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Detailed Analysis of the Domains of Mtr4 and How They Regulate Helicase ActivityTaylor, Lacy Leigh 01 May 2014 (has links)
There are numerous RNAs transcribed in the cell that are not directly involved in protein translation. Maintaining proper levels of RNA is crucial for cell viability, making RNA surveillance an essential process (equivalent to regulating protein levels). Mtr4 is an essential RNA helicase that activates exosome-mediated 3'-5' turnover in RNA processing mechanisms. Mtr4 has several binding partners, with the most prominent one being the complex Trf4/5-Air1/2-Mtr4 polyadenylating (TRAMP) complex. The polyadenylation and unwinding activity of TRAMP is modulated by a sensing mechanism in Mtr4 that detects both length and identity of 3'-end poly(A) tails. While it has been known that Mtr4 has an unwinding preference for substrates with a 3' poly(A) tail and a length of approximately 5 nucleotides, the mechanistic detail is unclear. It is also unclear what structural features of Mtr4 contribute to this sensing function. By using x-ray crystal structures of Mtr4, a ratchet helix was identified to interact with RNA substrates. Significant conservation of this ratchet helix along the RNA binding path was observed, similar to conservation patterns throughout Ski2-like and DEAH/RHA-box helicases. Structural characterization revealed a novel arch domain shown to bind structured RNAs, which may aid in cooperative RNA recognition in conjunction with the ratchet helix. In this thesis we demonstrate that the conserved residues at the third (R1030) and fourth (E1033) turns of the Mtr4 ratchet helix uniquely influence RNA unwinding rates. Furthermore, when mutated, ratchet helix positions confer slow growth phenotypes to Saccharomyces cerevisiae and are synthetically lethal in an Mtr4-archless background. The unwinding activity of these mutants when in the TRAMP complex alters the unwinding rates of Mtr4, and in some instances recovers substrate specificity. Our findings demonstrate the importance of R1030 and E1033 for helicase activity, and additionally link the arch domain of Mtr4 in essential unwinding events.
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Ultrastructural analysis of biogenesis and release of endothelial extracellular vesicles / Ultrastrukturelle Analyse der Biogenese und Freisetzung von endothelialen extrazellulären VesikelnElsner, Clara Dorothea January 2022 (has links) (PDF)
Extracellular vesicle (EV)-mediated intercellular communication through exosomes, microvesicles (MVs) and apoptotic bodies has been shown to be implicated in various physiological as well as pathological processes such as the development and progression of atherosclerosis. While the cellular machinery controlling EV formation and composition has been studied extensively, little is known about the underlying morphological processes. This study focuses on a detailed ultrastructural analysis of the different steps of EV formation and release in Myocardial Endothelial (MyEnd) and Aortic Endothelial (AoEnd) cells cultured under serum starvation and inflammatory stimulation with TNF-α. Detailed morphological analyses were conducted applying and comparing different high- resolution light and electron microscopic methods. In this study, we could depict all steps of MV biogenesis named in literature. However, during the study of exosome biogenesis, we discovered a yet undescribed process: Instead of a direct fusion with the plasma membrane, multivesicular bodies were incorporated into a new distinct cellular compartment bound by fenestrated endothelium first. This may present a novel step in exosome biogenesis and warrants further study. Regarding the conditions of cell cultivation, we observed that the commonly used serum starvation causes MyEnd cells, but not AoEnd cells, to enter apoptosis after 48 hours. When preparing functional EV studies, we therefore recommend assessing the morphological condition of the serum-starved cells at different cultivation points first. When evaluating MV production, a statistical analysis showed that the more time AoEnd cells spent in cultivation under serum starvation, the higher the percentage of MV producing cells. However, additional TNF-α stimulation induced a significantly higher MV production than serum starvation alone. Lastly, our results show that TNF-α stimulation of AoEnd cells in vitro leads to the upregulation of CD44, an adhesion molecule critical in the early stages of atherosclerosis. CD44 was then depicted on the surface of generated MVs and exosomes. We conclude that under inflammatory conditions, EVs can mediate the transfer of CD44 from endothelial cells to target cells. This could be a novel mechanism by which MVs contribute to the development and progression of atherosclerotic disease and should be clarified by further studies. / Extrazelluläre Vesikel (EV), darunter Exosomen, Mikrovesikel (MV) und apoptotische Körperchen, werden von fast allen Zellen des Körpers freigesetzt, transportieren zellspezifische Informationen und sind von großer Bedeutung in der Zell-Zell-Kommunikation. Sie spielen eine zentrale Rolle in verschiedensten physiologischen sowie pathologischen Vorgängen, wie etwa der Atherosklerose. Während die zellulären Mechanismen hinter der Entstehung und Komposition der EV bereits intensiv erforscht wurden, ist noch wenig über die zugrundeliegenden morphologischen Prozesse bekannt. Diese Arbeit präsentiert eine detaillierte ultrastrukturelle Analyse der Bildung und Freisetzung von EV in myokardialen (MyEnd) und aortalen Endothelzellen (AoEnd), die unter Serumentzug sowie inflammatorischer Stimulation mit TNF-α kultiviert wurden. Dazu wendeten wir verschiedene hochauflösende licht- und elektronenmikroskopische Techniken an. Wir konnten alle in der Literatur beschriebenen Schritte der MV-Biogenese darstellen. Bei der Untersuchung der exosomalen Biogenese entdeckten wir jedoch einen bisher unbekannten Prozess: Anstelle einer direkten Fusion der multivesikulären Körperchen mit der Plasmamembran, wurden diese zunächst in ein neues, von fenestriertem Endothel begrenztes, zelluläres Kompartiment integriert. Ferner stellten wir fest, dass der häufig durchgeführte Serumentzug während der Kultivierung bei MyEnd- – allerdings nicht AoEnd- – Zellen nach 48 Stunden zur Apoptose führte. Daher empfehlen wir, bei funktionellen Studien von EV zunächst eine morphologische Untersuchung der unter Serumentzug kultivierten Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten durchzuführen. Eine statistische Analyse der MV-Produktion zeigte, dass die Zellen umso mehr MV produzierten, je länger sie sich unter Serumentzug befanden. Jedoch induzierte eine zusätzliche Stimulation mit TNF-α eine signifikant höhere MV-Produktion als der alleinige Serumentzug. Wir konnten zeigen, dass eine TNF-α Stimulation von AoEnd Zellen in vitro zu einer vermehrten Expression von CD44 führte – einem vor allem in der Frühphase der Atherosklerose bedeutendem Adhäsionsmolekül. CD44 konnte ebenso auf der Oberfläche von produzierten MV und Exosomen nachgewiesen werden. Wir schließen daraus, dass MV unter inflammatorischen Bedingungen den Transfer von CD44 von Endothelzellen zu Zielzellen vermitteln und so zur Entstehung und Progression von Atherosklerose beitragen können.
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Bedeutung von extrazellulären Vesikeln im inflammatorischen Geschehen: Untersuchungen an monozytären extrazellulären VesikelnRademacher, Phil 06 February 2023 (has links)
Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind von einer Lipiddoppelmembran umschlossen und können Proteine, Nukleinsäuren, sowie Kohlenhydrate enthalten. Die sehr heterogenen EVs werden von einer Vielzahl eu- und prokaryotischer Zellen freigesetzt und sind aus allen menschlichen Körperflüssigkeiten isolierbar. EVs können über mehrere Mechanismen Informationen zwischen Zellen übertragen und spielen damit eine wichtige, aber größtenteils unerforschte Rolle in der Zell-Zell-Kommunikation. So erlauben die Oberflächenproteine der EVs einerseits Interaktionen mit membranständigen Rezeptoren auf Zellen, während EVs andererseits endozytiert werden können und ihr Inhalt somit nach intrazellulär transportiert werden kann. Der enge Informationsaustausch in der Zusammenarbeit verschiedener Zellen ist charakteristisch für das Immunsystem, in dem Monozyten eine zentrale Stellung vor allem bei der Abwehr bakterieller Infektionen einnehmen. Allerdings ist die Funktion von monozytären extrazellulären Vesikeln, wie auch viele ihrer Charakteristika, weitgehend unbekannt.
Mit dem Ziel, die monozytären extrazellulären Vesikel genauer zu charakterisieren, erfolgte die Separation primärer humaner Monozyten aus Leukozytenkonzentraten gesunder Blutspender mit Gegenstromelutriation oder Positivselektion über das Oberflächenmolekül CD14. Dabei zeigte sich, dass die Nutzung von Gegenstromelutriation zur Separation primärer humaner Monozyten vorteilhaft hinsichtlich höherer Ausbeute an Zellen und höherer Zellvitalität war, während die Positivselektion eine höhere Zellreinheit erlaubte. Nach Kultur der Monozyten in vesikelfreiem Medium wurden die EVs mittels differentieller Ultrazentrifugation aus den Zellkulturüberständen isoliert und charakterisiert. Die unspezifische Charakterisierung der EVs hinsichtlich der Größenverteilung und Quantität erfolgte mit nanoparticle tracking-Analyse und zeigte gut mit kleinen bis mittelgroßen EVs vereinbare Ergebnisse. In Einklang damit stellten sich die monozytären EVs als sphärische, nanoskalige Strukturen in der Raster-Heliumionenmikroskopie dar. Der Nachweis spezifischer Oberflächenmoleküle auf den EVs erfolgte mit einer bead-basierten durchflusszytometrischen Methode (MACSPlex). Die EVs positivselektierter Monozyten trugen MHC-II, CD63, CD81, CD24, CD44, sowie CD14, CD31 und CD11c auf ihrer Oberfläche. Dies belegte einerseits die Isolation extrazellulärer Vesikel und deutete gleichzeitig auf den monozytären Ursprung und mögliche Interaktionen der Vesikel hin. Die Sensitivität von CD14 als möglicher Marker für monozytäre EVs zeigte sich aufgrund geringer Signalintensität als wahrscheinlich ungenügend. Bei Charakterisierung der EVs von Monozyten, welche mit Gegenstromelutriation separiert wurden, zeigten sich regelmäßig zusätzlich Thrombozyten-spezifische Oberflächenmoleküle. Die Kontamination monozytärer EVs mit thrombozytären EVs konnte durchflusszytometrisch mit MACSPlex erkannt und durch Positivselektion der Monozyten vermieden werden. Das Tetraspanin CD9, welches allgemein einen wenig spezifischen Marker für EVs darstellt, zeigte sich bei Nachweis auf EVs primärer humaner Monozyten am ehesten als Ausdruck einer Kontamination mit thrombozytären EVs. Somit gelang der Nachweis mehrerer Oberflächenproteine auf monozytären EVs unter gleichzeitigem Ausschluss von Kontaminationen mit EVs anderer Blutzellen oder Thrombozyten. Eine Stimulation der positivselektierten, beziehungsweise mit Gegenstromelutriation separierten primären humanen Monozyten mit Lipopolysaccharid (LPS) führte zu einer im Mittel um 70 %, beziehungsweise um 86 % verstärkten Freisetzung extrazellulärer Vesikel in den Zellkulturüberstand. Dabei veränderte sich die Größenverteilung, die Oberflächenbeschaffenheit und die relative Expression der untersuchten Oberflächenproteine nicht signifikant. Extrazelluläre Vesikel, welche in Anwesenheit von LPS gewonnen wurden, wiesen auch nach dem Isolationsprozess eine relevante Endotoxinkonzentration auf, was wahrscheinlich einen erheblichen Einfluss auf andere LPS-sensible Zellen hätte. Daher wurden nur die ohne LPS gewonnenen monozytären EVs auf eine immunmodulatorische Funktion hin untersucht. Dafür wurden in-vitro differenzierte M1- beziehungsweise M2-Makrophagen nach Inkubation mit monozytären EVs einem LPS-Stimulus ausgesetzt. Die Zytokinantwort der Makrophagen wurde mit RT-PCR und ELISA für IL-1β, IL-10, IL-6, IL-8 und TNF-α analysiert. Extrazelluläre Vesikel primärer humaner Monozyten zeigten unter den gewählten experimentellen Bedingungen keinen statistisch signifikanten Einfluss auf die Zytokinantwort von in-vitro differenzierten M1- und M2-Makrophagen auf einen LPS-Stimulus. Dennoch nahm die Transkription der proinflammatorischen Zytokine in LPS-stimulierten M1-Makrophagen durch Vorinkubation mit monozytären EVs ab.
Die gewonnenen Ergebnisse unterstreichen die Komplexität der Forschung an extrazellulären Vesikeln von Primärzellen und unterstützen die Notwendigkeit genauer und kritischer Charakterisierung von EVs, beispielsweise mit durchflusszytometrischen Multiplex-Methoden für die Bestimmung von Oberflächenmolekülen. Weitere Studien sind nötig, um die intravesikulären Charakteristika monozytärer EVs und die Art derer Interaktion mit verschiedenen Zellen zu untersuchen. Das Verständnis der Rolle von EVs im Ablauf inflammatorischer Reaktionen könnte perspektivisch zu deren Einsatz im Rahmen zielgerichteter Immunmodulation oder Diagnostik führen.
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Analyse exosomaler microRNAs im Serum von Patientinnen mit Brustkrebsmetastasen / Analysis of exosomal microRNAs in serum of patients with breast cancer metastasesReifschläger, Leonie Sophie January 2023 (has links) (PDF)
Das Mammakarzinom ist weltweit die häufigste krebsbedingte Todesursache bei Frauen. Fortschritte in der Therapie ermöglichen zwar eine Verlängerung der Lebens- dauer, jedoch kommt es dadurch vermehrt zur Bildung von Metastasen im zentralen Nervensystem (ZNS). Die Diagnostik und Behandlung von ZNS-Metastasen sind be- grenzt und die Lebensqualität sowie Lebensdauer der Betroffenen nimmt bei zerebraler Metastasierung rapide ab. Ziel aktueller Forschungsprojekte ist daher, Biomarker zu identifizieren, die Hinweise auf eine Brustkrebserkrankung oder Metastasierung liefern. So soll eine kostengünstige, risikoarme und minimalinvasive Methode etabliert werden, die zuverlässige Daten über die Prognose und dementsprechende Therapien erbringt. Diese Arbeit hatte daher die Absicht, mithilfe von qPCR Expressionsprofile von miRNAs aus Serumproben von Brustkrebspatientinnen zu erstellen und deren Funktion als prog- nostische Biomarker für eine Metastasierung ins ZNS zu erweisen. Anhand von Metas- tasierung und Rezeptorstatus wurden die Proben in Untergruppen eingeteilt und statis- tisch mit einer gesunden Kontrollgruppe verglichen.
Insgesamt zeigte sich bei 26 miRNAs eine signifikante Dysregulation der Expression bei mindestens einer der Untergruppen. Insbesondere bei ZNS-Metastasen war das Expres- sionsmuster bei miRNA-122-5p, miRNA-296-5p, miRNA-490-3p und miRNA-576-3p sig- nifikant erhöht, während die Expression von miRNA-130a-3p, miRNA-148b-3p und miRNA-326 signifikant reduziert war. Basierend auf den Übereinstimmungen unserer Er- gebnisse mit den Daten bisheriger Forschungsprojekten wiesen vier miRNAs eine po- tenzielle Funktion als Biomarker für Metastasen auf: miRNA-122-5p, miRNA-490-3p und miRNA-130a-3p, miRNA-326. Bei ZNS-Metastasen zeigten besonders miRNA-122-5p und miRNA-490-3p statistisch relevante Veränderungen.
Um den Einfluss von miRNAs auf den gesamten Körper darzustellen, wurde mithilfe ver- schiedener Datenbanken nach entsprechenden Zielgenen und Signalwegen für die 26 identifizierten miRNAs recherchiert. Neben dem Einfluss auf Stoffwechselwege und Er- krankungen, zeigte sich bei acht Targets ein Zusammenhang mit der Entstehung von Krebs.
Ergänzend zur Identifikation von miRNA-Expressionsprofilen wurden Zellkulturversuche mit zerebralen Endothel- (cerebEND) und Brustkrebszellen (4T1) durchgeführt. Verwendet wurden zwei cerebEND- und eine 4T1-Zellreihe von Mäusen, von denen eine ce- rebEND-Kultur zuvor in der Arbeitsgruppe Burek mit einem miRNA-210-Vektor trans- fiziert wurde.
Studien belegen den Einfluss von miRNA-210 auf den mitochondrialen Stoffwechsel, Angiogenese, Reaktionen auf DNA-Schäden, Apoptose und Zellüberleben sowie auf die Proteine BRCA1, PARP1 und E-Cadherin und schreiben ihr damit eine Funktion in der Krebsentstehung und Metastasierung zu.
Zur Bestimmung der Proliferation und Aktivität der transfizierten cerebEND-210-Zellen im Verhältnis zur unbehandelten Kontrolle, wurden BrdU-Proliferationsassays und MTT- Assays mit verschiedenen Zellzahlen durchgeführt. Bei der Untersuchung der Prolifera- tion zeigte sich in beiden Versuchen eine erhöhte Aktivität der cerebEND-210-Zellen, da miRNA-210 vermutlich auch hier das Zellüberleben gesichert hat. Zudem wurde die An- heftung der Brustkrebszellen an den zerebralen Endothelzellen im Adhäsionsversuchs überprüft. Hierbei wurde eine Abnahme der Adhäsion der cerebEND-210-Zellen beo- bachtet. Vermutet wird eine Veränderung des Phänotyps der Rezeptorbindungen der cerebEND-210-Zellen.
Die Ergebnisse der Zellkulturversuche dienen als Grundlage für weitere Experimente. / Breast cancer is the most common cause of cancer-related death in women worldwide. Although advances in therapy allow for increased longevity, this results in increased metastasis to the central nervous system (CNS). Diagnosis and treatment of CNS metastases are limited and the quality of life and lifespan of those affected decreases rapidly with cerebral metastasis. Therefore, the goal of current research projects is to identify biomarkers that provide evidence of breast cancer disease or metastasis. Thus, a low-cost, low-risk, and minimally invasive method should be established that yields reliable data on prognosis and corresponding therapies. Therefore, this work aimed to use qPCR to establish expression profiles of miRNAs from serum samples of breast cancer patients and prove their function as prognostic biomarkers for metastasis to the CNS. Based on metastasis and receptor status, samples were divided into subgroups and statistically compared with a healthy control group. Overall, 26 miRNAs showed significant dysregulation of expression in at least one of the subgroups. Specifically, in CNS metastases, the expression pattern of miRNA-122-5p, miRNA-296-5p, miRNA-490-3p and miRNA-576-3p was significantly increased, while the expression of miRNA-130a-3p, miRNA-148b-3p and miRNA-326 was significantly decreased. Based on the agreements of our results with the data of previous research projects, four miRNAs showed potential function as biomarkers of metastasis: miRNA-122-5p, miRNA-490-3p and miRNA-130a-3p, miRNA-326. In CNS metastases, miRNA-122-5p and miRNA-490-3p in particular showed statistically relevant changes. To demonstrate the influence of miRNAs on the whole body, we searched for corresponding target genes and signaling pathways for the 26 identified miRNAs using various databases. In addition to their influence on metabolic pathways and diseases, eight targets were found to be associated with the development of cancer.
Complementary to the identification of miRNA expression profiles, cell culture experiments were performed with cerebral endothelial (cerebEND) and breast cancer (4T1) cells. Two cerebEND and one 4T1 cell lines from mice were used, one cerebEND culture of which was previously transfected with a miRNA-210 vector in the Burek group.
Studies demonstrate the influence of miRNA-210 on mitochondrial metabolism, angiogenesis, DNA damage responses, apoptosis and cell survival, as well as on BRCA1, PARP1 and E-cadherin proteins, thus attributing it a function in carcinogenesis and metastasis. To determine the proliferation and activity of the transfected cerebEND-210 cells relative to the untreated control, BrdU proliferation assays and MTT assays were performed with different cell
numbers. Proliferation assays showed increased activity of cerebEND-210 cells in both experiments, as miRNA-210 presumably ensured cell survival in this case as well. In addition, the attachment of breast cancer cells to cerebral endothelial cells was examined in the adhesion assay. Here, a decrease in adhesion of cerebEND-210 cells was observed. A change in the phenotype of receptor binding of cerebEND-210 cells is suspected.
The results of the cell culture experiments serve as a basis for further experiments.
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Význam exosomů a ektosomů pro virulenci Trichomonas vaginalis. / Role of exosomes and ectosomes in Trichomonas vaginalis virulenceGöblová, Rebeka January 2020 (has links)
Trichomonas vaginalis is a causative agent of the most common non-viral sexually transmitted disease with approximately 275 mil new cases annually. Virulence of this parasitic depends on at least four factors: cell shape transformation, cytoadherence, secretion of cysteine proteases, and presence of endosymbionts. Over the past decades, extracellular vesicles appeared being another important player in the host-parasite interaction. It was discovered that T. vaginalis is one of the protists that can shed the extracellular vesicles such as exosomes and ectosomes. These vesicles are possibly involved in host-parasite communications, however limited information is available about their function. To investigate a possible role of exosomes in T. vaginalis virulence, we first selected suitable strain, which is free of endosymbionts (TV 17-2MI). Next we prepared six clones of TV 17-2MI strain to test whether the strain is homogenous concerning the virulence, or there are differences in virulence among individual cells. Mouse intraperitoneal virulence tests revealed that the clones displayed significant differences in virulence level, particularly in abscess formation and mortality of infected animals. Thus, for the first time we demonstrated heterogeneity of cells derived from a single T. vaginalis strain...
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Mechanisms of Multivesicular Body Biogenesis and Exosome Release / Biogenese multivesikulärer Endosomen und Mechanismen der ExosomenfreizetzungHsu, Chieh 08 February 2010 (has links)
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