen valonsironnan (SLS) ja röntgenpienkulmasirontamittauksien (SAXS) perusteella MFE-2:n erillisinä tuotetut alayksiköt eivät muodosta liuoksessa spontaanisti kokopitkän MFE-2:n kaltaisia oligomeerejä. Ihmisen MFE-2:n alhaisen erotuskyvyn malli määritettiin röntgenpienkulmasirontatekniikan avulla. Tässä prosessissa käytettiin hyväksi banaanikärpäsen entsyymin tarjoamaa rakennetietoa, jonka perusteella rakennettiin ensin runko ihmisen MFE-2:lle. Monivaiheisen prosessin jälkeen saatiin lopulta laskettua vakuuttava malli, joka paljastaa ensimmäistä kertaa ihmisen kokopitkän MFE-2:n rakenteen ja antaa mahdollisuuden tehdä alustavia johtopäätöksiä karboksiterminaalisen lipidejä epäspesifisesti sitovan alayksikön (SCP-2L) biologisesta roolista osana tätä monitoimista entsyymiä.

Abstract Multifunctional enzyme type 1 (MFE-1) is a monomeric member of the hydratase/isomerase superfamily (H/I) involved in the β-oxidation of fatty acids. MFE-1 has 2-enoyl-CoA hydratase-1, Δ3-Δ2-enoyl-CoA isomerase, and several other enoyl-CoA isomerase activities at the N-terminus. The C-terminus has (3S)-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase activity. MFE-1 can also convert certain hydroxylated C27 bile acid synthesis intermediates. In these studies, a domain assignment of MFE-1 by sequence alignment with the H/I family (domains A and B in MFE-1) and mitochondrial monofunctional 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenases (HAD, domains C, D and E) was proposed. This was further improved with the structural information obtained from the crystal structure of the construct containing domains B, C, D and E (MFE1-DH). The structure of MFE1-DH resembles the bilobal structure of the α-subunit of the bacterial fatty acid metabolising complex and the mammalian HAD enzyme. The N-terminal linker helix of MFE1-DH (domain B) corresponds to helix-10 of the hydratase/isomerase enzymes having residues important for substrate contacts. Domain C adopts the classical Rossmann fold and forms the first lobe of the MFE1-DH structure. The C-terminal domains D and E form the second lobe and have local symmetry between each other. This local symmetry corresponds to the D domain-mediated dimerisation of the HAD dimer. The domain deletion studies showed that the presence of domains D and E, but not domain C, was essential to obtain a functional hydratase 1 enzyme; this can be understood from stabilising contacts from domain E to the linker helix, as seen in the MFE1-DH structure. The structure of human ACBP from liver was determined with and without a physiological ligand. This structure adopts the classical four-helix bundle of the ACBP family. The ligand binding mode seen in the presence of myristoyl-CoA shows that one ligand molecule is bound jointly by the two protein molecules of the asymmetric unit such that the fatty acid tail is bound by one protein molecule, and the 3'-phosphate AMP moiety of the CoA is bound by the other protein molecule, essentially as in known complexed ACBP structures in the monomeric binding mode. The observed ligand binding mode suggests a new model for the ACBP-mediated ligand transfer observed in biochemical in vitro studies. / Tiivistelmä Tyypin 1 monitoiminen entsyymi (MFE-1) on hydrataasi/isomeraasiperheen (H/I) jäsen ja se osallistuu rasvahappojen β-oksidaatioon. MFE-1:n N-päädyssä on 2-enoyyli-CoA-hydrataasi 1- ja Δ3-Δ2-enoyyli-CoA-isomeraasiaktiivisuus sekä useita muita enoyyli-CoA-isomeraasiaktiivisuuksia. C-päädyssä on (3S)-hydroksiasyyli-CoA-dehydrogenaasiaktiivisuus. MFE-1 voi myös katalysoida tiettyjen hydroksyloitujen C27-sappihapposynteesin välituotteiden reaktioita. Tässä tutkimuksessa määritettiin MFE-1:n domeenirakenne H/I-perheen (MFE-1:n domeenit A ja B) ja 3-hydroksiasyyli-CoA-dehydrogenaasiperheen (HAD, domeenit C, D ja E) sekvenssilinjausten perusteella. Rakennetta tarkennettiin domeenit B, C, D ja E sisältävän konstruktin (MFE1-DH) kiderakenteesta saadun tiedon avulla. MFE1-DH:n kiderakenne muistuttaa bakteerien rasvahappoja hajottavan kompleksin α-alayksikön sekä nisäkkäiden HAD-entsyymin kahdesta alayksiköstä muodostuvaa rakennetta. MFE1-DH:n N-päädyn α-kierre vastaa H/I-entsyymien kierre-10:tä, jossa sijaitsee substraattikontaktien kannalta tärkeitä aminohappotähteitä. C-domeeni muodostaa Rossmann-laskoksen ja se on MFE1-DH:n rakenteen ensimmäinen alayksikkö. C-päädyssä sijaitsevat D- ja E-domeenit muodostavat yhdessä toisen alayksikön ja niiden välillä on symmetria, joka vastaa D-domeenien välittämää HAD-entsyymien dimerisaatiota. Domeenitutkimukset osoittivat, että D- ja E-domeenien läsnä olo oli välttämätöntä hydrataasi 1:n toiminnalle, mutta C-domeeni voitiin poistaa ja säilyttää hydrataasi 1 -aktiivisuus. Havainto voitiin selittää MFE1-DH:n rakenteen avulla, jossa nähdään stabiloivia vuorovaikutuksia E-domeenin ja N-päädyn α-kierteen välillä. Ihmisen maksan ACBP:n kiderakenne määritettiin fysiologisen ligandin kanssa sekä ilman ligandia. Tämä rakenne laskostuu ACBP-perheelle tyypilliseksi neljän kierteen nipuksi. Myristoyyli-CoA:n läsnä ollessa havaitussa ligandin sitoutumistavassa yksi ligandimolekyyli on sitoutunut kahden proteiinimolekyylin välille siten, että rasvahappo-osa sitoutuu toiseen proteiinimolekyyliin ja CoA:n 3'-fosfaatti-AMP-osa sitoutuu toiseen proteiinimolekyyliin kuten tunnetuissa monomeerisissä ACBP:n sitomistavoissa. Havaitun sitoutumisen avulla voidaan ehdottaa uutta mallia ACBP:n välittämälle ligandinsiirrolle, joka on havaittu aikaisemmin biokemiallisissa in vitro -tutkimuksissa.