CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / No presente estudo foram caracterizados diferentes mecanismos de proteÃÃo oxidativa do cajueiro, espÃcie adaptada ao semi-Ãrido, frente aos efeitos isolados e combinados dos estresses salino, hÃdrico e temperatura elevada. Para tanto, foram realizados estudos para avaliar as alteraÃÃes oxidativas induzidas pelos estresses salino, hÃdrico, temperatura elevada e pelas combinaÃÃes dos estresses salino e hÃdrico com temperaturas elevadas na espÃcie. Os resultados demonstram que o cajueiro apresenta alta capacidade de proteÃÃo oxidativa frente os estresses salino e hÃdrico. Essa proteÃÃo està associada à restriÃÃo estomÃtica, manutenÃÃo do status hÃdrico e eficiente interaÃÃo dos sistemas antioxidantes enzimÃtico e nÃo enzimÃticos, impedindo o acÃmulo de H2O2 e a peroxidaÃÃo de lipÃdios. Durante o estresse salino, as enzimas SOD, CAT e os antioxidantes ASA e GSH foram os principais responsÃveis pela proteÃÃo oxidativa, enquanto sob condiÃÃes de seca ocorreu predominÃncia das enzimas SOD e APX, associadas aos sistemas ASA e GSH. Temperaturas acima de 35 ÂC induzem estresse oxidativo na espÃcie, atribuÃdo ao acÃmulo de H2O2 e a peroxidaÃÃo de lipÃdios, provavelmente associada à induÃÃo de fotorrespiraÃÃo. O estresse tÃrmico apresentou intensa modulaÃÃo dos sistemas de proteÃÃo oxidativa enzimÃtico (SOD-CAT-APX) e nÃo enzimÃtico (ASA e GSH), indicando o papel desses antioxidantes na proteÃÃo oxidativa durante temperaturas elevadas. As plÃntulas submetidas à combinaÃÃo de salinidade e temperatura elevada apresentaram maior restriÃÃo estomÃtica, comparadas Ãquelas expostas a combinaÃÃo de seca e temperatura alta. Esse resultado indica que o estresse salino pode levar a maior limitaÃÃo da dissipaÃÃo de calor, via fluxo transpiratÃrio, que o estresse hÃdrico, durante exposiÃÃo de plantas a temperaturas elevadas. A salinidade limitou a atividade da APX nas plÃntulas submetidas ao estresse tÃrmico, sugerindo que o estresse salino pode afetar o papel da APX na proteÃÃo oxidativa durante temperaturas elevadas. Durante a exposiÃÃo das plÃntulas a temperaturas elevadas o estresse hÃdrico limitou mais a atividade dos sistemas antioxidantes SOD-CAT-APX e ASA e GSH, comparado ao estresse salino. Essa restriÃÃo ocorreu associada ao maior nÃvel de injÃrias oxidativas nas plÃntulas expostas a combinaÃÃo de seca e calor. Os resultados demonstram que temperaturas elevadas à o principal estresse abiÃtico que causa dano oxidativo na espÃcie e que a combinaÃÃo dos estresses hÃdrico e temperatura elevada està mais associada a dano oxidativo do que a combinaÃÃo de salinidade e temperatura alta. No geral, os resultados mostram que as alteraÃÃes oxidativas atribuÃdas à combinaÃÃo de seca e calor ou salinidade e calor, sÃo distintas daquelas associadas aos estresses isolados. Indicam ainda, que as mudanÃas induzidas pela combinaÃÃo de seca e calor ou salinidade e calor nÃo podem ser estimadas com base nos efeitos isolados dos respectivos estresses. / In the present study, different biochemical and physiological mechanisms associated with oxidative protection were characterized in a semi-arid adapted species (cashew) submitted to drought, salinity and heat applied individually or in combination. The results demonstrate that cashew show high antioxidant capacity against the isolated effects of drought and salinity. This antioxidant protection is associated with the maintenance of the water status and the efficient interaction of the enzymatic and nonenzymatic antioxidant systems, avoiding H2O2 accumulation and lipid peroxidation. The activity of SOD and CAT, as the ASA and GSH antioxidants play a central role in oxidative protection in salt-treated plants, while the activity of SOD and APX associated with ASA and GSH are essential in plants exposed to drought. Oxidative stress is induced in cashew plants submitted to temperatures above 35 ÂC, as indicated by H2O2 accumulation and lipid peroxidation, which may be due to enhanced photorespiration. The antioxidant enzymatic (SOD-CAT-APX) and nonenzymatic (ASA e GSH) systems are intensively modulated by heat stress. Salt-pretreated plants show higher stomatic restriction under heat stress than those previously exposed to drought. This results evidence that salt stress limits heat dissipation through transpiration more than drought when plants are exposed to high temperatures. APX activity is reduced in salt-pretreated plants under heat stress in comparison with drought-pretreated plants, suggesting that salinity could prominently affect the antioxidant role of this enzyme. Conversely, the antioxidant systems are dramatically restricted in drought-pretreated plants in relation to those initially exposed to salinity when these plants are subjected to high temperatures. This restriction may be associated with high oxidative injuries in plants exposed to drought followed by heat stress. According to the results of this work, high temperatures applied individually or in combination with drought enable oxidative stress more than salt stress associated with heat. In general, oxidative changes induced by drought and heat or salinity and heat are distinct from those triggered by these factors applied individually, as the metabolic alterations caused by combined stresses could not be estimated from the specific responses to drought, salinity or heat.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / In this study were characterized biochemical and physiological mechanisms arising from photoinhibition that act in the modulation of photochemical activity and oxidative protection, helping to reduce photo oxidative damage in response to drought and high light stresses in cashew plants. The seedlings were obtained from seeds and grown in substrates by mixing sand and vermiculite (ratio 1:1) in plastic bags, with a volume of 2 liters. Drought stress was imposed by withholding the water supply to the plants ( 20 days) in greenhouse conditions. For exposure to light treatments and recovery to the light effect, the plants were placed in a chamber with controlled conditions of relative humidity (60% Â5) and temperature (30ÂC Â2). The plants subjected to drought stress showed a marked decrease in photosynthesis when exposed to excess light (combination of drought with high luminosity), compared with those irrigated. This higher sensitivity of CO2 fixation to excess light on plants under drought was associated with a higher intensity of damage to the photochemical apparatus, as indicated by measures of effective quantum efficiency and apparent electron transport rate. The data show that the reduction of photosynthetic activity in response to excess light, has been attributed in part to process photoinhibition occurred under these conditions as shown by a drastic reduction in potential maximum quantum efficiency of PSII (given by Fv/Fm ratio). The results also suggest that the intense photoinhibition, triggered by excess light, may have assisted in photoprotection, because under these conditions there was no oxidative damage, as indicated by the absence of changes in H2O2 content and lipid peroxidation (TBARS content). This photochemistry protection, assigned to photoinhibition in this study, is enhanced due to non-occurrence of dissipation of excess energy through non-photochemical quenching (NPQ), because this mechanism did not show significant changes after long periods of exposure to excessive light. However, the energy dissipation through NPQ in response to short time of exposure to excessive light, observed here indicates that when the PSII activity is normal this mechanism is essential to the protection photochemistry. The role of photoinhibition for photo oxidative protection can be attributed to the effect of this process on reducing the activity of PSII and consequent lower photochemical activity, resulting in lower electron transfer. This suggestion is also reiterated in this study based on the reduction of the content of D1 protein, a major component of structural and functional PSII, and plastocyanin (PC), another major carrier of electrons. The modulation these proteins content may have contributed to restrict the formation of ROS and consequent oxidative damage under conditions inducing photo oxidatives stress such as drought associated with high luminosities, in this species. / No presente estudo foram caracterizados mecanismos bioquÃmicos e fisiolÃgicos decorrentes da fotoinibiÃÃo e que atuam na modulaÃÃo da atividade fotoquÃmica e da proteÃÃo oxidativa, auxiliando na reduÃÃo de danos fotoxidativos, em reposta aos estresses de seca e luminosidade elevada em cajueiro. As mudas foram obtidas a partir de sementes e cultivadas em substrato composto pela mistura de areia e vermiculita (proporÃÃo 1:1) em sacos plÃsticos, com volume de 2 L. O estresse hÃdrico foi aplicado pela suspenÃÃo da rega (Â20 dias) em condiÃÃes de casa de vegetaÃÃo. Para a exposiÃÃo aos tratamentos de luminosidade e de recuperaÃÃo ao efeito da luz, as plantas foram acondicionadas em cÃmara com condiÃÃes controladas de umidade relativa (60% Â5) e temperatura (30ÂC Â2). As plantas submetidas ao estresse hÃdrico apresentaram uma intensa reduÃÃo da fotossÃntese quando expostas ao excesso de luz (combinaÃÃo de seca com luminosidade elevada), se comparadas com aquelas irrigadas. Essa maior sensibilidade da fixaÃÃo de CO2 ao excesso de luz nas plantas sob seca foi relacionada com uma maior intensidade de danos no aparato fotoquÃmico, conforme indicado pelas medidas de eficiÃncia quÃntica efetiva e taxa aparente de transporte de elÃtrons. A reduÃÃo da atividade fotossintÃtica, em resposta ao excesso de luz, foi atribuÃda em parte ao processo de fotoinibiÃÃo ocorrido nessas condiÃÃes, conforme demonstrado pela drÃstica reduÃÃo da eficiÃncia quÃntica potencial mÃxima do PSII (dada pela relaÃÃo Fv/Fm). Os resultados sugerem tambÃm que a intensa fotoinibiÃÃo, desencadeada pelo excesso de luz, pode ter auxiliado na fotoproteÃÃo, pois nessas condiÃÃes nÃo ocorreu danos oxidativos, conforme indicado pela ausÃncia de mudanÃas no conteÃdo de H2O2 e na peroxidaÃÃo lipÃdica (conteÃdo de TBARS). Essa proteÃÃo fotoquÃmica, atribuÃda a fotoinibiÃÃo nesse estudo, à reforÃada devido a nÃo ocorrÃncia de dissipaÃÃo do excesso de energia por meio do quenching nÃo fotoquÃmico (NPQ), pois esse mecanismo nÃo apresentou mudanÃas significativas apÃs longos perÃodos de exposiÃÃo ao excesso de luz. No entanto, a dissipaÃÃo de energia por meio do NPQ em respostas a curtos perÃodos de exposiÃÃo ao excesso de luz, aqui observado, indica que quando a atividade do PSII està normal esse mecanismo à essencial para a proteÃÃo fotoquÃmica. O papel da fotoinibiÃÃo para a proteÃÃo fotoxidativa pode ser atribuido ao efeito desse processo na reduÃÃo da atividade dos PSII e consequente menor atividade fotoquÃmica, o que resultaria na menor transferÃncia de elÃtrons. Essa sugestÃo à ainda reinterada no presente estudo com base na reduÃÃo do conteÃdo da proteina D1, um dos principais componentes estrutural e funcional do PSII, e da plastocianina (PC), outro importante carreador de elÃtrons. A modulaÃÃo do conteÃdo dessas proteÃnas pode ter contribuÃdo para restringir a formaÃÃo de EROs e consequente danos oxidativos sob condiÃÃes indutoras de estresse fotoxidativos, como a seca associada com luminosidades elevadas, nessa espÃcie.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / As proteÃnas desacopladoras de planta (pUCP) estÃo localizadas na membrana mitocondrial interna e facilitam o transporte de prÃtons do espaÃo intermembranar para a matriz mitocondrial, desviando a passagem de H+ atravÃs da F1-ATPase, afetando assim a eficiÃncia da fosforilaÃÃo oxidativa, isto Ã, diminuindo a sÃntese de ATP acoplada ao funcionamento da cadeia transportadora de elÃtrons. Portanto, essas proteÃnas sÃo responsÃveis pela dissipaÃÃo do gradiente eletroquÃmico de H+, gerado pela respiraÃÃo, liberando calor para o ambiente. Tais proteÃnas pertencem a FamÃlia de Carreadores de Ãnions Mitocondriais (FCAM) e sÃo codificadas por famÃlias multigÃnicas. Sua funÃÃo ainda nÃo està completamente elucidada, mas a literatura sugere participaÃÃo na adaptaÃÃo a situaÃÃes de estresses biÃticos e abiÃticos e na proteÃÃo da cÃlula evitando a produÃÃo de espÃcies reativas do oxigÃnio (EROs). Sua participaÃÃo na termogÃnese adaptativa à questionÃvel. O objetivo do presente trabalho foi caracterizar a famÃlia multigÃnica da pUCP em Vigna unguiculata (L.) Walp bem como sua regulaÃÃo atravÃs da expressÃo gÃnica em resposta a diferentes estresses abiÃticos. Sementes de Vigna unguiculata foram germinadas em papel umedecido com Ãgua, no escuro e apÃs 3 dias as plÃntulas foram transferidas para soluÃÃo de Hoagland durante 3 dias antes da aplicaÃÃo dos estresses. As raizes e as folhas foram coletadas com 0, 6, 12 e 24 horas, apÃs respectivas adiÃÃes de NaCl 100 mM, PEG 200,67 g/L, H2O2 10 mM e Ãcido salicÃlico 5 mM, para caracterizar a famÃlia multigÃnica e o perfil de expressÃo dos genes da pUCP por RT- PCR semiquantitativa e por PCR em tempo real (qPCR). Primers especÃficos foram desenhados com base nas sequÃncias de cDNAs/genes de pUCPs identificadas em Vigna unguiculata usando a ferramenta PerlPrimer. A amplificaÃÃo do cDNA da actina foi usada para a normalizaÃÃo dos dados de RT-PCR semi-quantitativa e trÃs genes constitutivos foram usados na normalizaÃÃo dos dados da qPCR: 2 genes para actina (actinas 4 e 5) e 1 gene para o fator de alogamento 1-α (EF1α). AnÃlise in silico revelou que a pUCP na ordem Fabales à codificada por pelo menos seis genes com duplicaÃÃo do gene pUCP do tipo 1 (1a e 1b) e deleÃÃo do gene pUCP6. A famÃlia multigÃnica da pUCP, constituÃda de 6 genes, entÃo foi identificada em Vigna unguiculata (VuUCP1a, VuUCP1b, VuUCP2, VuUCP3, VuUCP4 e VuUCP5 ). O alinhamento de sequÃncias nucleotÃdicas e de aminoÃcidos das xiii. espÃcies da ordem Fabales incluindo as de Vigna unguiculata, revelou 3 sequÃncias conservadas denominadas Sinal ProtÃico de TransferÃncia de Energia (SPTE), alÃm de 4 domÃnios especÃficos que caracterizam existÃncia de pUCPs verdadeiras em Vigna unguiculata. O gene VuUCP1a foi expresso constitutivamente em folhas e raÃzes, contrastando com VuUCP1b, cuja expressÃo foi modulada em funÃÃo dos estresses e de tecidos. Em raÃzes a expressÃo do VuUCP1b aumentou em resposta a todos os tratamentos (PEG, NaCl, H2O2 e Ãcido salicÃlico) enquanto que em folhas a expressÃo nÃo aumentou em reposta ao NaCl. VuUCP2 teve a expressÃo inibida em resposta ao PEG em folhas. VuUCP4 apresentou expressÃo constitutiva em resposta aos estresses em ambos os tecidos, enquanto que VuUCP3 e VuUCP5 apresentaram induÃÃo de expressÃo por vÃrios estresses dependente do tecido. A identificaÃÃo da famÃlia multigÃnica das pUCPs em Vigna unguiculata e seu perfil de expressÃo gÃnica diferencial, em funÃÃo do estresse aplicado e do tecido estudado, pÃe em evidÃncia um possÃvel papel dessa proteÃna nos mecanismos de ajustamento das plantas aos estresses ambientais. / The plant uncoupling proteins (pUCP) are located in the inner mitochondrial membrane and facilitate the proton translocation across the intermembrane space into the mitochondrial matrix, deflecting the passage of H + by F1-ATPase activity, thus affecting the efficiency of oxidative phosphorylation, i.e decreasing the synthesis of ATP coupled to the operation of the electron transport chain. Therefore, these proteins are responsible for dissipating the electrochemical gradient of H+, generated by respiration, releasing heat to the environment. These proteins belong to family of carriers Mitochondrial Anion (FCAM) and are encoded by multigene families. Their function is not yet fully elucidated, but the literature suggests involvement in adapting to biotic and abiotic stresses and cell protection by avoiding the production of reactive oxygen species (ROS). Their participation in adaptive thermogenesis is unclear. The aim of this work was to characterize the multigene family of pUCP in Vigna unguiculata (L.) Walp and your regulation through gene expression in response to different abiotic stresses. Vigna unguiculata seeds were germinated on paper imbibed water in the dark. Three days after germination the seedlings were transferred to Hoagland solution for 3 days before application of stress. Roots and leaves were collected at 0, 6, 12 and 24 hours after addition of the respective 100 mM NaCl, 200.67 g / L PEG, 10 mM H2O2 and 5 mM salicylic acid to characterize the profile of multigene family expression of genes for pUCP by semiquantitative RT-PCR and real-time PCR (qPCR). Specific primers were designed based on the sequences of cDNA / gene identified in pUCPs Vigna unguiculata using the PerlPrimer tool. Amplification of cDNA of actin was used to normalize the data for RT-PCR semi-quantitative and three constitutive genes were used to normalize the data of qPCR: 2 to actin gene (actin 4 and 5) and a gene for factor alogament 1-α (EF1α). In silico analysis revealed that in Fabales order pUCP is encoded by at least six pUCPs genes presenting a duplication of the gene type 1 (1a, 1b) and a pUCP6 gene deletion. The multigene family of pUCP, consisting of six genes was then identified in Vigna unguiculata (VuUCP1a, VuUCP1b, VuUCP2, VuUCP3, VuUCP4 and VuUCP5). The alignment of amino acid and nucleotide sequences of the species of Fabales order including Vigna unguiculata, revealed three xv. conserved sequences called signal Energy Transfer Protein (SPTE), and four domains (or regions or sites) existence of specific true pUCPs in Vigna unguiculata. VuUCP1a gene was constitutively expressed in leaves and roots, contrasting with VuUCP1b, whose expression was modulated in a stress and tissue-dependent manner. The VuUCP1b expression increased in response to all treatments (PEG, NaCl, H2O2 and salicylic acid) in roots, whereas the expression in leaves did not increase in response to NaCl. VuUCP2 expression was inhibited in response to PEG in leaves. VuUCP4 showed constitutive expression in response to stresses in both tissues, while VuUCP3 and VuUCP5 showed induction of expression by various stresses depending on the tissue type. The identification of the multigene family of pUCPs in Vigna unguiculata and its gene expression profile in different tissues and stress conditions highlights a possible role of this protein in the adjustment of plants to environmental stresses.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O acÃmulo de Na+ no vacÃolo central representa um importante mecanismo de defesa de plantas contra o estresse salino. A regulaÃÃo dos volumes e conteÃdos dos vacÃolos de cÃlulas vegetais depende da atividade de transportadores e canais localizados no tonoplasto (membrana vacuolar). A membrana vacuolar possui duas distintas bombas de prÃtons (V-ATPase e V-PPase), aquoporinas e vÃrios sistemas de transportes ativos e/ou secundÃrios, como os contra-transportadores Na+/H+ vacuolares. As duas bombas de prÃtons transmembranares funcionam como sistemas de transporte primÃrio nas cÃlulas vegetais e ambas as enzimas geram uma diferenÃa de potencial eletroquÃmico de prÃtons atravÃs da membrana vacuolar. Os contra-transportadores vacuolares Na+/H+ utilizam o gradiente eletroquÃmico de prÃtons gerado pelos transportadores primÃrios para transportar Na+ para dentro do vacÃolo. No presente trabalho inicialmente foram determinados os conteÃdos de Ãons Na+ e K+ em raÃzes, hipocÃtilos e folhas e em seguida a anÃlise da expressÃo dos genes das bombas de prÃtons (VHA-A, VHA-E e HVP) e dos contra-transportadores vacuolares (NHX2 e NHX6) em plÃntulas de Vigna unguiculata (L.) Walp cv. Vita 5 submetidas a estresse salino e osmÃtico. As plÃntulas foram crescidas em meio nutritivo na ausÃncia de NaCl e PEG (controle), na presenÃa de 100 mM de NaCl (estresse salino) ou na presenÃa de 200,67 g/L de PEG (estresse osmÃtico). O conteÃdo de Ãons Na+ aumentou em todos os tecidos da planta quando submetidos ao estresse salino (NaCl 100 mM) enquanto que o conteÃdo de Ãons K+ diminuiu na mesma condiÃÃo. A expressÃo dos genes das bombas de prÃtons e dos contra-transportadores vacuolares de folhas e de raÃzes no estresse salino aumentou em todas as condiÃÃes estudadas, porÃm o aumento foi mais expressivo para os genes da V-PPase, NHX2 e NHX6 sugerindo uma regulaÃÃo paralela entre esses genes. JÃ no estresse osmÃtico, os resultados para as folhas mostraram que a expressÃo dos genes VHA-A e VHA-E aumentaram enquanto que os outros genes nÃo sofreram mudanÃas significativas. Nossos resultados sugerem que o estresse salino e o estresse osmÃtico induziram uma regulaÃÃo diferenciada em todos os genes sendo o contra-transportador Na+/H+ importante na homeostase celular quando as plantas foram submetidas ao estresse salino e osmÃtico. / The acummulation of Na+ in the central vacuole represents an important mechanism for plants to cope with salt stress. The vacuolar content and the regulations of their volumes in vegetable cells depend on the activity of transporters and channels located in the tonoplast (vacuolar membrane). The vacuolar membrane possesses two different proton pumps (V-ATPase and V-PPase), aquoporine, and systems of primary and secondary transporters like the vacuolar Na+/H+ antiporter (NHX). The two transmembrane proton pumps work as systems of primary transport in vegetable cells and both enzymes generate a difference of proton electrochemical potential through the vacuolar membrane which can provide energy to antiport system, H+/substrate. The vacuolar Na+/H+ antiporter, uses the electrochemical gradient generated by the primary transporters to pump Na+ ions inward the vacuole. In the present work were first determined the Na+ and K+ content followed by the gene expression of the vacuolar proton pumps (VHA-A, VHA-E and HVP) and the vacuolar antiporters (NHX2 and NHX6) from seedlings of Vigna unguiculata subjected to salt and osmotic stress. The seedlings were grown on nutritive medium in the absence of NaCl and PEG (control condition), presence of NaCl 100 mM (salt stress) or in the presence of PEG 6000 200,67g.L-1 (osmotic stress). The ion Na+ content essay showed an increase in all plant tissues when submitted to salt stress, while the K+ ions decreased in the same condition. The gene expression of the vacuolar proton pumps and the Na+ antiporter from roots and leaves showed an increase in all studied conditions being more expressive to V-PPase, NHX2 and NHX6 suggesting a coordinated regulation of these genes. The results from leaves showed that VHA-A and VHA-E were increased, while the others genes tend to remain constant in the osmotic stress. These results suggest that salt and osmotic stress induced a differential regulation of all studied genes, being the vacuolar Na+ antiporters an important part on keep the cellular homeostasis when the plants were submitted to salt stress