Der Actinomycet T. fusca KW3, isoliert aus Kompost, bildete während der Kultivierung im Mineralsalz-Spurenelement-Vitamin-Minimalmedium nach Zusatz von PET-Fasern eine 52 kDa Carboxylesterase (TfCa), welche effizient zyklische PET Trimere (CTR) hydrolysiert. Die TfCa besitzt einen pI von 4,8, eine Substratspezifität gegenüber kurzkettigen p-Nitrophenyl-Estern und wird durch Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und Tosyl-L-Phenylalanin-Chloromethylketon (TPCK) in der Aktivität gehemmt. Die Carboxylesterase hydrolysiert kein Cutin oder Poly-ε-caprolacton (PCL). CTR hingegen wurden durch die TfCa mit einem Km von 0,5 mM und einer Vmax von 9,3 μmol/min/mg bei optimalen Bedingungen (60°C, pH 6) hydrolysiert. Das aktive Zentrum der Carboxylesterase besteht aus den Aminosäuren Ser185, Glu319 und His415, wobei das Serin in das katalytische Motiv G-E-S-A-G eingebettet ist. Während der Reaktion setzte die TfCa auch Hydrolyseprodukte aus PET-Fasern und -Filmen frei. Der Nachweis der Hydrolyse erfolgte durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie der Abbauprodukte und bei den PET-Filmen zusätzlich mittels Rasterelektronenmikroskopie. Dabei zeigte die Carboxylesterase verglichen mit anderen PET-Hydrolasen eine geringere Effizienz, was durch die Lage des aktiven Zentrums in einer Bindungstasche und der daraus folgenden schlechten Zugänglichkeit für polymere Substrate begründet werden kann. Bei der Hydrolyse der viel kleineren CTR war die TfCa deutlich effektiver, was auf eine höhere Spezifität gegenüber kurzkettigen PET Substraten hinweist.

Der Actinomycet T. fusca KW3, isoliert aus Kompost, bildete während der Kultivierung im Mineralsalz-Spurenelement-Vitamin-Minimalmedium nach Zusatz von PET-Fasern eine 52 kDa Carboxylesterase (TfCa), welche effizient zyklische PET Trimere (CTR) hydrolysiert. Die TfCa besitzt einen pI von 4,8, eine Substratspezifität gegenüber kurzkettigen p-Nitrophenyl-Estern und wird durch Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und Tosyl-L-Phenylalanin-Chloromethylketon (TPCK) in der Aktivität gehemmt. Die Carboxylesterase hydrolysiert kein Cutin oder Poly-ε-caprolacton (PCL). CTR hingegen wurden durch die TfCa mit einem Km von 0,5 mM und einer Vmax von 9,3 μmol/min/mg bei optimalen Bedingungen (60°C, pH 6) hydrolysiert. Das aktive Zentrum der Carboxylesterase besteht aus den Aminosäuren Ser185, Glu319 und His415, wobei das Serin in das katalytische Motiv G-E-S-A-G eingebettet ist. Während der Reaktion setzte die TfCa auch Hydrolyseprodukte aus PET-Fasern und -Filmen frei. Der Nachweis der Hydrolyse erfolgte durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie der Abbauprodukte und bei den PET-Filmen zusätzlich mittels Rasterelektronenmikroskopie. Dabei zeigte die Carboxylesterase verglichen mit anderen PET-Hydrolasen eine geringere Effizienz, was durch die Lage des aktiven Zentrums in einer Bindungstasche und der daraus folgenden schlechten Zugänglichkeit für polymere Substrate begründet werden kann. Bei der Hydrolyse der viel kleineren CTR war die TfCa deutlich effektiver, was auf eine höhere Spezifität gegenüber kurzkettigen PET Substraten hinweist.:Inhaltsverzeichnis 1 Einführung 1 1.1 Actinomyceten 1 1.1.1 Klassifizierung 1 1.1.2 Thermobifida (Thermomonospora) fusca 2 1.2 Biopolyester Cutin und Suberin 4 1.2.1 Bestandteile des Cutins 4 1.2.2 Bestandteile des Suberins 5 1.2.3 Struktur der Biopolymere 7 1.3 Hydrolasen 12 1.3.1 Struktur und katalytischer Mechanismus 12 1.3.2 Carboxylesterasen 16 1.3.3 Lipasen 19 1.3.4 Cutinasen 22 1.4 Polyethylenterephthalat 23 1.4.1 Konventionelle PET-Faserbehandlung 24 1.4.2 Charakterisierung von PET 26 1.4.3 Biofunktionalisierung von PET 30 1.4.4 PET-Hydrolasen 38 1.5 Zielsetzung 49 2 Material und Methoden 50 2.1 Materialien 50 2.1.1 Verwendete Mikroorganismen 50 2.1.2 Verwendete Enzyme 50 2.1.3 Größenstandards 51 2.1.3.1 Low Molecular Weight Marker (GE Healthcare) 51 2.1.3.2 Roti®-Mark Standard (Fa. Carl Roth GmbH) 51 2.1.3.3 SpectraTM Multicolor Broad range Protein Ladder (Fermentas) 51 2.1.3.4 PageRulerTM plus prestained protein ladder (Fermentas) 51 2.1.3.5 Kalibrierungskit für pI Bestimmung (pH 3-10, GE Healthcare) 52 2.1.3.6 Kalibrierungskit für die Größenausschlusschromatographie (LMW, GE Healthcare) 52 2.1.4 Chemikalien 53 2.1.5 Geräte und Materialien 55 VI 2.1.6 Software 58 2.1.7 Nährmedien 58 2.1.8 Suberin- und Cutin-Präparationen 60 2.1.9 PET-Substrate für die Abbauuntersuchungen 60 2.1.10 Puffer und Lösungen 60 2.2 Mikrobiologische Methoden 65 2.2.1 Stammhaltung und Kultivierung 65 2.2.2 Mikroskopische Untersuchungen 65 2.2.3 Trockengewichtsbestimmung 65 2.3 Proteinchemische Methoden 66 2.3.1 Proteinaufreinigung der Wildtyp TfCa 66 2.3.2 Proteinaufreinigung der rekombinanten TfCa, TfCut1 und TfCut2 67 2.4 Analytische Methoden 67 2.4.1 Esterase-Aktivitätsbestimmung 67 2.4.1.1 Bestimmung mittels Spektrophotometer 68 2.4.1.2 Bestimmung mittels Plattenleser 68 2.4.2 Cutinase-Aktivitätsbestimmung 68 2.4.3 PCL-Abbauuntersuchung 69 2.4.3.1 Bestimmung mittels Hofbildung 69 2.4.3.2 Bestimmung mittels Plattenleser 69 2.4.4 Quantitative Protein-Bestimmung nach Bradford (1976) 69 2.4.5 SDS Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) 70 2.4.5.1 Esteraseaktivitäts-Färbung 70 2.4.5.2 Coomassie-Färbung 71 2.4.5.3 Silberfärbung der Proteine 71 2.4.6 Bestimmung des pI 71 2.4.7 Bestimmung der Molaren Masse 72 2.4.8 Bestimmung der Temperatur und pH-Wert Stabilität 72 2.4.9 Bestimmung der Stabilität gegenüber Inhibitoren 72 2.4.10 Bestimmung der kinetischen Konstanten für die Hydrolyse von p-NP Ester 72 2.4.11 Bestimmung der kinetische Konstanten für die Hydrolyse von CTR 73 2.4.12 Bestimmung optimaler Temperatur und pH-Wert für die Hydrolyse von CTR 73 2.4.13 N-terminale Sequenzierung 73 2.4.14 MALDI-TOF Sequenzierung 74 2.4.15 Abbaustudien 74 VII 2.4.16 Analytik der PET Abbauprodukte 75 2.4.17 Konzentrationabhängige CTR-Abbaustudien 75 2.5 Homologie-Modelling der TfCa und weitere PET-Hydrolasen 76 3 Ergebnisse und Diskussion 77 3.1 Screening nach PET-Hydrolasen aus T. fusca 77 3.1.1 Wachstum von T. fusca KW3 im Czapek-Medium 77 3.1.2 Wachstum von T. fusca KW3 im MSV-Medium 78 3.1.2.1 Esterasebildung mit verschiedenen synthetischen und natürlichen Polyestern 78 3.1.2.2 Esterasebildung mit einer Suberinpräparation 81 3.1.2.3 Esterasebildung mit PET-Fasern 83 3.1.3 Esterasebildung bei T. fusca KW3 DSM 6013, T. fusca DSM 43792 und DSM 43793 mit PET-Fasern und Diethylterephthalat 85 3.2 Charakterisierung der PET-Hydrolasen aus T. fusca KW3 95 3.2.1 Aufreinigung 95 3.2.1.1 Aufreinigung der TfCa 95 3.2.1.2 Aufreinigung der rekombinanten PET-Hydrolasen 105 3.2.2 pI der TfCa 113 3.2.3 Molare Masse der TfCa 113 3.2.4 Temperatur- und pH-Stabilität der TfCa 114 3.2.5 Wirkung von Inhibitoren auf die TfCa 117 3.2.6 Kinetik der Hydrolyse von verschiedenen Esterasesubstraten durch die TfCa 118 3.2.7 Optimale Temperatur und optimaler pH-Wert der CTR-Hydrolyse durch die TfCa 119 3.2.8 Cutinaseaktivität der TfCa 120 3.2.9 PCL-Abbau durch die TfCa 121 3.2.10 N-terminale Sequenz der TfCa 122 3.2.11 MALDI-TOF Sequenzierung der TfCa 123 3.2.12 Homologie-Modeling der TfCa und Vergleich der Struktur mit anderen Hydrolasen 126 3.2.13 Vergleich der TfCa mit bekannten PET-Hydrolasen 128 3.3 Hydrolyse von PET Substraten durch prokaryotische und eukaryotische Hydrolasen 138 3.3.1 Partielle Hydrolyse von APET-Filmen durch die PET-Hydrolasen 140 3.3.2 Partielle Hydrolyse von PET-Fasern durch die PET-Hydrolasen 148 3.3.3 Hydrolyse von PET-Trimeren durch die PET-Hydrolasen 151 4 Zusammenfassung 165 VIII 5 Literaturverzeichnis 166 6 Publikationen 181 7 Poster und Vorträge 182 8 Lebenslauf 183