Submitted by Inácio de Oliveira Lima Neto (inacio.neto@inpa.gov.br) on 2018-01-30T12:57:01Z No. of bitstreams: 2 Diana Vieira Brito.pdf: 3554087 bytes, checksum: 965a5a8e72d0c0e6a8b6ef8339bd4aad (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-01-30T12:57:01Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Diana Vieira Brito.pdf: 3554087 bytes, checksum: 965a5a8e72d0c0e6a8b6ef8339bd4aad (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-07-27 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas - FAPEAM / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Sex differentiation is a fundamental step that profoundly affects the physiological, morphological and behavioral traits for species reproduction to be succeeded. In highly eusocial bees, another developmental process also takes place to increase species reproductive success: morphological specialization of some females for reproduction (queens), and others for colony maintenance functions (workers). The aim of this thesis was to investigate the molecular basis of sex and caste determination in the Amazonian stingless bee Melipona interrupta, and a possible interaction between them. Two genes from sex determination pathway were characterized in this study: feminizer (fem) and double sex (dsx). Candidate gene approach was used to identify genes related to caste determination. Relation between these genes and caste determination was identified by analyzing their response to manipulation of Juvenile Hormone (JH) titers, which have a major role in queen differentiation of highly eusocial insects, during caste divergence period (last larval instar). Moreover, expression of two genes involved in JH metabolism – mfe (biosynthesis) and jhe (degradation) – was analyzed in social organization context. About sex determination, it was found that Mi-fem pre-mRNA is sex-specifically spliced in a way which only the female splice variant encodes the full-length protein. Higher expression levels of Mi-fem were observed in embryos, which is the stage when sex is determined in insects. Furthermore, it was observed that JH induces an increase in Mi-fem expression during caste divergence period. A method for functional analysis of Mi-fem was also tested in M. interrupta. Parental RNA interference (pRNAi) was used for silencing fem in embryos, but it was not possible to confirm the knockdown. Sex-specific transcripts of Mi-dsx transcripts were also characterized and full-cDNA sequence was obtained. These transcripts encode protein isoforms with differences in their C-terminal domain. These results provide support for the conserved regulatory function of fem and dsx in Melipona bees and demonstrate a significant correlation between key elements of sex and caste determination pathways. About caste determination, five genes belonging to growth-related signaling or regulatory pathways with large phenotypic effects in development were found to be related to caste determination of M. interrupta in this study. Two genes from Insulin/Insulin-Like Signaling (IIS) pathway were responsive to JH (InR1 and InR2), but in opposite directions. DNA methyltransferase 3 (Dnmt3) gene, which is a key feature of epigenetic regulation, and yolk protein vitellogenin gene (Vg) were also found to be related to caste differentiation in M. interrupta. Furthermore, dsx expression was increased by high JH levels, which corroborates previous findings with fem. Besides being the first study to identify regulatory genes related to caste determination in Melipona, these findings give a hint about social strategy used by these bees to achieve high eusociality without relying on a nutrition-based phenotypic plasticity. Finally, analysis of JH metabolism genes revealed that only the expression of JH catabolism related gene jhe is correspondent to overall expected fluctuation of JH titers during larval development. In adult workers, comparison between mfe and jhe expression with recent findings about JH titers in another Melipona species indicated that JH might be playing alternative roles in social organization of workers of stingless bees. Taken together, these results provide a basis for further analysis functional about these sex- and caste-related genes to unveil mechanisms underlying these developmental processes. Also, findings here of a close link between sex and caste determination pathway, which points to sex determination pathway as a potential basis for the evolution of morphological specialization of castes. / A diferenciação sexual é uma etapa crucial do desenvolvimento que afeta profundamente os aspectos morfológicos, fisiológicos e comportamentais para que a reprodução das espécies seja bem-sucedida. Nas abelhas altamente eussociais, outro processo do desenvolvimento também está relacionado ao aumento do sucesso reprodutivo: a especialização morfológica de algumas fêmeas para a reprodução (rainhas), e de outras para a manutenção das colônias (operárias). O objetivo desta tese foi investigar a base molecular da determinação do sexo e da casta na abelha Melipona interrupta e uma possível interação entre ambas as vias. Dois genes da via de determinação do sexo foram caracterizados: feminizer (fem) e double sex (dsx). A abordagem de genes candidatos foi utilizada para a identificação de genes relacionados a determinação das castas, cuja relação foi deduzida por meio da análise de suas respostas à manipulação dos níveis de Hormônio Juvenil (HJ), o qual tem um papel central na diferenciação das rainhas. Além disso, a expressão de dois genes envolvidos no metabolismo do HJ – mfe (biossíntese) e jhe (degradação) – foi analisada no contexto de organização social. Observou-se que o pré-mRNA do gene Mi-fem sofre um splicing alternativo sexo-específico, de modo que apenas a variante específica das fêmeas codifica a proteína completa. Os níveis mais altos de expressão do fem foram observados na fase embrionária, na qual o sexo é determinado. Além disso, foi observado que o JH induz um aumento na expressão do Mi-fem no período de divergência entre as castas. Um método para a análise funcional do fem também foi testado em M. interrupta. O RNA de interferência parental (pRNAi) foi usado para silenciar o fem nos embriões, mas não foi possível confirmar o knockdown. Os transcritos sexo-específicos do Mi-dsx também foram caracterizados e a sequência completa do cDNA foi obtida. Esses transcritos codificam isoformas proteicas que apresentam diferenças nos seus domínios C-terminal. Esses resultados fornecem suporte às funções regulatórias conservadas do fem e dsx e demonstram um link entre os elementos-chave das vias de determinação do sexo e da casta. Cinco genes candidatos pertencentes a vias de sinalização de crescimento celular ou vias regulatórias com amplos efeitos fenotípicos no desenvolvimento apresentaram uma relação com a determinação das castas em M. interrupta. A expressão de dois genes da via Insulin/Insulin-Like (IIS) foi alterada em resposta ao HJ (InR1 e InR2), mas em sentidos opostos. Também foi observado que os genes codificadores da enzima DNA metiltransferase 3 (Dnmt3), a qual é um elemento chave na regulação epigenética, e da proteína do vitelo vitelogenina (Vg) apresentam uma relação com a diferenciação das castas. Ademais, a expressão do dsx foi aumentada pelos altos níveis de HJ, o que corrobora os resultados anteriores sobre o fem. Além desse ser o primeiro estudo a identificar genes regulatórios relacionados a determinação das castas em Melipona, esses resultados dão uma ideia sobre a estratégia social usada por essas abelhas para alcançarem a alta eussocialidade sem depender de uma plasticidade baseada em nutrição. Finalmente, a análise de genes relacionados ao metabolismo de HJ revelou que as flutuações nos títulos de HJ durante o desenvolvimento larval parecem ser reguladas pela via catabólica. Nas operárias adultas, a comparação do perfil de expressão do mfe e jhe com achados recentes sobre a titulação de HJ em outra espécie de Melipona forneceu indícios de que o HJ pode estar desempenhando papéis alternativos na organização social das operárias. Tomados em conjunto, esses resultados proveem uma base para análises mais aprofundadas sobre os processos de determinação do sexo e da casta. Além disso, as evidências encontradas aqui de uma conexão entre as vias de determinação do sexo e da casta apontam para a via de determinação do sexo como uma potencial base para a evolução da especialização morfológica entre as castas.

Diferenças no timing da melanização e esclerotização do exoesqueleto são evidentes quando se compara a morfologia externa de abelhas de hábitos sociais e as solitárias. A esta diferença convencionamos chamar de heterocronia da maturação cuticular, o termo heterocronia significando variações no tempo relativo, ou ritmo, de um evento ontogenético em relação ao ancestral ou entre taxons. Propusemos que as abelhas sociais, que após a ecdise permanecem na colônia por vários dias, alcançariam a maturidade de alguns sistemas orgânicos, entre eles o tegumento, muito mais tarde que as espécies de abelhas solitárias que ao emergir partem imediatamente para atividades extra-nidais. Neste contexto, o objetivo deste trabalho consistiu em testar esta hipótese utilizando o tegumento em maturação das espécies de abelhas sociais, Apis mellifera e Frieseomelitta varia, e da espécie solitária Centris analis, em estudos comparativos de expressão gênica, ultraestrutura e quantificação de hidrocarbonetos cuticulares (CHCs). Para isto utilizamos sequenciamento de mRNA (RNA-seq), microscopia eletrônica de transmissão (MET) e cromatografia de gás e espectrometria de massas (CG/MS). Os perfis de expressão de genes da via de melanização/esclerotização cuticular (ebony e tan) diferenciaram as espécies sociais da solitária, assim como a expressão de genes com função na via de metabolismo de quitina (Cda5, Idgf4 e chitooligosacchariodolytic-domain-like) e de genes codificadores de proteínas estruturais da cutícula (CPR14, CPR17, CPR18, CPR25, CPR23, CPR26, Apd-3 e Apd-like). Genes com função na regulação da maturação cuticular (FTZ-F1, E74, Hr46 e Hr4) se mostraram co-expressos nas espécies sociais e os perfis de expressão destes genes, exceto Hr46, e de outros reguladores (Ethr, Hr38, Rickets e Ptx-1) também diferenciaram as espécies sociais da solitária. Ressaltamos em nossas análises os genes do ciclo circadiano, cuja expressão tem relação com a deposição de quitina cuticular, além de genes de vias de pigmentação não melanínicas. As análises de MET, abrangendo outras três espécies de abelhas (Bombus brasilienses: primitivamente eussocial; Euglossa cordata: facultativamente social; Tetrapedia diversipes: solitária), mostraram diferenças consistentes entre a ultraestrutura e espessura das cutículas das espécies sociais e solitárias, o que reforçou nossos resultados de RNA-seq. A quantificação absoluta dos CHCs diferenciou as abelhas sociais da solitária, consistente com a hipótese de heterocronia da maturação cuticular e com os perfis de expressão de genes envolvidos na biossíntese de CHCs. Assim, além de desvendar transcriptomas de tegumento de três espécies de abelhas, a comparação da expressão gênica aliada à análise de ultraestrutura da cutícula e quantificação de CHCs levaram à caracterização de diferenças no processo de maturação cuticular entre as espécies sociais e solitárias / Differences in the timing of exoskeleton melanization and sclerotization processes are evident when comparing the external morphology of social and solitary bee species. Such differences may constitute a relevant example of cuticular maturation heterochrony, this term referring to a genetic change in timing of an ontogenetic process relative to an ancestor or between taxons. We proposed that social bees, which remain protected inside the colony for many days before initiating outside nest activities, would reach the maturity of some organic systems, such as the integument (epidermis and cuticle), later than solitary bees, which start such activities immediately after ecdysis. We tested this hypothesis in a comparative study of the developing integument of eusocial bees, Apis mellifera and Frieseomelitta varia, and the solitary bee Centris analis. Using RNA-seq, we verified that the expression profiles of genes involved in cuticular melanization and sclerotization (ebony and tan), chitin deposition and organization (Cda5, Idgf4, chitooligosacchariodolytic-domain-like), and cuticle formation (CPR14, CPR17, CPR18, CPR25, CPR23, CPE26, Apd-3, Apd-like) were positively, correlated between the two eusocial species, but not between the eusocial and the solitary species. Some of the genes with roles in regulating exoskeleton maturation (FTZ-F1, E74, Hr46, Hr4) were co-expressed only in the eusocial species. The expression profiles of these genes (except Hr46) and other regulatory genes (Ethr, Hr38, Rickets, Ptx-1) were also positively correlated exclusively in the eusocial bees. We also highlighted the expression of genes involved in non-melanin pigment production and the expression of circadian rhythm genes that could be related to chitin layers deposition. Transmission electron microscopy analysis of the integument of the two eusocial and the solitary bee species, in addition to other three bee species (the primitively eusocial Bombus brasilienses; the facultatively social Euglossa cordata; the solitary bee Tetrapedia diversipes), showed differences in cuticle ultrastructure and thickness, thus supporting the RNA-seq data. In agreement with our hypothesis, CHC quantifications were consistent with the expression levels of genes involved in CHC biosynthesis, thus differentiating the superficial cuticle layer of the eusocial and solitary species. Together, the integument transcriptomes, ultrastructure, and CHC quantification allowed us to characterize differences in the timing of cuticle maturation in social and solitary bees

Diferenças no timing da melanização e esclerotização do exoesqueleto são evidentes quando se compara a morfologia externa de abelhas de hábitos sociais e as solitárias. A esta diferença convencionamos chamar de heterocronia da maturação cuticular, o termo heterocronia significando variações no tempo relativo, ou ritmo, de um evento ontogenético em relação ao ancestral ou entre taxons. Propusemos que as abelhas sociais, que após a ecdise permanecem na colônia por vários dias, alcançariam a maturidade de alguns sistemas orgânicos, entre eles o tegumento, muito mais tarde que as espécies de abelhas solitárias que ao emergir partem imediatamente para atividades extra-nidais. Neste contexto, o objetivo deste trabalho consistiu em testar esta hipótese utilizando o tegumento em maturação das espécies de abelhas sociais, Apis mellifera e Frieseomelitta varia, e da espécie solitária Centris analis, em estudos comparativos de expressão gênica, ultraestrutura e quantificação de hidrocarbonetos cuticulares (CHCs). Para isto utilizamos sequenciamento de mRNA (RNA-seq), microscopia eletrônica de transmissão (MET) e cromatografia de gás e espectrometria de massas (CG/MS). Os perfis de expressão de genes da via de melanização/esclerotização cuticular (ebony e tan) diferenciaram as espécies sociais da solitária, assim como a expressão de genes com função na via de metabolismo de quitina (Cda5, Idgf4 e chitooligosacchariodolytic-domain-like) e de genes codificadores de proteínas estruturais da cutícula (CPR14, CPR17, CPR18, CPR25, CPR23, CPR26, Apd-3 e Apd-like). Genes com função na regulação da maturação cuticular (FTZ-F1, E74, Hr46 e Hr4) se mostraram co-expressos nas espécies sociais e os perfis de expressão destes genes, exceto Hr46, e de outros reguladores (Ethr, Hr38, Rickets e Ptx-1) também diferenciaram as espécies sociais da solitária. Ressaltamos em nossas análises os genes do ciclo circadiano, cuja expressão tem relação com a deposição de quitina cuticular, além de genes de vias de pigmentação não melanínicas. As análises de MET, abrangendo outras três espécies de abelhas (Bombus brasilienses: primitivamente eussocial; Euglossa cordata: facultativamente social; Tetrapedia diversipes: solitária), mostraram diferenças consistentes entre a ultraestrutura e espessura das cutículas das espécies sociais e solitárias, o que reforçou nossos resultados de RNA-seq. A quantificação absoluta dos CHCs diferenciou as abelhas sociais da solitária, consistente com a hipótese de heterocronia da maturação cuticular e com os perfis de expressão de genes envolvidos na biossíntese de CHCs. Assim, além de desvendar transcriptomas de tegumento de três espécies de abelhas, a comparação da expressão gênica aliada à análise de ultraestrutura da cutícula e quantificação de CHCs levaram à caracterização de diferenças no processo de maturação cuticular entre as espécies sociais e solitárias / Differences in the timing of exoskeleton melanization and sclerotization processes are evident when comparing the external morphology of social and solitary bee species. Such differences may constitute a relevant example of cuticular maturation heterochrony, this term referring to a genetic change in timing of an ontogenetic process relative to an ancestor or between taxons. We proposed that social bees, which remain protected inside the colony for many days before initiating outside nest activities, would reach the maturity of some organic systems, such as the integument (epidermis and cuticle), later than solitary bees, which start such activities immediately after ecdysis. We tested this hypothesis in a comparative study of the developing integument of eusocial bees, Apis mellifera and Frieseomelitta varia, and the solitary bee Centris analis. Using RNA-seq, we verified that the expression profiles of genes involved in cuticular melanization and sclerotization (ebony and tan), chitin deposition and organization (Cda5, Idgf4, chitooligosacchariodolytic-domain-like), and cuticle formation (CPR14, CPR17, CPR18, CPR25, CPR23, CPE26, Apd-3, Apd-like) were positively, correlated between the two eusocial species, but not between the eusocial and the solitary species. Some of the genes with roles in regulating exoskeleton maturation (FTZ-F1, E74, Hr46, Hr4) were co-expressed only in the eusocial species. The expression profiles of these genes (except Hr46) and other regulatory genes (Ethr, Hr38, Rickets, Ptx-1) were also positively correlated exclusively in the eusocial bees. We also highlighted the expression of genes involved in non-melanin pigment production and the expression of circadian rhythm genes that could be related to chitin layers deposition. Transmission electron microscopy analysis of the integument of the two eusocial and the solitary bee species, in addition to other three bee species (the primitively eusocial Bombus brasilienses; the facultatively social Euglossa cordata; the solitary bee Tetrapedia diversipes), showed differences in cuticle ultrastructure and thickness, thus supporting the RNA-seq data. In agreement with our hypothesis, CHC quantifications were consistent with the expression levels of genes involved in CHC biosynthesis, thus differentiating the superficial cuticle layer of the eusocial and solitary species. Together, the integument transcriptomes, ultrastructure, and CHC quantification allowed us to characterize differences in the timing of cuticle maturation in social and solitary bees