Orientador: Rosicleire Veríssimo Silveira / Resumo: Frente ao cenário de mudanças climáticas estabelecidas e consequentemente às alterações da temperatura global, torna-se essencial estudar os seus efeitos na espermatogênese dos animais. Sendo assim, objetivou-se caracterizar morfológica e estereológicamente os tipos celulares encontrados na espermatogênese do lambari Astyanax altiparanae, além de determinar as fases testiculares e a verificar a duração da espermatogênese em diferentes temperaturas. Para tal, noventa e seis espécimes machos e adultos de A. altiparanae foram mantidos em sistema de circulação fechada sob temperatura da água estabilizada à 27ºC (temperatura de conforto) e 32ºC. Posteriormente, os espécimes receberam pulsos de BrdU (bromodeoxiuridina) na concentração de 100 mg/Kg/dia por 2 dias consecutivos, sendo as coletas realizadas diariamente por um período de 15 dias. Os testículos foram removidos, fixados, processados, incluídos em historesina e seccionados a 3µm, submetidos a colorações de Hematoxilina/Eosina e a técnicas de imunodetecção de BrdU. Os resultados obtidos a partir da temperatura de conforto da espécie permitiram classificar as espermatogônias de A. altiparanae em A-indiferenciadas*, A-indiferenciadas, A-diferenciadas e espermatogônias B. Assim como, caracterizar o ciclo reprodutivo da espécie em Regredido, Maturação Inicial, Maturação Intermediária, Maturação Final e em Regressão. A duração da espermatogênese foi determinada em aproximadamente seis dias para animais em 27°C e um dia para ani... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In view of the scenario of the established climate changes and the consequent changes in the global temperature, it is essential to study its effects on animal spermatogenesis. Therefore, the objective of this work was to characterize, morphologically and stereologically, the cell types found in spermatogenesis of the yellow-tetra Astyanax altiparanae, to determin the testicular phases and to verify the spermatogenesis duration at different temperatures. For this purpose, ninety-six male and adult specimens of A. altiparanae were kept in a closed circulation system under water temperature stabilized at 27ºC (comfort temperature) and 32ºC. Subsequently, the specimens received pulses of BrdU (bromodeoxyuridine) at a concentration of 100 mg/kg/day for 2 consecutive days, and samples were collected daily during a period of 15 days. Their testes were removed, fixed, processed in historesin and sectioned in 3 µm, submitted to Hematoxylin/Eosin and to BrdU immunodetcion. Partial results of the comfort temperature allowed to classify the A. altiparanae spermatogonia in Aind*, Aind, Adif and B. Moreover, the reproductive cycle of the species was classified in Regressed, Initial Maturation, Mid Maturation, Final Maturation and Regression. It was possible to conclude that the spermatogenesis duration was determined in approximately six days for animals at 27°C and one day for animals at 32°C. In addition, the elevated temperature was also responsible for increased cell proliferation in ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

As células tronco espermatogoniais (SSCs) são caracterizadas pela capacidade de autorrenovação, proliferação e transmissão das informações genéticas. Em caninos a primeira tentativa de xenotransplante não obteve o sucesso da produção de espermatozoides, no entanto, há evidências de que as células testiculares xenogênicas podem ser transplantadas no testículo do animal hospedeiro, e gerar espermatozoides viáveis do doador. Portanto, este estudo tem como objetivo realizar o xenotransplante das células germinativas caninas em camundongos imunosuprimidos, e com isto promover à produção de espermatozoides caninos viáveis, geneticamente modificados. E por meio desta técnica, analisar a eficiência da espermatogênese pós-transplante. Células germinativas testiculares foram caracterizadas, isoladas e cultivadas de cães pré-púberes, por meio de sistemas de cultura de enriquecimento e fatores de crescimento. As células foram transduzidas com um gene repórter GFP e LacZ, e por um vetor lentiviral para indentificar as SSCs nos testículos receptores. As SSCs transduzidas foram transplantadas nos testículos de camundongos (C57BL/6) tratados com Busulfan, após diferentes períodos os animais receptores foram eutanasiados e analisados. Aos 10 dias de cultivo as células germinativas adultas foram positivas para CD49f, CD117, e com 5 dias uma expressão semelhante de GFRA1 e DAZL, demonstrando a presença de SSCs e algumas células em meiose. Transplantamos 105 células e 20-43% das células transplantadas foram identificadas na membrana basal dos túbulos seminíferos do animal receptor. Portanto, o transplante das células germinativas caninas, mostrou que a purificação e o cultivo realizados são possíveis para obter SSCs caninas, as quais colonizaram os túbulos seminíferos dos camundongos imunodeficientes e mantiveram-se vivas na membrana basal por 90 dias após transplante, mesmo que estes animais tenham distância filogenética / The spermatogonial stem cells (SSCs) are characterized by the capacity for self-renewal, proliferation and transmission of genetic information. In canines the first attempt to xenotransplantation did not achieve the success of sperm production. However, there is evidence that testicular xenogeneic cells can be transplanted into the testis of the host animal, and generate viable sperm donor. Therefore, this study aims conduct xenotransplantation of the canine germ cells in immunosuppressed mice, and thereby promote the production of viable sperm canines, genetically modified. And by this technique, analyze the efficiency of post-transplant spermatogenesis. Testicular germ cells were identified, isolated and cultured prepuberes dogs through enrichment culture systems and growth factors. Cells were modificated with a reporter gene GFP and LacZ. The SSCs canine was transplanted in mice (C57Bl/6), after different period and then the recipient animals were euthanized and analyzed. After 10 days in culture the germ cells were positive for CD49f, CD117, and 5 days a similar expression of GFRA1 and DAZL was observed, demonstrating the presence of SSCs and some cells in meiosis. 105 cells were transplanted and 20-43% of the transplanted cells were identified in the basement membrane of the seminiferous tubules after 90 days after transplantation. Therefore, the transplantation of canine germ cells showed that the cultivation and purification are performed possible for canine SSCs, it can colonize the seminiferous tubules the mice infertility remained alive in the basement membrane for 90 days after transplanting, even though these animals have phylogenetic distance

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:51Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-22 / As espermatogônias tronco são células responsáveis pela produção contínua dos gametas masculinos, os espermatozóides. Essas células se diferenciam a partir dos gonócitos, porém, pouco se sabe sobre sua biologia e sobre os processos pelos quais elas se diferenciam. Embora sejam células de grande importância, não há informações precisas sobre a dinâmica de formação dessas células a partir dos gonócitos nem sobre o número total e a distribuição das espermatogônias indiferenciadas nos testículos, o que dificulta a interpretação de estudos nessa área. A proposta deste trabalho foi analisar a proliferação, morte e distribuição dos gonócitos e pré-espermatogônias nos testículos de ratos no desenvolvimento embrionário e pós-natal, em períodos críticos do desenvolvimento testicular. Foram utilizados ratos com idades de 19dpc, 1, 3, 5, 8, 11 e 15dpp, cujos testículos foram analisados quanto à distribuição, proliferação e apoptose dos gonócitos e pré-espermatogônias durante o desenvolvimento testicular. A análise morfológica dos testículos, o método de TUNEL, a imunomarcação das proteínas p53 e caspase-3 clivada foram empregados para investigação de apoptose, enquanto a densidade numérica (Nv), quantificação de gonócitos, densidade de comprimento cordonal (Lv), comprimento cordonal total (L), volume total dos cordões seminíferos e estimativa do número total de gonócitos foram utilizados para investigação da distribuição dessas células. A citometria de fluxo foi empregada para avaliar a proliferação dos gonócitos através do uso do kit Guava Cell Cycle. Para identificar as espermatogônias indiferenciadas nas idades de 11 e 15dpc foi utilizada a imunomarcação da proteína OCT4. Durante a análise morfológica testicular observou-se que ocorre redução do número de gonócitos por seção testicular nos primeiros cinco dias após o nascimento e que as primeiras espermatogônias são observadas aos 8dpp. Foi observado aumento da Lv nos animais de 1dpp em relação aos de 19dpc. Dos 3 aos 11dpp, houve aumento progressivo da Lv, que voltou a diminuir aos 15dpp. Houve crescimento muito acentuado dos cordões seminíferos entre 19dpc e 1dpp. Após o nascimento, o crescimento continuou até os 15dpp, mas foi menos intenso. Já a Nv de gonócitos foi inversamente proporcional ao crescimento testicular, enquanto o número estimado de gonócitos foi cerca de quatro vezes maior aos 1dpp em relação aos de 19dpc. Isto explica os dados obtidos a partir da análise morfológica na qual a frequência de gonócitos por seção testicular diminuiu nos cinco primeiros dias após o nascimento. Após o nascimento, o número de gonócitos permaneceu estável até os 5dpp, sugerindo que não há morte ou proliferação dessas células nessas idades. Não foram detectados gonócitos em apoptose nas idades estudadas, embora corpos apoptóticos tenham sido observados. Esses corpos apoptóticos eram muito raros dos 19dpc aos 5dpp e começaram a se tornar mais frequentes aos 8dpp, atingindo sua frequência máxima aos 15dpp. Também aos 15dpp, células positivas para TUNEL e caspase 3 clivada foram observadas, mas essas células não puderam ser identificadas devido ao fato de sua morfologia já estar consideravelmente alterada. Contudo, todos os gonócitos de 19dpc até 8dpp foram positivos ao emprego da caspase-3 clivada, embora apresentassem morfologia normal. Isto indica que a caspase-3 clivada pode ter outra função, que não seja apoptótica, no desenvolvimento dos gonócitos. A análise ao citômetro de fluxo nas idades de 19dpc a 5dpp mostrou que mais da metade dos gonócitos encontravam-se em fase G0/G1 do ciclo celular, indicando que muitas estão em quiescência nestas idades. Não houve marcação da proteína OCT4 nas espermatogônias, o que impossibilitou a quantificação dessas células nas idades de 8, 11 e 15dpp. Os dados do presente estudo sugerem que a diminuição da frequência de gonócitos por seção testicular nos primeiros dias após o nascimento não é consequência de apoptose dessas células, como tem sido sugerido na literatura, mas sim de sua redistribuição ao longo dos cordões seminíferos. Como não há indícios de que estas células estejam proliferando nessas idades, menos gonócitos são observados por seção testicular. Concluiu-se ainda que a proteína OCT4 não está presente nos testículos de rato nas idades pós-natais, diferentemente do observado em camundongo. Estudos estão sendo realizados para verificar quando os gonócitos retomam a proliferação, quando a população definitiva de espermatogônias tronco é formada e quais seriam os marcadores ideais para estudos das espermatogônias indiferenciadas no rato. / Spermatogonial stem cells (SSC) are responsible for the constant production of the male gamete. These cells differentiate from the gonocytes, but little is known about its biology and about the mechanisms of their differentiation. Despite the importance of these cells, the information about the dynamic of formation of these cells from the gonocytes or about the total number and distribution of the undifferentiated spermatogonia is not precise, causing problems to the interpretation of the studies in this area. The goal of this study was to analyze the proliferation, death and distribution of the gonocytes and pre-spermatogonia in the rat testis in embryonic and postnatal life. Rat testes were collected at 19dpc and at 1, 3, 5, 8, 11 and 15dpp for the analysis of the distribution, proliferation and apoptosis of the gonocytes and pre-spermatogonia during key periods of testicular development. To investigate gonocyte apoptosis, four methods were used: morphological analysis, TUNEL method and immunostaining of p53 and cleaved caspase 3. The number of gonocytes was investigated using the numerical density (Nv) and an estimative of the total number of these cells was obtained. These data were associated with the seminiferous cord length density (Lv), the total cordonal length (L) the total volume of the seminiferous cords and the total estimated number of gonocytes were used to investigate the distribution of these cells. Guava flow citometry was used to evaluate the proliferation of the gonocytes. To identify the undifferentiated spermatogonia at 11 and 15dpp, OCT4 labeling was used. During testicular morphological analysis it was observed a reduction of the number of the gonocytes per testicular section during the first five days after birth and the first spermatogonial cells were seen at 8dpp. The Lv increased in the 1dpp rats in relation to 19dpc rats. From 3 to 11dpp, Lv increased progressively and subsequently decreased at 15dpp. There was very accentuated growth of the seminiferous cords (L) between 19dpc and 1dpp. The growth progressed until 15dpp, although it was less intense. The gonocyte Nv was inversely proportional to the seminiferous cord growth, while the total estimated number of gonocytes was about four times higher at 1dpp in relation to the 19dpc embryos. This explains the data obtained from morphological analysis, in which the frequency of gonocytes per testicular section decreased in the first days after birth. The number of gonocytes remained stable from 1 to 5dpp, suggesting that the gonocytes do not die or proliferate in this period. Apoptotic gonocytes were not detected in all ages, although apoptotic bodies were observed. These apoptotic bodies were rare between 19dpc and 5dpp, and at 8dpp they became more frequent, and reached the highest frequency at 15dpp. Also at 15dpp, TUNEL positive-cells and cleaved caspase3-positive cells were observed, although these cells could not be indentified due to the fact that their morphology was already changed. Nevertheless, all gonocytes between 19dpc and 8dpp were positive to cleaved caspase-3, although they presented normal morphology. This suggests that cleaved caspase-3 could have other function that not apoptotic in gonocytes development. The flow citometry analysis between 19dpc and 5dpp showed that more than half of the gonocytes was at G0/G1 phase of the cell cycle, proving that lots of them are quiescent in these ages. There were no OCT4-positive spermatogonia, what impaired the quantification of these cells at 8, 11 and 15dpp. The data of this study suggest that the decrease in the frequency of gonocytes per testicular section in the first days after birth is not due to apoptosis, as has been suggested in the literature, but rather to their redistribution throughout the seminiferous cords. Since there is no evidence that these cells are proliferating in these ages, less gonocytes are seen per testicular section. It has also been concluded that OCT4 protein is not present in rat testis in postnatal ages, differing from what is observed in the mouse testis. Further studies are been performed to verify when gonocytes resume its proliferation, when the final SSC population is established and which markers could be useful to study undifferentiated spermatogonia in the rat. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

As células tronco espermatogoniais (SSCs) são caracterizadas pela capacidade de autorrenovação, proliferação e transmissão das informações genéticas. Em caninos a primeira tentativa de xenotransplante não obteve o sucesso da produção de espermatozoides, no entanto, há evidências de que as células testiculares xenogênicas podem ser transplantadas no testículo do animal hospedeiro, e gerar espermatozoides viáveis do doador. Portanto, este estudo tem como objetivo realizar o xenotransplante das células germinativas caninas em camundongos imunosuprimidos, e com isto promover à produção de espermatozoides caninos viáveis, geneticamente modificados. E por meio desta técnica, analisar a eficiência da espermatogênese pós-transplante. Células germinativas testiculares foram caracterizadas, isoladas e cultivadas de cães pré-púberes, por meio de sistemas de cultura de enriquecimento e fatores de crescimento. As células foram transduzidas com um gene repórter GFP e LacZ, e por um vetor lentiviral para indentificar as SSCs nos testículos receptores. As SSCs transduzidas foram transplantadas nos testículos de camundongos (C57BL/6) tratados com Busulfan, após diferentes períodos os animais receptores foram eutanasiados e analisados. Aos 10 dias de cultivo as células germinativas adultas foram positivas para CD49f, CD117, e com 5 dias uma expressão semelhante de GFRA1 e DAZL, demonstrando a presença de SSCs e algumas células em meiose. Transplantamos 105 células e 20-43% das células transplantadas foram identificadas na membrana basal dos túbulos seminíferos do animal receptor. Portanto, o transplante das células germinativas caninas, mostrou que a purificação e o cultivo realizados são possíveis para obter SSCs caninas, as quais colonizaram os túbulos seminíferos dos camundongos imunodeficientes e mantiveram-se vivas na membrana basal por 90 dias após transplante, mesmo que estes animais tenham distância filogenética / The spermatogonial stem cells (SSCs) are characterized by the capacity for self-renewal, proliferation and transmission of genetic information. In canines the first attempt to xenotransplantation did not achieve the success of sperm production. However, there is evidence that testicular xenogeneic cells can be transplanted into the testis of the host animal, and generate viable sperm donor. Therefore, this study aims conduct xenotransplantation of the canine germ cells in immunosuppressed mice, and thereby promote the production of viable sperm canines, genetically modified. And by this technique, analyze the efficiency of post-transplant spermatogenesis. Testicular germ cells were identified, isolated and cultured prepuberes dogs through enrichment culture systems and growth factors. Cells were modificated with a reporter gene GFP and LacZ. The SSCs canine was transplanted in mice (C57Bl/6), after different period and then the recipient animals were euthanized and analyzed. After 10 days in culture the germ cells were positive for CD49f, CD117, and 5 days a similar expression of GFRA1 and DAZL was observed, demonstrating the presence of SSCs and some cells in meiosis. 105 cells were transplanted and 20-43% of the transplanted cells were identified in the basement membrane of the seminiferous tubules after 90 days after transplantation. Therefore, the transplantation of canine germ cells showed that the cultivation and purification are performed possible for canine SSCs, it can colonize the seminiferous tubules the mice infertility remained alive in the basement membrane for 90 days after transplanting, even though these animals have phylogenetic distance

Machos adultos de P. lineatus tiveram suas gônadas processadas de acordo com as rotinas de microscopia de luz e microscopia eletrônica de transmissão. Para a cultura de células, os testículos foram digeridos enzimaticamente, a suspensão testicular foi separada por gradiente descontínuo com Percoll seguido pelo plaqueamento diferencial por adesão e as células foram cultivadas. Foi realizado o método de enriquecimento das espermatogônias por citometria de fluxo. Os testículos apresentam as regiões anterior, média e posterior com distribuição semelhante dos tipos de células, e o diâmetro nuclear das células germinativas diminui significativamente durante a espermatogênese. As espermatogônias cultivadas por 15 dias com meio para proliferação celular resultaram em grandes aglomerados celulares que foram caracterizados com o anti-Vasa, anti-GFRa1 e anti-OCT4. As culturas que receberam o meio para diferenciação celular mostraram processo de proliferação lento das espermatogônias primárias comparado com a cultura que teve o meio indicado para proliferação celular. / Adult males of P. lineatus had their gonads used according routines of light microscopy and transmission electron microscopy. For cell culture, the testes were enzymatically digested; testicular suspension was separated by discontinuous gradient with Percoll followed by adhesion differential plating and the cells were cultured. The enrichment of the spermatogonia was carried by flow cytometry. The testes present three regions with similar distribution of cell types, and nuclear diameter of germ cells decreases significantly during spermatogenesis. The spermatogonia cultured for 15 days with medium for cell proliferation, resulted in large cell agglomerates which were characterized with the antibodies anti-Vasa, anti-GFRa1 and anti-anti-OCT4. The cultures that receiving medium for cell differentiation showed slow proliferation process of primary spermatogonia compared to cell culture medium suggestive for cell differentiation.

Machos adultos de P. lineatus tiveram suas gônadas processadas de acordo com as rotinas de microscopia de luz e microscopia eletrônica de transmissão. Para a cultura de células, os testículos foram digeridos enzimaticamente, a suspensão testicular foi separada por gradiente descontínuo com Percoll seguido pelo plaqueamento diferencial por adesão e as células foram cultivadas. Foi realizado o método de enriquecimento das espermatogônias por citometria de fluxo. Os testículos apresentam as regiões anterior, média e posterior com distribuição semelhante dos tipos de células, e o diâmetro nuclear das células germinativas diminui significativamente durante a espermatogênese. As espermatogônias cultivadas por 15 dias com meio para proliferação celular resultaram em grandes aglomerados celulares que foram caracterizados com o anti-Vasa, anti-GFRa1 e anti-OCT4. As culturas que receberam o meio para diferenciação celular mostraram processo de proliferação lento das espermatogônias primárias comparado com a cultura que teve o meio indicado para proliferação celular. / Adult males of P. lineatus had their gonads used according routines of light microscopy and transmission electron microscopy. For cell culture, the testes were enzymatically digested; testicular suspension was separated by discontinuous gradient with Percoll followed by adhesion differential plating and the cells were cultured. The enrichment of the spermatogonia was carried by flow cytometry. The testes present three regions with similar distribution of cell types, and nuclear diameter of germ cells decreases significantly during spermatogenesis. The spermatogonia cultured for 15 days with medium for cell proliferation, resulted in large cell agglomerates which were characterized with the antibodies anti-Vasa, anti-GFRa1 and anti-anti-OCT4. The cultures that receiving medium for cell differentiation showed slow proliferation process of primary spermatogonia compared to cell culture medium suggestive for cell differentiation.