Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O cloroplasto à uma organela caracterÃstica dos organismos fotossintetizantes sendo seu papel primordial na geraÃÃo de energia a partir de gÃs carbÃnico e Ãgua. Essa organela pode ter seu funcionamento comprometido quando submetida a estresses ambientais devido a fragilidade e complexidade do sistema. Para evitar perdas provocadas pelo estresse existem vÃrios mecanismos de adaptaÃÃo e regulaÃÃo das reaÃÃes que ocorrem no cloroplasto. Recentemente caracterizou-se mais um desses provÃveis mecanismos que foi chamado de clororespiraÃÃo. A clororespiraÃÃo foi esclarecida com a descoberta de uma enzima similar a oxidase alternativa da mitocondria que chamou-se de oxidase terminal do plastÃdeo (PTOX). A funÃÃo dessa respiraÃÃo do cloroplasto permanece incerta, mas uma das hipÃteses mais aceitas à que o funcionamento da clororespiraÃÃo poderia prevenir a formaÃÃo de espÃcies reativas de oxigÃnio atravÃs da reciclagem dos intermediÃrios redutores do cloroplasto. No presente trabalho foi caracterizado a presenÃa de dois genes que codificam para a oxidase terminal do plastÃdeo em plantas de Zea mays. Estudou-se tambÃm a expressÃo diferencial de ambos genes da PTOX em resposta ou estresse hÃdrico, alÃm da caracterizaÃÃo da clororespiraÃÃo atravÃs da atividade da NADH desidrogenase plastidial (NDH) em gel de poliacrilamida. A caracterizaÃÃo molecular dos genes da PTOX mostrou homologia de 60% quando comparadas as sequÃncias dos genes e de 79% quando comparadas as prÃ-proteÃnas traduzidas. Os genes dessa proteÃna tÃm estruturas similares, sendo compostos por oito introns e 9 Ãxons. Um estudo das regiÃes dos promotores dos genes mostrou que existiam elementos comuns porÃm a presenÃa de elementos diferentes como, o elementos cis MBS que à responssivo à seca, poderia revelar uma regulaÃÃo diferencial dos genes. A resposta diferencial foi confirmada atravÃs de RT-PCR semiquantitativo. O gene chamado de ptox1 teve sua expressÃo estÃvel, podendo ser considerado um gene constitutivo, enquanto que o gene chamado de ptox2 teve um aumento da expressÃo proporcional ao estresse aplicado tanto em folhas como em raÃzes de plantas de milho. A anÃlise da atividade da NDH em gel (zimograma) revelou a presenÃa dessa enzima em cloroplastos de milho confirmando a presenÃa das enzimas da clororespiraÃÃo. O estudo filogenÃtico de sequencias de cDNA de bancos de dados mostraram que milho e sorgo pertencentes ao grupo das monocotiledÃneas, sÃo espÃcies muito prÃximas e que compartilham dois genes ortÃlogos da PTOX identificados como ptox1 e ptox2. Concluiu-se pela primeira vez a presenÃa de dois genes da PTOX no genoma do milho, uma monocotiledÃena de metabolismo C4. Os genes foram denominados de ptox1 e ptox2. Eles foram encontrados em raÃzes e folhas e apenas o gene da ptox2 pareceu ser induzido em resposta ao estresse osmÃtico. / The chloroplast is an organelle characteristic of photosynthetic organisms and their role in generating energy from carbon dioxide and water. This organelle may be functionally compromised when subjected to environmental stress due to the fragility and complexity of the system. To avoid losses caused by stresses plants have evolved various coping mechanisms, as well as, regulation of the reactions that occur in the chloroplast. Most recently it was characterized one of these mechanisms that was called chlororespiration. The chlororespiration was bring to light with the discovery of an enzyme, similar to the alternative oxidase of mitochondria, that was called the plastid terminal oxidase (PTOX). The function of this chloroplast respiration remains uncertain, but one of the most accepted hypothesis is that the operation of chlororespiration could prevent the formation of reactive oxygen species by recycling the reducing intermediates of the chloroplast. The present study characterized the presence of two genes encoding the plastid terminal oxidase in plants of Zea mays., and its differential expression in response to water stress. It was also characterized the chlororespiration through the activity of plastidial NADH dehydrogenase (NDH) in polyacrylamide gel. The molecular characterization of PTOX genes showed 60% homology when compared sequences of genes, but 79% when compared to pretranslated proteins. The genes of this protein have similar structures, being composed of nine exons and eight introns. A study of regions of the promoters of the genes showed that there were common elements, but the presence of different elements such as the cis elements that MBS responsive to drought, could reveal a differential regulation of genes. The differential response was confirmed by semiquantitative RT-PCR. The gene called ptox1 had its expression level stable and could be considered a constitutive gene, while the gene called ptox2 had an increased expression proportional to the applied stress in both leaves and roots of maize plants. The analysis of NDH activity gel (zimograms) revealed the presence of this enzyme in maize chloroplasts suggesting the existence of the chlororespiratory pathway. The phylogenetic analysis of cDNA sequences from NCBI databases showed that maize and sorghum, being closely related species, share two genes )identified as orthologs of PTOX (ptox1 and ptox2). It was confirmed for the first time the presence of two PTOX genes in the genome of maize, a C4-metabolism monocotyledon and its differential expression under drought stress.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A FotossÃntese e a respiraÃÃo sÃo bem conhecidos como sendo responsÃveis pela produÃÃo de energia no interior das cÃlulas de plantas. Acoplados à estes processos bioenergÃticos, a transferÃncia de elÃtrons que ocorre nas membranas do cloroplasto e mitocÃndria, tambÃm sÃo considerados com tendo potencial de produÃÃo de ROS. PossÃveis interaÃÃes no funcionamento dessas organelas permanecem pouco conhecidas, especialmente em resposta a condiÃÃes de estresse. Sob estas condiÃÃes, sugere-se que as vias de transferÃncia de elÃtrons ligadas à AOX, à pUCP ou à PTOX poderia limitar a formaÃÃo de ROS reduzindo assim danos oxidativos Ãs organelas celulares. Em nosso trabalho, foram selecionadas duas cultivares de Vigna unguiculata, inicialmente caracterizados como sensÃvel (cv 1183) ou tolerante (cv EPACE1) à seca. Sob condiÃÃes experimentais, as duas cultivares nÃo apresentaram diferenÃas significativas na sensibilidade à seca. Entretanto o cultivar EAPCE1 foi mais tolerante ao ozÃnio com base no desenvolvimento de necrose e de vÃrios parÃmetros fisiolÃgicos (ϕPSII) e bioquÃmicos (teor de glutationa). Para os perfis de expressÃo de genes que codificam AOX, PUCP e PTOX duas respostas foram claramente identificadas no cultivar EPACE1. Em um tempo curto, a expressÃo destas proteÃnas à geralmente estimulada. Em um perÃodo mais longo (14 dias), a resposta à diferente, dependendo da tipo de estresse. Sob o ozÃnio, um aumento da expressÃo das proteÃnas mitocondriais à mantida enquanto o gene que codifica para a PTOX à sub-regulada. Sob seca a proteÃna desacopladora do plastÃdio (PTOX) à superexpressa. Sob condiÃÃes de combinaÃÃo stress, seca combinada com ozÃnio, o efeito da seca sobre o fluxo de ozÃnio nas folhas nÃo foi alterado, e os genes VuPTOX e VuUCP1b sÃo super-expressos depois de 3 e 7 dias de stress. Este aumento da expressÃo, jà observado em resposta à seca por aplicada separadamente poderia desempenhar um papel na prevenÃÃo da formaÃÃo de ROS tanto em mitocÃndrias e cloroplastos prevenindo assim os danos causados pelo ozÃnio. / Possible interactions between chloroplast and mitochondria remain poorly known, particularly in response to stress conditions. Under these conditions, it is suggested that the electron transfer pathways linked to AOX or pUCP (mitochondrial uncoupling proteins) and PTOX (plastidial uncoupling protein) could limit the formation of ROS to reduce oxidative damage in cellular organelles. In our work, we selected two cultivars of Vigna unguiculata, cv 1183 and cv EPACE. Under our experimental conditions, both cultivars showed no real differences in sensitivity to drought. However cv EPACE was more tolerant to O3 based on the development of necrosis and several physiological parameters (Fv/Fm, ϕPSII) and biochemical (glutathione content). For the expression profiles of genes encoding AOX, PUCP and PTOX two responses were clearly identified in the cultivar EPACE. On a shortterm, expression of these proteins is generally stimulated. On a longer term (14 days), the answer differs depending on the treatment. Under O3, the strongest expression of mitochondrial proteins is maintained while the gene encoding the PTOX is own-regulated. Under drought only the plastid protein (PTOX) is upregulated. Under conditions of stress combination, drought has little effect on the influx of O3 in the leaves, and the VuPTOX and VuUCP1b genes are up-regulated after 3 and 7 days of stress. This ver-regulation, already observed in response to drought alone could play a role in preventing the formation of ROS in both mitochondria and chloroplasts.