No epitélio do intestino médio de S. frugiperda encontra-se 90% da atividade de trealase solúvel. A trealase solúvel foi purificada até a homogeneidade por uma série de passos cromatográficos. A enzima possui um sítio hidrofóbico adjacente ao sítio ativo. Mudanças conformacionais aparentemente ocorrem quando metil-a-glicosídeo liga-se ao sítio ativo. A trealase solúvel é inibida competitivamente por amigdalina (Ki=0,21 mM), prunasina (Ki=0,92 mM), mandelonitrila (Ki = 1,14 mM), metil-α-glicosídeo (Ki=89 mM), metil-α-manosídeo (Ki=6,2 mM )e salicina (Ki= 19 mM). Florizina é um inibidor acompetitivo hiperbólico da trealase solúvel (Ki=0,087 mM, α =β =0,35) e seu aglicone floretina é um inibidor não competitivo (Ki=0,029 mM). Tris e mandelonitrila ligam-se a regiões diferentes da enzima enquanto mandelonitrila e floretina não podem ligar-se concomitantemente à enzima. Os pKs da enzima livre (pKe) e do complexo enzima substrato (pKes) foram determinados a partir de valores de Km e Vmáx/Km obtidos em vários pHs. Os valores encontrados foram: pKe1=4,47; pKe2=8,0l ; pKes1=4,83; pKes2=7,59. A trealase solúvel não perde a atividade quando incubada com reagentes que modificam grupos sufidrila, thiol e fenol. Com modificador de grupo imidazol, a enzima perde 60% da atividade somente na presença de metil-α-glucosídeo (inibidor competitivo da trealase). Essa modificação é protegida por trealose, indicando a presença de uma Histidina não essencial para catálise. Modificadores de grupo carboxila e guanidino inativam a enzima, com pKs de, respectivamente, 4,87 e 7,84. a similaridade desses pKs com os determinados cineticamente sugere que os resíduos envolvidos em catálise são uma arginina e um asparto ou glutamato. β-glicosídeos tóxicos produzidos por plantas e seus aglicones inibem trealoses presentes em diferentes órgãos de várias ordens de insetos. Essa inibição foi menor em insetos que se alimentam somente de vegetais, provavelmente devido a uma adaptação desses organismos. / The epithelium of S. frugiperda midgut has a trehalase activity that is mainly soluble (90%). The soluble trehalase was purified by several chromatographic steps. The enzyme has an hydrophobic site near the active site. Conformational changes apparently occur in the enzyme when methyl-α-glucoside binds to the active site. Trehalase has a Km=0.37 mM and is a competitively inhibited by methyl-α-glucoside (Ki=89 mM); methyl-α-mannosideo (Ki=6.2 mM); amygdalin (Ki=0.21); prunasin (Ki=0.92 mM); mandelonitrile (Ki=l.14 mM); Tris (Ki=0.55 mM) and salicin (Ki=l9 mM). Phlorizin is an hyperbolic acompetitive inhibitor (α=β=0.35; Ki=0.0087 mM), whereas its aglycon, phloretin, is a non-competitive inhibitor (Ki=0.029 mM). Tris and mandelonitrile bind at the same region in the active site. On the other hand, mandelonitrile and phloretin cannot be bound to the enzyme at the same time. Enzyme pKs (pKe) and enzyme substrate pKs (pKes) were determined from Km and Vmax/Km values obtained at different pHs. The values are: pKe1=4.47; pKe2=8.0l ; pKes1=4.83; pKes2=7.59. Trehalase is not inactivated when incubated with compounds that react with thiol, imidazole or phenol groups. Trealase lose 60% of its activity in the presence of methyl-α-glucoside (acompetitive inhibitor) plus a compound that reacts with imidazole groups. This inactivation is decreased by trehalose, indicating that there is a non-essential histidine in the active site substances that react with carboxyl guanidine groups inactivate the enzyme. The modified groups have pH of respectively, 4.87 and 7.84. The resemblance of these pKs with the one determined from Km and Vmax values suggest that the prototropic groups of the enzyme are in residues of arginine and aspartic acid or glutamic acid. Toxic β-glucosides from plants and their aglycons inhibit trealase from different organs of insects from several orders. This inhibition is lower in herbivorous insects, possibly due to their adaptation in ingesting vegetal tissues.

No epitélio do intestino médio de S. frugiperda encontra-se 90% da atividade de trealase solúvel. A trealase solúvel foi purificada até a homogeneidade por uma série de passos cromatográficos. A enzima possui um sítio hidrofóbico adjacente ao sítio ativo. Mudanças conformacionais aparentemente ocorrem quando metil-a-glicosídeo liga-se ao sítio ativo. A trealase solúvel é inibida competitivamente por amigdalina (Ki=0,21 mM), prunasina (Ki=0,92 mM), mandelonitrila (Ki = 1,14 mM), metil-α-glicosídeo (Ki=89 mM), metil-α-manosídeo (Ki=6,2 mM )e salicina (Ki= 19 mM). Florizina é um inibidor acompetitivo hiperbólico da trealase solúvel (Ki=0,087 mM, α =β =0,35) e seu aglicone floretina é um inibidor não competitivo (Ki=0,029 mM). Tris e mandelonitrila ligam-se a regiões diferentes da enzima enquanto mandelonitrila e floretina não podem ligar-se concomitantemente à enzima. Os pKs da enzima livre (pKe) e do complexo enzima substrato (pKes) foram determinados a partir de valores de Km e Vmáx/Km obtidos em vários pHs. Os valores encontrados foram: pKe1=4,47; pKe2=8,0l ; pKes1=4,83; pKes2=7,59. A trealase solúvel não perde a atividade quando incubada com reagentes que modificam grupos sufidrila, thiol e fenol. Com modificador de grupo imidazol, a enzima perde 60% da atividade somente na presença de metil-α-glucosídeo (inibidor competitivo da trealase). Essa modificação é protegida por trealose, indicando a presença de uma Histidina não essencial para catálise. Modificadores de grupo carboxila e guanidino inativam a enzima, com pKs de, respectivamente, 4,87 e 7,84. a similaridade desses pKs com os determinados cineticamente sugere que os resíduos envolvidos em catálise são uma arginina e um asparto ou glutamato. β-glicosídeos tóxicos produzidos por plantas e seus aglicones inibem trealoses presentes em diferentes órgãos de várias ordens de insetos. Essa inibição foi menor em insetos que se alimentam somente de vegetais, provavelmente devido a uma adaptação desses organismos. / The epithelium of S. frugiperda midgut has a trehalase activity that is mainly soluble (90%). The soluble trehalase was purified by several chromatographic steps. The enzyme has an hydrophobic site near the active site. Conformational changes apparently occur in the enzyme when methyl-α-glucoside binds to the active site. Trehalase has a Km=0.37 mM and is a competitively inhibited by methyl-α-glucoside (Ki=89 mM); methyl-α-mannosideo (Ki=6.2 mM); amygdalin (Ki=0.21); prunasin (Ki=0.92 mM); mandelonitrile (Ki=l.14 mM); Tris (Ki=0.55 mM) and salicin (Ki=l9 mM). Phlorizin is an hyperbolic acompetitive inhibitor (α=β=0.35; Ki=0.0087 mM), whereas its aglycon, phloretin, is a non-competitive inhibitor (Ki=0.029 mM). Tris and mandelonitrile bind at the same region in the active site. On the other hand, mandelonitrile and phloretin cannot be bound to the enzyme at the same time. Enzyme pKs (pKe) and enzyme substrate pKs (pKes) were determined from Km and Vmax/Km values obtained at different pHs. The values are: pKe1=4.47; pKe2=8.0l ; pKes1=4.83; pKes2=7.59. Trehalase is not inactivated when incubated with compounds that react with thiol, imidazole or phenol groups. Trealase lose 60% of its activity in the presence of methyl-α-glucoside (acompetitive inhibitor) plus a compound that reacts with imidazole groups. This inactivation is decreased by trehalose, indicating that there is a non-essential histidine in the active site substances that react with carboxyl guanidine groups inactivate the enzyme. The modified groups have pH of respectively, 4.87 and 7.84. The resemblance of these pKs with the one determined from Km and Vmax values suggest that the prototropic groups of the enzyme are in residues of arginine and aspartic acid or glutamic acid. Toxic β-glucosides from plants and their aglycons inhibit trealase from different organs of insects from several orders. This inhibition is lower in herbivorous insects, possibly due to their adaptation in ingesting vegetal tissues.

As L-asparaginases bacterianas (L-asparaginase amidohidrolase, E.C.3.S.1.1) são enzimas de alto valor terapêutico devido ao seu uso no tratamento de leucemia linfocítica aguda. A L-asparaginase da Escherichia coli por ser uma enzima periplásmica com alta afinidade, é particularmente efetiva em certas terapias de câncer infantil. Muitos agentes terapêuticos recentes são proteínas e peptídeos que surgiram do design molecular de drogas e tecnologia de DNA recombinante. Numerosos estudos têm demonstrado que aditivos preservam a estrutura e a atividade biológica de cada molécula destas proteínas. Entretanto, o mecanismo de proteção, pelo qual estes aditivos funcionam, não tem sido totalmente elucidado. O objetivo do presente trabalho é investigar detalhadamente o efeito da liofilização sobre a estrutura e a atividade enzimática da L-asparaginase, tanto em células íntegras de Escherichia coli, como na enzima purificada. Até recentemente a maneira para se avaliar o comportamento de um aditivo e o comportamento da água na estabilização de uma proteína durante a liofilização consistia na medida dos parâmetros de atividade após a reidratação, porém atualmente modernas técnicas de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de baixa resolução são utilizadas para se entender o comportamento da água nas interações com proteínas. E a Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier apresenta grande potencial no estudo de estabilização de proteínas durante a liofilização. Utilizou-se o cálculo de porcentagem de retenção de atividade para expressar os valores de atividade enzimática estudados. Estes cálculos foram realizados para os sistemas congelados e para os sistemas congelados e liofilizados. Os sistemas foram tratados em velocidades de congelamento diferentes (20°C/min, SOC/min e 2°C/min), sendo em seguida liofilizados por 24 horas. São apresentados resultados sobre o efeito das diferentes velocidades de congelamento e o efeito da liofilização nos diferentes sistemas aditivo-enzima e aditivo-célula. Utilizaram-se os aditivos: sacarose, maltose, lactose, inositol, manitol e trealose testados em diferentes concentrações (30, 90 e 150mM). Para identificar quais as condições e os aditivos que apresentaram uma crioproteção satisfatória. Nos sistemas maltose-enzima e trealose-enzima observou-se um aumento da crioproteção com o aumento da concentração de aditivo. Para os sistemas maltose-enzima, congelados lentamente, os resultados de retenção de atividade foram: 8,67%, 14,02% e 30,80% respectivamente para 30, 90 e 150mM. O sistema enzima-maltose (150mM) congelado rapidamente e liofilizado apresentou a maior retenção de atividade (111,11 %) e também o maior valor de T2 (81µs) nos resultados referentes a RMN. Nos sistemas trealose-enzima nas concentrações de 90 e 150mM apresentaram retenção de atividade 89,93% e 79,74%, respectivamente. / Bacterial L-asparaginase (L-asparaginase amidohydrolase, E.C. 3.5.1.1) are enzymes of high therapeutic value due to their use in the treatment of lymphocytic acute leukemia. Escherichia coli L-asparaginase is a periplasmic enzyme of high affinity, particularly effective in some kinds of childhood cancer therapies. Several studies have showed that there are specific stabilizing additives preserve the structure and the biological activity of protein molecules (lyoprotectant). However, the protection mechanism for these excipients has not been totally elucidated yet. The aim of this work was investigate the effect of freeze-drying on the enzymatic activity of L-asparaginase using both the purified enzyme as well as intact cells of Escherichia coli. Until recently the way to evaluate the behavior of an addictive one and the behavior of the water in the stabilization of a protein during the freeze-drying consisted of the measure of the activity parameters after the reidratação, even so now modem techniques of the Nuclear Magnetic Resonance of low resolution have been used to understand the behavior of the water in the interactions with proteins. It is Infrared Spectroscopy for Fourier Transformed it presents a great potential in the study of stabilization of proteins during the freeze-drying. The calculation of percentage of activity retention was used to express the studied values of enzymatic activity. These calculations were accomplished for the frozen systems and for the frozen systems and freeze-dryied. The systems were treated in three speeds of different freezing (20°C/min, 5°C/min and 2°C/min), being the freeze-drying for 24 hours. Results are presented on the effect of the freeze-drying in the different systems addictive-enzyme and addictive-cell. The addictive ones were used: sucrose, maltose, lactose, inositol, manitol and trehalose tested in different concentrations (30, 90 and 150mM), to identify which the conditions and the addictive ones that presented a satisfactory cryoprotection. For the systems enzyme-maltose, frozen slowly, the results of activity retention were: 8,67%, 14,02% e 30,80% to 30,90 e 150mM,respectively . The system enzyme-maltose (150mM) frozen quickly and freeze-dryied presented the largest activity retention (111,11 %) and also the largest value of T2 (81 µs) in the referring results NMR. The systems enzyme-trealose in the concentrations of 90 and 150mM they presented retention of activity 89,93% and 79,74%, respectively.

As L-asparaginases bacterianas (L-asparaginase amidohidrolase, E.C.3.S.1.1) são enzimas de alto valor terapêutico devido ao seu uso no tratamento de leucemia linfocítica aguda. A L-asparaginase da Escherichia coli por ser uma enzima periplásmica com alta afinidade, é particularmente efetiva em certas terapias de câncer infantil. Muitos agentes terapêuticos recentes são proteínas e peptídeos que surgiram do design molecular de drogas e tecnologia de DNA recombinante. Numerosos estudos têm demonstrado que aditivos preservam a estrutura e a atividade biológica de cada molécula destas proteínas. Entretanto, o mecanismo de proteção, pelo qual estes aditivos funcionam, não tem sido totalmente elucidado. O objetivo do presente trabalho é investigar detalhadamente o efeito da liofilização sobre a estrutura e a atividade enzimática da L-asparaginase, tanto em células íntegras de Escherichia coli, como na enzima purificada. Até recentemente a maneira para se avaliar o comportamento de um aditivo e o comportamento da água na estabilização de uma proteína durante a liofilização consistia na medida dos parâmetros de atividade após a reidratação, porém atualmente modernas técnicas de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de baixa resolução são utilizadas para se entender o comportamento da água nas interações com proteínas. E a Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier apresenta grande potencial no estudo de estabilização de proteínas durante a liofilização. Utilizou-se o cálculo de porcentagem de retenção de atividade para expressar os valores de atividade enzimática estudados. Estes cálculos foram realizados para os sistemas congelados e para os sistemas congelados e liofilizados. Os sistemas foram tratados em velocidades de congelamento diferentes (20°C/min, SOC/min e 2°C/min), sendo em seguida liofilizados por 24 horas. São apresentados resultados sobre o efeito das diferentes velocidades de congelamento e o efeito da liofilização nos diferentes sistemas aditivo-enzima e aditivo-célula. Utilizaram-se os aditivos: sacarose, maltose, lactose, inositol, manitol e trealose testados em diferentes concentrações (30, 90 e 150mM). Para identificar quais as condições e os aditivos que apresentaram uma crioproteção satisfatória. Nos sistemas maltose-enzima e trealose-enzima observou-se um aumento da crioproteção com o aumento da concentração de aditivo. Para os sistemas maltose-enzima, congelados lentamente, os resultados de retenção de atividade foram: 8,67%, 14,02% e 30,80% respectivamente para 30, 90 e 150mM. O sistema enzima-maltose (150mM) congelado rapidamente e liofilizado apresentou a maior retenção de atividade (111,11 %) e também o maior valor de T2 (81µs) nos resultados referentes a RMN. Nos sistemas trealose-enzima nas concentrações de 90 e 150mM apresentaram retenção de atividade 89,93% e 79,74%, respectivamente. / Bacterial L-asparaginase (L-asparaginase amidohydrolase, E.C. 3.5.1.1) are enzymes of high therapeutic value due to their use in the treatment of lymphocytic acute leukemia. Escherichia coli L-asparaginase is a periplasmic enzyme of high affinity, particularly effective in some kinds of childhood cancer therapies. Several studies have showed that there are specific stabilizing additives preserve the structure and the biological activity of protein molecules (lyoprotectant). However, the protection mechanism for these excipients has not been totally elucidated yet. The aim of this work was investigate the effect of freeze-drying on the enzymatic activity of L-asparaginase using both the purified enzyme as well as intact cells of Escherichia coli. Until recently the way to evaluate the behavior of an addictive one and the behavior of the water in the stabilization of a protein during the freeze-drying consisted of the measure of the activity parameters after the reidratação, even so now modem techniques of the Nuclear Magnetic Resonance of low resolution have been used to understand the behavior of the water in the interactions with proteins. It is Infrared Spectroscopy for Fourier Transformed it presents a great potential in the study of stabilization of proteins during the freeze-drying. The calculation of percentage of activity retention was used to express the studied values of enzymatic activity. These calculations were accomplished for the frozen systems and for the frozen systems and freeze-dryied. The systems were treated in three speeds of different freezing (20°C/min, 5°C/min and 2°C/min), being the freeze-drying for 24 hours. Results are presented on the effect of the freeze-drying in the different systems addictive-enzyme and addictive-cell. The addictive ones were used: sucrose, maltose, lactose, inositol, manitol and trehalose tested in different concentrations (30, 90 and 150mM), to identify which the conditions and the addictive ones that presented a satisfactory cryoprotection. For the systems enzyme-maltose, frozen slowly, the results of activity retention were: 8,67%, 14,02% e 30,80% to 30,90 e 150mM,respectively . The system enzyme-maltose (150mM) frozen quickly and freeze-dryied presented the largest activity retention (111,11 %) and also the largest value of T2 (81 µs) in the referring results NMR. The systems enzyme-trealose in the concentrations of 90 and 150mM they presented retention of activity 89,93% and 79,74%, respectively.