Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / As proteÃnas desacopladoras de planta (pUCP) estÃo localizadas na membrana mitocondrial interna e facilitam o transporte de prÃtons do espaÃo intermembranar para a matriz mitocondrial, desviando a passagem de H+ atravÃs da F1-ATPase, afetando assim a eficiÃncia da fosforilaÃÃo oxidativa, isto Ã, diminuindo a sÃntese de ATP acoplada ao funcionamento da cadeia transportadora de elÃtrons. Portanto, essas proteÃnas sÃo responsÃveis pela dissipaÃÃo do gradiente eletroquÃmico de H+, gerado pela respiraÃÃo, liberando calor para o ambiente. Tais proteÃnas pertencem a FamÃlia de Carreadores de Ãnions Mitocondriais (FCAM) e sÃo codificadas por famÃlias multigÃnicas. Sua funÃÃo ainda nÃo està completamente elucidada, mas a literatura sugere participaÃÃo na adaptaÃÃo a situaÃÃes de estresses biÃticos e abiÃticos e na proteÃÃo da cÃlula evitando a produÃÃo de espÃcies reativas do oxigÃnio (EROs). Sua participaÃÃo na termogÃnese adaptativa à questionÃvel. O objetivo do presente trabalho foi caracterizar a famÃlia multigÃnica da pUCP em Vigna unguiculata (L.) Walp bem como sua regulaÃÃo atravÃs da expressÃo gÃnica em resposta a diferentes estresses abiÃticos. Sementes de Vigna unguiculata foram germinadas em papel umedecido com Ãgua, no escuro e apÃs 3 dias as plÃntulas foram transferidas para soluÃÃo de Hoagland durante 3 dias antes da aplicaÃÃo dos estresses. As raizes e as folhas foram coletadas com 0, 6, 12 e 24 horas, apÃs respectivas adiÃÃes de NaCl 100 mM, PEG 200,67 g/L, H2O2 10 mM e Ãcido salicÃlico 5 mM, para caracterizar a famÃlia multigÃnica e o perfil de expressÃo dos genes da pUCP por RT- PCR semiquantitativa e por PCR em tempo real (qPCR). Primers especÃficos foram desenhados com base nas sequÃncias de cDNAs/genes de pUCPs identificadas em Vigna unguiculata usando a ferramenta PerlPrimer. A amplificaÃÃo do cDNA da actina foi usada para a normalizaÃÃo dos dados de RT-PCR semi-quantitativa e trÃs genes constitutivos foram usados na normalizaÃÃo dos dados da qPCR: 2 genes para actina (actinas 4 e 5) e 1 gene para o fator de alogamento 1-α (EF1α). AnÃlise in silico revelou que a pUCP na ordem Fabales à codificada por pelo menos seis genes com duplicaÃÃo do gene pUCP do tipo 1 (1a e 1b) e deleÃÃo do gene pUCP6. A famÃlia multigÃnica da pUCP, constituÃda de 6 genes, entÃo foi identificada em Vigna unguiculata (VuUCP1a, VuUCP1b, VuUCP2, VuUCP3, VuUCP4 e VuUCP5 ). O alinhamento de sequÃncias nucleotÃdicas e de aminoÃcidos das xiii. espÃcies da ordem Fabales incluindo as de Vigna unguiculata, revelou 3 sequÃncias conservadas denominadas Sinal ProtÃico de TransferÃncia de Energia (SPTE), alÃm de 4 domÃnios especÃficos que caracterizam existÃncia de pUCPs verdadeiras em Vigna unguiculata. O gene VuUCP1a foi expresso constitutivamente em folhas e raÃzes, contrastando com VuUCP1b, cuja expressÃo foi modulada em funÃÃo dos estresses e de tecidos. Em raÃzes a expressÃo do VuUCP1b aumentou em resposta a todos os tratamentos (PEG, NaCl, H2O2 e Ãcido salicÃlico) enquanto que em folhas a expressÃo nÃo aumentou em reposta ao NaCl. VuUCP2 teve a expressÃo inibida em resposta ao PEG em folhas. VuUCP4 apresentou expressÃo constitutiva em resposta aos estresses em ambos os tecidos, enquanto que VuUCP3 e VuUCP5 apresentaram induÃÃo de expressÃo por vÃrios estresses dependente do tecido. A identificaÃÃo da famÃlia multigÃnica das pUCPs em Vigna unguiculata e seu perfil de expressÃo gÃnica diferencial, em funÃÃo do estresse aplicado e do tecido estudado, pÃe em evidÃncia um possÃvel papel dessa proteÃna nos mecanismos de ajustamento das plantas aos estresses ambientais. / The plant uncoupling proteins (pUCP) are located in the inner mitochondrial membrane and facilitate the proton translocation across the intermembrane space into the mitochondrial matrix, deflecting the passage of H + by F1-ATPase activity, thus affecting the efficiency of oxidative phosphorylation, i.e decreasing the synthesis of ATP coupled to the operation of the electron transport chain. Therefore, these proteins are responsible for dissipating the electrochemical gradient of H+, generated by respiration, releasing heat to the environment. These proteins belong to family of carriers Mitochondrial Anion (FCAM) and are encoded by multigene families. Their function is not yet fully elucidated, but the literature suggests involvement in adapting to biotic and abiotic stresses and cell protection by avoiding the production of reactive oxygen species (ROS). Their participation in adaptive thermogenesis is unclear. The aim of this work was to characterize the multigene family of pUCP in Vigna unguiculata (L.) Walp and your regulation through gene expression in response to different abiotic stresses. Vigna unguiculata seeds were germinated on paper imbibed water in the dark. Three days after germination the seedlings were transferred to Hoagland solution for 3 days before application of stress. Roots and leaves were collected at 0, 6, 12 and 24 hours after addition of the respective 100 mM NaCl, 200.67 g / L PEG, 10 mM H2O2 and 5 mM salicylic acid to characterize the profile of multigene family expression of genes for pUCP by semiquantitative RT-PCR and real-time PCR (qPCR). Specific primers were designed based on the sequences of cDNA / gene identified in pUCPs Vigna unguiculata using the PerlPrimer tool. Amplification of cDNA of actin was used to normalize the data for RT-PCR semi-quantitative and three constitutive genes were used to normalize the data of qPCR: 2 to actin gene (actin 4 and 5) and a gene for factor alogament 1-α (EF1α). In silico analysis revealed that in Fabales order pUCP is encoded by at least six pUCPs genes presenting a duplication of the gene type 1 (1a, 1b) and a pUCP6 gene deletion. The multigene family of pUCP, consisting of six genes was then identified in Vigna unguiculata (VuUCP1a, VuUCP1b, VuUCP2, VuUCP3, VuUCP4 and VuUCP5). The alignment of amino acid and nucleotide sequences of the species of Fabales order including Vigna unguiculata, revealed three xv. conserved sequences called signal Energy Transfer Protein (SPTE), and four domains (or regions or sites) existence of specific true pUCPs in Vigna unguiculata. VuUCP1a gene was constitutively expressed in leaves and roots, contrasting with VuUCP1b, whose expression was modulated in a stress and tissue-dependent manner. The VuUCP1b expression increased in response to all treatments (PEG, NaCl, H2O2 and salicylic acid) in roots, whereas the expression in leaves did not increase in response to NaCl. VuUCP2 expression was inhibited in response to PEG in leaves. VuUCP4 showed constitutive expression in response to stresses in both tissues, while VuUCP3 and VuUCP5 showed induction of expression by various stresses depending on the tissue type. The identification of the multigene family of pUCPs in Vigna unguiculata and its gene expression profile in different tissues and stress conditions highlights a possible role of this protein in the adjustment of plants to environmental stresses.

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / As proteÃnas desacopladoras de planta (pUCPs) sÃo proteÃnas integrais de membrana, localizadas na membrana mitocondrial interna, pertencentes a FamÃlia de Carreadores de Ãnions Mitocondriais (FCAM), responsÃveis pela dissipaÃÃo do gradiente eletroquÃmico de prÃtons, gerado pela respiraÃÃo, como calor. Na presenÃa de Ãcidos graxos livres (AGL), as pUCPs facilitam a reentrada de prÃtons do espaÃo intermembranar para a matriz, desviando-os da ATP Sintase, inibindo assim a fosforilaÃÃo oxidativa. A funÃÃo dessas enzimas ainda nÃo està completamente elucidada, mas a literatura sugere a sua participaÃÃo em processos de amadurecimento de frutos, adaptaÃÃo a situaÃÃes de estresses biÃticos e abiÃticos e proteÃÃo da cÃlula evitando a produÃÃo de espÃcies reativas de oxigÃnio (EROS). Sua participaÃÃo na termogÃnese adaptativa à questionÃvel. O objetivo do presente trabalho foi caracterizar a atividade enzimÃtica da pUCP de mitocÃndrias de hipocÃtilos de Vigna unguiculata (L.) Walp atravÃs de ensaios polarogrÃficos, identificar o(s) gene(s) das pUCPs, estudando a sua expressÃo em diferentes situaÃÃes de estresses abiÃticos. A atividade da pUCP foi avaliada em presenÃa de Ãcidos graxos (palmÃtico, linolÃico, mirÃstico e lÃurico) e BSA tendo succinato e malato como substratos e distintos pHs (6,5, 7,2 e 7,8). As maiores atividades foram obtidas com Ãcido linoleico na presenÃa de succinato em pHs mais alcalinos (7,2 e 7,8). Primers degenerados a partir de dez diferentes pUCPs, denominados pump1 e pump2, foram desenhados para a amplificaÃÃo dos fragmentos gÃnicos por RT-PCR e PCR. Isolou-se o RNA total de folhas de plÃntulas de V. unguiculata submetidas a diferentes condiÃÃes de estresses (NaCl 100mM, H2O2 1mM e PEG 200,67g/L) que foram amplificados por RT-PCR, purificados e clonados no plasmÃdio pCR4-TOPO. Sete fragmentos gÃnicos de aproximadamente 760 pb foram seqÃenciados, apresentando 100% de identidade entre si. A comparaÃÃo da seqÃÃncia deduzida de aminoÃcidos desse fragmento de cDNA com a soja revelou 94% de homologia com GmUCP1a e 90% de homologia com GmUCP1b. Os resultados sugerem que o gene do feijÃo identificado em V. unguiculata (VuUCP1a) à ortÃlogo ao gene GmUCP1a de soja (Glycine max). A expressÃo de VuUCP1a em feijÃo em condiÃÃes de estresses abiÃticos (salino, oxidativo e osmÃtico) atravÃs de anÃlise por xv. RT-PCR revelou um perfil diferencial, sugerindo induÃÃo de expressÃo de VuUCP1a apenas em resposta ao estresse salino. Isolou-se o DNA genÃmico de V. unguiculata e dois fragmentos gÃnicos (1700 e 1900pb) foram amplificados por PCR. A amplificaÃÃo de dois fragmentos distintos a partir do DNA genÃmico sugere a existÃncia de pelo menos dois genes codificando pUCPs em feijÃo, sendo assim, a pUCP à codificada por uma famÃlia multigÃnica. / The uncoupling proteins of plants (pUCPs) are integral proteins of membrane, located in the mitochondrial inner membrane, belong the Mitochondrial Anion Carrier Family (MACF). They are responsible for the dissipation as heat of the electrochemical gradient of protons, generated during respiration. In the presence of free fatty acid acids (FFA), the UCPs facilitate the re-entry of protons from intermembrane space for the matrix and these protons are deviated from the influence of the ATP sintase what leads to the inhibition the oxidative phosphorilation. The function of these enzymes completely is still not elucidated, but literature suggests its participation in processes of fruit maturation, in the adaptation to stress conditions and in cell protection by avoiding the production of reactive species of oxygen (EROS). The involvement of this enzyme in adaptive thermogenesis is questionable. The objective of the present work was to characterize the enzymatic activity of pUCP of mitochondria from hypocotyls of Vigna unguiculata (L.) Walp through polarographic assays and to identify the(s) gene(s) of pUCPs, through its expression in different conditions of abiotic stress. The activity of pUCP was evaluated in the presence of fatty acids (palmitic, linoleic, myristic and lauric) and BSA, having succinate and malate as oxidizable substrates at different pHs (6,5, 7,2 and 7,8). The higuest activities were obtained in the presence of linoleic acid, succinate as substrate and with more alkaline pHs (7,2 and 7,8). Degenerate primers, obtained from ten different pUCPs, called pump1 and pump2, has been designed for amplification of the gene fragments through RT-PCR and PCR. The total RNA was isolated from plants leaves of V. unguiculata submitted to different stress conditions (100 mM NaCl, 1 mM H2O2 and 200,67 g/L PEG) and cDNAs fragments amplified by RT-PCR had been purified and cloned in the plasmid PCR4-TOPO. Seven cDNA fragments of approximately 760 pb had been sequenced and presented 100% of identity among themselves. The comparison of the deduced amino acid sequence of this cDNA fragment with those of soybean disclosed 94% of identity with the gene GmUCP1a and 90% of identity GmUCP1b soybean gene. These results suggest that the pUCP gene identified in V. unguiculata (VuUCP1a) is ortologous to the GmUCP1a gene from soybean (Glycine max). The expression of genes of pUCP in beans, under abiotic stress xvii. conditions (salinity, oxidative and osmotic conditions) analyzed through RT-PCR disclosed a differential profile what suggests induction of expression of VuUCP1a only in response to salt stress. The genomic DNA of V. unguiculata was isolated and two gene fragments (1700 and 1900 pb) had been amplified by PCR. The amplification of two fragments from the genomic DNA suggests the existence of at least two pUCPs genes in beans what leads to the conclusion of a pUCP multigenic family.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A FotossÃntese e a respiraÃÃo sÃo bem conhecidos como sendo responsÃveis pela produÃÃo de energia no interior das cÃlulas de plantas. Acoplados à estes processos bioenergÃticos, a transferÃncia de elÃtrons que ocorre nas membranas do cloroplasto e mitocÃndria, tambÃm sÃo considerados com tendo potencial de produÃÃo de ROS. PossÃveis interaÃÃes no funcionamento dessas organelas permanecem pouco conhecidas, especialmente em resposta a condiÃÃes de estresse. Sob estas condiÃÃes, sugere-se que as vias de transferÃncia de elÃtrons ligadas à AOX, à pUCP ou à PTOX poderia limitar a formaÃÃo de ROS reduzindo assim danos oxidativos Ãs organelas celulares. Em nosso trabalho, foram selecionadas duas cultivares de Vigna unguiculata, inicialmente caracterizados como sensÃvel (cv 1183) ou tolerante (cv EPACE1) à seca. Sob condiÃÃes experimentais, as duas cultivares nÃo apresentaram diferenÃas significativas na sensibilidade à seca. Entretanto o cultivar EAPCE1 foi mais tolerante ao ozÃnio com base no desenvolvimento de necrose e de vÃrios parÃmetros fisiolÃgicos (ϕPSII) e bioquÃmicos (teor de glutationa). Para os perfis de expressÃo de genes que codificam AOX, PUCP e PTOX duas respostas foram claramente identificadas no cultivar EPACE1. Em um tempo curto, a expressÃo destas proteÃnas à geralmente estimulada. Em um perÃodo mais longo (14 dias), a resposta à diferente, dependendo da tipo de estresse. Sob o ozÃnio, um aumento da expressÃo das proteÃnas mitocondriais à mantida enquanto o gene que codifica para a PTOX à sub-regulada. Sob seca a proteÃna desacopladora do plastÃdio (PTOX) à superexpressa. Sob condiÃÃes de combinaÃÃo stress, seca combinada com ozÃnio, o efeito da seca sobre o fluxo de ozÃnio nas folhas nÃo foi alterado, e os genes VuPTOX e VuUCP1b sÃo super-expressos depois de 3 e 7 dias de stress. Este aumento da expressÃo, jà observado em resposta à seca por aplicada separadamente poderia desempenhar um papel na prevenÃÃo da formaÃÃo de ROS tanto em mitocÃndrias e cloroplastos prevenindo assim os danos causados pelo ozÃnio. / Possible interactions between chloroplast and mitochondria remain poorly known, particularly in response to stress conditions. Under these conditions, it is suggested that the electron transfer pathways linked to AOX or pUCP (mitochondrial uncoupling proteins) and PTOX (plastidial uncoupling protein) could limit the formation of ROS to reduce oxidative damage in cellular organelles. In our work, we selected two cultivars of Vigna unguiculata, cv 1183 and cv EPACE. Under our experimental conditions, both cultivars showed no real differences in sensitivity to drought. However cv EPACE was more tolerant to O3 based on the development of necrosis and several physiological parameters (Fv/Fm, ϕPSII) and biochemical (glutathione content). For the expression profiles of genes encoding AOX, PUCP and PTOX two responses were clearly identified in the cultivar EPACE. On a shortterm, expression of these proteins is generally stimulated. On a longer term (14 days), the answer differs depending on the treatment. Under O3, the strongest expression of mitochondrial proteins is maintained while the gene encoding the PTOX is own-regulated. Under drought only the plastid protein (PTOX) is upregulated. Under conditions of stress combination, drought has little effect on the influx of O3 in the leaves, and the VuPTOX and VuUCP1b genes are up-regulated after 3 and 7 days of stress. This ver-regulation, already observed in response to drought alone could play a role in preventing the formation of ROS in both mitochondria and chloroplasts.