Made available in DSpace on 2015-12-06T23:03:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O efeito paradoxal (EP) é caracterizado pelo crescimento celular em concentrações de equinocandinas acima da concentração inibitória mínima (CIM). Apesar da resistência a esta classe de drogas ser um fenômeno pouco comum em isolados de Candida spp., a ocorrência do EP é freqüentemente observada entre isolados desta levedura durante os testes de susceptibilidade às equinocandinas. O objetivo deste estudo foi analisar a freqüência do EP da caspofungina (CAS) entre isolados de Candida spp. e avaliar os aspectos morfológicos e os mecanismos moleculares relacionados a este fenômeno. Para tanto, foram utilizados 77 isolados de Candida spp., incluindo 21 isolados de C. albicans, 22 de C. tropicalis, 23 de C. parapsilosis e 11 de C. orthopsilosis. Todos isolados foram submetidos ao teste de susceptibilidade da CAS, segundo recomendações do Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI, documento M27-A3), para determinação da CIM e avaliar a presença do EP. Entre os isolados que apresentaram EP da CAS, foram selecionados dois isolados de cada espécie para aplicação dos demais testes propostos neste estudo. Os ensaios de concentração fungicida mínima (CFM), curva de morte e ensaio de viabilidade celular foram utilizados para avaliar o comportamento das células fúngicas durante o EP. Analisamos ainda as alterações ultraestruturais e bioquímicas da parede celular durante o EP e a expressão de genes relacionados à síntese da parede celular durante este fenômeno. Entre os 77 isolados de Candida spp. analisados, 42 (54,5%) apresentaram o EP da CAS em concentrações que variaram de 4,0 a 32,0 µg/mL de CAS. Os ensaios de viabilidade celular mostraram que as células do EP apresentaram-se viáveis, mesmo quando expostas a altas concentrações de CAS (16 µg/mL). Os ensaios de curva de morte provaram ser mais discriminatórios que MFC para caracterizar o EP, principalmente para isolados de C. parapsilosis e C. orthopsilosis. As quatro espécies de Candida analisadas neste estudo apresentaram um padrão semelhante de alterações ultraestruturais e bioquímicas da parede celular durante o EP. De forma geral, durante o EP houve uma diminuição de 2,7 a 7,8 vezes no conteúdo de β-1,3-glucana e um aumento de 4,0 a 6,6 vezes no conteúdo de quitina da parede celular. Sobre a análise ultraestrutural por microscopia eletrônica, as células do EP apresentaram aumento do tamanho celular, formação de aglomerados celulares, ausência de filamentação e anormalidades no septo de brotamento. Além disso, a parede celular das células do EP apresentou um predomínio da camada mais eletrodensa, indicando uma diminuição da camada de β-1,3-glucana. Por fim, os resultados da análise da expressão gênica sugerem que o aumento da síntese de quitina em células do EP de C. albicans é regulado pelas vias PKC, HOG e Calcineurina-Ca2+. Nossos resultados apresentaram detalhes sobre as alterações morfológicas e ultraestruturais durante o EP, mostrando que as diferentes espécies analisadas apresentaram resposta celular semelhante durante o EP da CAS. Podemos concluir ainda que as células do EP possuem mecanismos adaptativos responsáveis pelo aumento do conteúdo de quitina na parede celular, em resposta à inibição de β- 1,3-glucana. Esses mecanismos permitem que as células do EP sobrevivam a altas concentrações de CAS, sugerindo que a estimulação da síntese de quitina pode representar um mecanismo de escape à atividade desta droga. / The paradoxical growth effect (PG) has been described for echinocandins and is characterized by cellular growth at drug concentrations above the minimal inhibitory concentrations (MIC). Despite resistance to this class of drugs is an unusual phenomenon among Candida isolates, occurrence of PG is frequently observed during susceptibility tests for echinocandins. The aim of this study was to analyze the frequency of PG for caspofungin (CAS) among Candida strains and also to evaluate the morphological aspect, as well as the molecular mechanisms related to this phenomenon. Seventy-seven strains of Candida spp., including 21 isolates of C. albicans, 22 isolates of C. tropicalis, 23 isolates of C. parapsilosis and 11 isolates of C. orthopsilosis were studied. All strains were subjected to susceptibility tests of CAS, as described in the Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI, document M27-A3), to determine the MIC and evaluate the presence of PG. Afterwards, two isolates each of Candida albicans, C. tropicalis, C. orthopsilosis and C. parapsilosis, all of which displayed PG in response to caspofungin, were subjected to MIC, minimal fungicidal concentration (MFC) and time-kill curve assays to evaluate the PG. We also analyzed the ultrastructural and biochemical changes in the cell wall of PG cells and the gene expression related to the synthesis of cell wall during this phenomenon. Of the 77 Candida isolates initially screened, 42 isolates (54.5%) displayed the phenomenon of PG in concentrations ranging from 4.0 to 32.0 µg/mL CAS. C. parapsilosis demonstrated the higher frequency of PG, followed by C. albicans, C. tropicalis and C. orthopsilosis. Cell viability assays showed that the PG cells were viable, even when exposed to high CAS concentrations (16 µg/mL). The time-kill curve assays were more discriminatory than MFC in detecting the PG effect, especially for C. parapsilosis and C. orthopsilosis isolates. The four different Candida species studied demonstrated similar alterations in the cell wall components and ultrastructure associated with PG. In PG cells, β-1,3-glucan content decreased 2.7- to 7.8-fold, whereas chitin content increased 4.0- to 6.6-fold. Electron microscopy study of the PG cells revealed morphological alterations, clumping and enlarged cells, absence of filamentation, abnormal septa and accumulation of chitin in the cell wall. Also, PG cells basically exhibited a single dark high density layer in the cell wall, indicating loss of the β-1,3-glucan layer. Finally, the analysis of gene expression suggests that the increase of chitin synthesis in PG cells of C. albicans is regulated by PKC, HOG and Calcineurin-Ca2+ pathways. Our results showed details about the morphological and ultrastructural alterations during PG, demonstrating that different Candida spp. analyzed presented similar cellular response during PG of CAS. Our findings also suggest that the PG cells have a compensatory mechanism responsible for the increase of chitin content in the cell wall, in response to β-1,3-glucan inhibition. These mechanisms allow the survival of PG cells to high concentrations of CAS, suggesting that stimulation of chitin synthesis may represent a rescue mechanism against caspofungin activity. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

ROBERTO, Ana Emília de Medeiros, também é conhecida em citações bibliográficas por: MEDEIROS, A. E. R. / Submitted by Pedro Barros (pedro.silvabarros@ufpe.br) on 2018-07-11T20:48:52Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Ana Emília de Medeiros Roberto.pdf: 2427887 bytes, checksum: 98fa3502db60df7b1feef1a3e2887aa1 (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-07-13T22:51:41Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Ana Emília de Medeiros Roberto.pdf: 2427887 bytes, checksum: 98fa3502db60df7b1feef1a3e2887aa1 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-13T22:51:42Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Ana Emília de Medeiros Roberto.pdf: 2427887 bytes, checksum: 98fa3502db60df7b1feef1a3e2887aa1 (MD5) Previous issue date: 2016-03-01 / CAPES / Observa-se um contínuo aumento na resistência de espécies de Candida aos antifúngicos disponíveis. Faz-se necessário que o diagnóstico seja oportuno e verossímil, associado à indicação terapêutica que é corretamente direcionada a partir de testes de sensibilidade antifúngica in vitro. A utilização da espectrometria de massas através da técnica de Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation Time-Of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) que reduz o tempo de diagnóstico em comparação com métodos de rotina já é uma realidade, contudo estudos apontam a capacidade dessa metodologia em identificar cepas resistentes pela detecção de mudanças mínimas no perfil proteíco da cepa após exposição ao fármaco. Assim, objetivou-se diagnosticar, em pacientes internados em UTI, isolados clínicos do complexo Candida parapsilosis lato sensu (Candida parapsilosis stricto sensu, Candida orthopsilosis e Candida metapsilosis) através da técnica proteômica Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) e correlacionar sua sensibilidade/resistência às equinocandinas com mudanças no espectro protéico. Trata-se de uma pesquisa experimental analítica com abordagem qualitativa. Amostras sanguíneas venosas foram coletadas entre agosto de 2014 e julho de 2015, a partir de pacientes internados em UTI, foram observadas ao exame direto e colhidas em frascos de hemocultura. As leveduras isoladas foram identificadas por MALDI-TOF MS e testes de sensibilidade antifúngica foram realizados através do CLSI frente a anidulafungina, caspofungina e micafungina. A detecção na resistência através da mudança mínima do plano espectral protéico obtida no MALDI-TOF MS, foi possível após o cruzamento de cada concentração do espectro com uma das duas concentrações extremas, máxima ou nula, onde formou-se uma matriz a partir do Índice de Correlação do Composto (ICC) utilizado para gerar mapas de calor. Foram diagnosticados 44 casos de candidemia, sendo 26 por Candida parapsilosis, dez C. albicans, dois casos por C. metapsilosis, dois C. orthopsilosis, dois por C. tropicalis, um C. haemulonii e um Candida sp. Vinte e oito (93,2%) isolados do complexo Candida parapsilosis foram sensíveis as equinocandinas de acordo com CLSI e 24 (79,9%) foram sensíveis de acordo com MALDI-TOF. A Concentração Inibitória Mínima e a Mudança Mínima no Perfil Protéico obtidos através do CLSI e MALDI-TOF, apresentaram concordância de 91,6%, 96,6% e 98,3% para anidulafungina, caspofungina e micafungina, respectivamente, frente os isolados de Candida parapsilosis. MALDI-TOF MS é capaz de determinar o breakpoint de uma levedura clínica após 15 horas de exposição ao antifúngico e permite predizer a melhor escolha antifúngica para pacientes críticos com candidemia. / Recently, there is an increase in resistance of Candida species to antifungal drugs available. It is necessary that the diagnosis is timely and credible associated with therapeutic indication that is directed from in vitro antifungal susceptibility testing. The use of mass spectrometry through the technique of Matrix Assisted Laser Desorption / Ionisation Time-Of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS), which reduces the time of diagnosis as compared to routine methods is already a reality, however pointed studies this methodology can identify resistant strains by detecting minimal changes in protein profile of strain after exposure. Thus, the objective was to diagnose in ICU patients, clinical isolates of complex Candida parapsilosis lato sensu (Candida parapsilosis stricto sensu, Candida orthopsilosis and Candida metapsilosis) through proteomic technique Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) and correlate their sensitivity/resistance to echinocandins with changes in the protein spectrum. It is an analytical experimental research with qualitative approach. Venous blood samples were collected between August 2014 and July 2015, from ICU patients were observed in the direct examination and harvested in blood culture bottles. The yeasts were identified by MALDI-TOF MS and sensitivity tests were performed using CLSI antifungal and MALDI-TOF MS, compared to anidulafungin, caspofungin and micafungin. After crossing every spectrum concentration with one of the two extreme concentrations, maximum or zero, formed the matrix of Compound Correlation Index (ICC) used to generate heat maps. 44 cases of candidemia were diagnosed, 26 by Candida parapsilosis ten C. albicans, two cases of C. metapsilosis two C. orthopsilosis two by C. tropicalis, a C. haemulonii and one case of Candida sp. Twenty-eight (93.2%) isolates of Candida parapsilosis complex echinocandins according to CLSI and 24 were sensitive (79.9%) were sensitive according to MALDI-TOF. The Minimum Inhibitory Concentration and Minimum Change in Protein Profile obtained by CLSI and MALDI-TOF showed concordance of 91.6%, 96.6% and 98.3% for anidulafungin, caspofungin and micafungin, respectively, compared isolates Candida parapsilosis. MALDI-TOF MS is able to determine the breakpoint of a clinical yeast after 15 hours of exposure to antifungal and allows predicting the best antifungal choice for critically ill patients with candidemia

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:46:41Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013 / Candidemia persistente tem sido descrita como uma complicacao do quadro de candidemia, caracterizada pelo isolamento de Candida spp. em amostras sequenciais de hemocultura apos o diagnostico inicial, mesmo em pacientes expostos ao tratamento antifungico adequado. Embora fatores predisponentes relacionados ao hospedeiro ja estejam bem estabelecidos, poucos estudos tem analisado os atributos do patogeno envolvidos no desenvolvimento dessa complicacao. O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrencia de resistencia as equinocandinas em isolados de Candida spp. provenientes de pacientes com candidemia persistente submetidos a terapia antifungica com esta classe de farmaco. As amostras foram identificadas atraves de sequenciamento da regiao ITS do rDNA. O perfil de susceptibilidade in vitro aos antifungicos foi realizado utilizando metodologia de microdiluicao em caldo (CLSI, documento M27-S4). Alem disso, nos avaliamos a ocorrencia de resistencia a partir do sequenciamento do gene FKS1. Dentre 436 pacientes com candidemia, 63 (14,4%) apresentaram quadros de candidemia persistente, desses, 13 atenderam aos criterios de inclusao estabelecidos no presente estudo. Atraves das identificacoes fenotipica e molecular, foi observado 5 dos 13 pacientes (38,5%) foram infectados por isolados de C. parapsilosis (sensu stricto), 3 (23%) por isolados de C. albicans, 2 (15,4%) por isolados de C. krusei, 1 (7,7%) por isolado de C. tropicalis e 1 (7,7%) teve como agente etiologico da candidemia isolados de C. orthopsilosis. Alem disso, um paciente (7,7%) apresentou episodio de infeccao mista com alternancia de isolamento de duas diferentes especies, C. tropicalis e C. parasilosis (sensu stricto). Em relacao ao perfil de susceptibilidade aos antifungicos, a grande maioria dos isolados foi classificada como sensivel a todos os antifungicos testados, com excecao dos cinco isolados de C. krusei provenientes dos pacientes 2 (dois isolados) e 10 (tres isolados), os quais apresentaram resistencia ao fluconazol e a caspofungina, sendo que dois deles foram intermediarios a anidulafungina. Nao foi verificado aumento de valores de CIM entre os isolados sequenciais de um mesmo paciente a despeito do tratamento antifungico utilizado. Nenhum dos isolados apresentou mutacao nas regioes dos HS1 e HS2 do gene FKS1, sendo classificados como selvagens em relacao aos genotipos de resistencia ja descritos. Por outro lado, os isolados de C. krusei apresentaram mutacao nao sinonima em regiao muito proxima ao HS1, o que poderia, ao menos em parte, explicar o desfecho clinico negativo durante tratamento com equinocandinas e os elevados valores de CIM observados para estes isolados. Os dados obtidos no presente estudo mostram que a ocorrencia de resistencia as equinocandinas ainda permanece rara em nosso meio, mesmo quando analisada em coorte de pacientes com risco elevado a ocorrencia de tal fenomeno. Por fim, conclui-se que as caracteristicas clinicas do paciente parecem ter maior relevancia que os mecanismos de resistencia as equinocandinas no que se refere a ocorrencia de candidemia persistente / BV UNIFESP: Teses e dissertações