Les nanotubes de tunnellisation (TNT) sont des structures riches en F-actine qui relient des cellules distantes, permettant le transport de nombreux composants cellulaires (des vésicules, des organites etc.). Les TNT sont impliqués dans des processus cellulaires clés, tels que le développement, l'immunité et la régénération des tissus, mais également dans la transmission de divers agents pathogènes. Plusieurs facteurs moléculaires ont été identifiés pour participer à la formation de la formation de TNT. Le complexe de l'exocyste est l'un des premiers facteurs moléculaires impliqués dans cette formation. Il est impliqué dans l’attachement des vésicules sécrétoires, suggère que les protéines qui régulent le trafic vésiculaire pourraient jouer un rôle dans la formation de TNT. Nous avons émis l'hypothèse que la formation de TNT est modulée par des protéines qui participent à la fois à la régulation du trafic vésiculaire et au remodelage du cytosquelette d'actine, deux processus qui sont essentiels pour la formation de ces structures. Comme les Rab-GTPase sont les principaux régulateurs du trafic vésiculaire et participent à la régulation du cytosquelette d'actine, nous avons examiné le rôle de cette famille de protéines dans la formation de TNT. Tout d'abord, nous avons effectué un criblage de plusieurs protéines de Rab pour son effet sur le transfert de vésicule dépendant de TNT. Nous avons constaté que Rab8a, Rab11a et Rab35 ont un effet positif sur le transfert de vésicule. Surexpression de Rab8a et Rab11a augmentait également le nombre de cellules connectées au TNT. Lors de la surexpression de VAMP3 (une autre protéine impliquée dans le trafic vésiculaire), augmentait du nombre de cellules connectées au TNT. Une analyse plus poussée a montré que les trois protéines (Rab11a, Rab8a et VAMP3), ont un effet sur la formation de TNT de manière cascade. Pour établir une relation entre Rab11a et Rab8a, nous avons vérifié le rôle de Rabin8 sur la formation de TNT (une protéine qui interagit avec Rab11 et qui active Rab8) et nous n’avons observé aucun effet dans la formation de TNT. De plus, nous avons vérifié une autre protéine dont la fonction est similaire à Rabin8, à savoir GRAB (facteur d’échange de nucléotide de guanine-GAP- pour Rab3A) et son rôle dans la formation de TNT. Surexpression de GRAB augmente la formation de TNT, mais qu’elle agit de manière indépendante de Rab11 et Rab8a pour réguler la formation de TNT. L'analyse de Rab35-GTP, impliquée dans le recyclage des endocytes, la cytokinèse et la croissance des neurites, augmente la formation de TNT. La croissance des neurites est nécessaire pour la connectivité neuronale et le recyclage des vésicules joue un rôle crucial dans ce processus. Rab35 interagit avec plusieurs protéines impliquées dans le trafic vésiculaire, telles que ACAP2 (GAP de ARF6), MICAL-L1 (molécule interagissant avec CasL-like1 et participe dans le recyclage des vésicules) EHD1 (un ciseau moléculaire) qui participe dans la scission de la vésicule). Sur les endosomes positifs pour ARF6, Rab35 recrute ACAP2 et MICAL-L1 et forme un complexe qui se lie à EHD1 pour réguler la croissance des neurites. Nos données suggèrent fortement que ces effecteurs pourraient également être impliqués dans la formation de TNT. Individuellement, ACAP2, EHD1 et ARF6-GDP régulent la formation de TNT de manière positive et MICAL-L1 ne montre aucun effet sur les TNT. En outre, des données préliminaires indiquent que Rab35 et EHD1 agissent dans un mécanisme en cascade pour réguler la formation de TNT, suggérant que la formation de TNT et la croissance des neurites peuvent agir de manière similaire. Les molécules identifiées constituent des cibles moléculaires potentielles pour les thérapies visant à bloquer la propagation d'agents pathogènes transférés à travers les TNT. Cette étude prouve que les protéines jouant un rôle dans le trafic vésiculaire et la croissance des neurites participent également à la formation de TNT. / Tunneling nanotubes (TNTs) are F-actin rich structures that connect distant cells, allowing the transport of many cellular components, including vesicles, organelles and different kind of molecules. TNTs are implicated in key cellular processes, such as development, immunity and tissue regeneration, but also in the transmission of various pathogens. Several molecular factors have been identified to participate in the regulation of TNT formation. One of the early molecular factors that is implicated in TNT formation is the exocyst complex. This complex is also involved in the tethering of secretory vesicles during secretion, which suggest that proteins that regulate vesicle trafficking could have a role in TNT formation. We have hypothesized that the formation of TNTs is modulated by proteins that participate in both, the regulation of vesicle trafficking and the remodelling of the actin cytoskeleton, and that these two processes are key for the formation of these structures. Since Rab GTPases are the major regulators of vesicle trafficking and also participate in actin cytoskeleton regulation, we examined the role of this protein family in TNT formation. First, we performed a screening of several different Rab proteins for its effect on TNT-dependent vesicle transfer. We found that Rab8a, Rab11a and Rab35 have a positive effect on vesicle transfer. Additional studies demonstrated that Rab8a and Rab11a overexpression also increase the number of TNT connected cells. Upon overexpression of VAMP3 (another protein involved in vesicle trafficking), we also observed an increase in the number of TNT connected cells. Further analysis showed that all three proteins, i.e. Rab11a, Rab8a and VAMP3, show an effect on TNT formation in a cascade dependent manner. To establish a relationship between Rab11a and Rab8a, we checked the role of Rabin8 (a protein that interacts with Rab11 and activates Rab8), on TNT formation and we found that it has no role in TNT formation. Additionally, we checked another protein whose function is similar to Rabin8, i.e. GRAB (guanine nucleotide exchange factor for Rab3A) and its role in TNT formation. The results show that GRAB overexpression increases TNT formation, but it acts in a pathway independent of Rab11 and Rab8a to regulate TNT formation. The analysis of Rab35, a protein involved in endocytic recycling, cytokinesis and neurite outgrowth, showed that the GTP-Rab35 bound form also increases TNT formation. Neurite outgrowth is an essential process in order to establish neural connectivity and vesicle recycling plays a crucial role in this process. Rab35 interacts with several proteins, that are involved in vesicle trafficking such as such as ACAP2 (acts as GAP of ARF6), MICAL-L1 (molecule interacting with CasL-like 1, which plays a role in vesicle recycling) EHD1 (a molecular scissor that has a role in vesicle scission). At the ARF6 positive endosomes, Rab35 recruits ACAP2 and MICAL-L1, and forms a complex that binds to EHD1 to regulate neurite outgrowth.Our data strongly suggest that these effectors may also be involved in the formation of TNTs. Individually, ACAP2, EHD1 and ARF6-GDP regulate TNT formation in a positive manner. But MICAL-L1 overexpression in cells shows no effect on TNTs. Also, preliminary data, indicates that Rab35 and EHD1 acts in a cascade mechanism to regulate TNT formation. This indicates that TNT formation and neurite outgrowth may act in a similar, but not exact pathway. The molecules identified here that have a role in TNT formation, constitute potential molecular targets for therapies aiming to block the spreading of pathogens that transfer through TNTs.This study proves that proteins that have a role in vesicle trafficking and neurite outgrowth, such as Rab proteins, are also involved in TNT formation.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第20791号 / 医博第4291号 / 新制||医||1025(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 岩井 一宏, 教授 松田 道行, 教授 秋山 芳展 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Rab35 est une petite GTPase de la superfamille des Ras protéines. Chez l’Homme, plus de 60 Rabs jouent un rôle clef « d’interrupteur moléculaire » dans la régulation du trafic membranaire. Des progrès significatifs ont été réalisé sur le rôle de certaines Rabs, cependant il reste encore un travail important de compréhension fonctionnelle et du mécanisme d’action de celles-ci au sein de la cellule. L’actuel projet a pour but d’étudier Rab35, un régulateur essentiel d’une voie de recyclage vésiculaire vers la membrane plasmique, aussi impliqué dans la régulation de l’actine lors de la dernière étape de la division cellulaire. Rab35 agit via le recrutement et la régulation de protéines spécifiques appelées effecteurs. Chez l’humain, des mutations chez les partenaires de Rab35 entrainent de rares maladies connues sous le nom du syndrome de Birt-Hogg-Dube et syndrome de Lowe. Ce projet en étroite collaboration avec le laboratoire d’Arnaud Echard (Institut Pasteur) consiste à mieux comprendre le rôle cellulaire et fonctionnel de deux nouveaux effecteurs de Rab35 : MICAL1 et MiniBAR. Lors de la division cellulaire, MICAL1 pourrait réduire le niveau d’actine avant l’abscission car il possède un domaine catalytique monooxygénase démontré comme étant un facteur de désassemblage de l’actine. MICAL1 agit directement sur les filaments d’actine et oxyde des résidus spécifiques permettant la dépolymérisation de ces derniers. Mais il est actuellement inconnue si MICAL1 joue un rôle dans la division cellulaire. Par ailleurs, nos collaborateurs ont découvert un nouvel effecteur de Rab35 appelé MiniBAR. Ils ont récemment décrit MiniBAR comme étant un partenaire spécifique de Rab35 et contenant un domaine BAR (connue pour lier et courber les membranes). Ce domaine, adjacent au domaine d’interaction de Rab35, lie spécifiquement Rac1 une autre GTPase bien connue pour son rôle dans la régulation de l’actine. De ce fait MiniBAR pourrait être un lien entre les deux GTPases coordonnant le processus de remodelage de l’actine dans la cellule.Le laboratoire de Motilité Structurale dirigé par Anne Houdusse est spécialisé dans l’étude structurale des moteurs moléculaire et GTPases qui contribuent aux différentes fonctions dans la cellule par l’interaction avec leur différents cargos et effecteurs. L’élaboration de ce projet consiste à caractériser d’un point de vue structural et fonctionnel les complexes entre Rab35 et ses effecteurs. Laboratoire spécialisé dans la détermination de structure à haute résolution par cristallographie aux rayons X, ce travail mènera à la résolution de complexes macromoléculaires afin de désigner des mutants spécifiques pour des études fonctionnelles dans la cellule en étroite collaboration avec l’équipe d’Arnaud Echard, leader dans l’étude cellulaire de Rab35. / Rab35 is an essential regulator of a recycling pathway back to the plasma membrane, that is also required for the post-furrowing terminal steps during cytokinesis that are associated with F-actin depolymerisation [1]. Rab35 performs its role in the cell via recruitment and regulation of specific effector proteins. Recently the lab of our collaborator Arnaud Echard (Pasteur institute, Paris) has identified and is currently studying by cell biology approaches two novel Rab35 effectors - MICAL1 and MiniBAR proteins. MICAL1 may restrict actin levels before cytokinesis abscission, because it harbours a monooxygenase catalytical domain and has been shown to be an F-actin-disassembly factor [2]. But it is unknown whether MICAL1 has a function in cell division. Another effector of Rab35 currently uncharacterized was identified and named MiniBAR by our collaborators. They recently described that MiniBAR specifically binds to active Rab35, that it contains an unnoticed, putative BAR domain (known to sense membrane curvature) and that this domain, adjacent to the Rab35-binding domain, binds specifically to GTP-bound Rac1 - a well known actin remodelling regulator. So, MiniBAR may function as a linker between the two small GTPases coordinating actin-remodelling processes in the cell. The aim of the project is to perform extensive structural/functional characterization of complexes between the Rab35 GTPase and its interacting effector proteins.References:[1] - Dambournet and al, Nat Cell Biol, 2011. Rab35 GTPase and OCRL phosphatase remodel lipids and F-actin for successful cytokinesis.[2] - Giridharan SS and Caplan S, Antioxid Redox Signal, 2014. MICAL-family proteins: Complex regulators of the actin cytoskeleton.

L'établissement de la polarité apico-basale dans les tissus épithéliaux est étroitement lié à la division cellulaire, mais les mécanismes moléculaires sous-jacents n'ont pas encore été établis. A l'aide d'un modèle de culture en 3 dimensions de cellules rénales (MDCK), j'ai montré que lors du développement d'un cyst, la GTPase Rab35 joue un rôle majeur dans l'établissement de la polarité et le positionnement du lumen pendant la première division cellulaire. Au niveau moléculaire, Rab35 permet de coupler l'initiation de la polarité apico-basale avec la cytocinèse via l'attachement au sillon de clivage de vésicules intracellulaires contenant des déterminants clé de l'établissement de la polarité. Ces vésicules transportent notamment les protéines aPKC, Cdc42, Crumbs3 ainsi que le facteur d'ouverture de la lumière Podocalyxin. De plus, l'attachement de ces vésicules au sillon de clivage dépend de l'interaction directe entre Rab35 et la queue cytoplasmique de Podocalyxin. Par conséquence, l'inactivation de Rab35 entraine une inversion complète de la polarité apico-basale des kystes 3D. J'ai mis en évidence un nouveau mécanisme de ciblage des vésicules intracellulaire au site de clivage dépendant de la protéine Rab35 impliqué à la fois dans l'initiation de la polarité apico-basale et dans l'ouverture de la lumière au centre du cyst. / Establishment and maintenance of apico-basal polarity in epithelial organs must be tightly coupled with cell division, but the underlying molecular mechanisms are largely unknown. Using 3D cultures of renal MDCK cells (cysts), I found that the Rab35 GTPase plays a crucial role in polarity initiation and apical lumen positioning during the first cell division of cyst development. At the molecular level, Rab35 physically couples cytokinesis with the initiation of apico-basal polarity by tethering intracellular vesicles containing key apical determinants at the cleavage site. These vesicles transport aPKC, Cdc42, Crumbs3 and the lumen promoting factor Podocalyxin, and are tethered through a direct interaction between Rab35 and the cytoplasmic tail of Podocalyxin. Consequently, Rab35 inactivation leads to complete inversion of apico-basal polarity in 3D cysts. This novel and unconventional mode of Rab-dependent vesicle targeting provides a simple mechanism for triggering both initiation of apico-basal polarity and lumen opening at the centre of cysts.

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Le trafic vésiculaire joue un rôle crucial dans la sécrétion et l'internalisation des composantes extracellulaires ou membranaires. De plus, il contrôle la distribution spatio-temporelle de nombreuses protéines. En outre, ce processus peut contrôler la livraison de protéines à divers domaines des membranes plasmiques. Mes travaux de recherche se sont centrés sur l'étude des protéines Rab11-Family of Interacting Proteins de classe I (Rab11FIPs), plus précisément de Rab11FIP1 et de sa fonction dans différents processus cellulaires nécessitant le trafic vésiculaire, tels que la mitose, la cytokinèse, l'établissement de la polarité cellulaire et de la migration cellulaire, individuelle ou collective. En effet, ces processus nécessitent un contrôle vésiculaire finement régulé, par exemple, la mitose/cytokinèse nécessite le recrutement de différents complexes protéiques contenant des cargaisons liées aux vésicules. L'établissement de la polarité cellulaire nécessite le tri et la livraison de complexes protéiques à des membranes spécifiques et la migration cellulaire nécessite une polarisation complète de la cellule pour permettre un mouvement directionnel. Mes travaux ont élucidé une voie impliquant Rab11FIP1 et Rab35 dans le contrôle à la fois de la cytokinèse et de l'établissement de la polarité. En effet, alors que d'autres groupes ont publié que Rab35 est essentiel pour l'élimination de l'actine située au pont intercellulaire via le recrutement de MICAL1 et OCRL, j'ai montré que Rab11FIP1 est critique pour maintenir Rab35 dans cette région. De plus, j'ai montré que l'absence de Rab11FIP1 et la mauvaise localisation subséquente de Rab35 peuvent conduire à des phénotypes similaires à ceux observés lors de la dérégulation de l'abscission, tels que la binucléation et le retard de la cytokinèse, qui sont des défauts qui contribuent au développement de cancers. Ces défauts peuvent cependant être rétablies en utilisant de faibles doses de Latrunculin A pour dépolymériser de l'actine. De plus, j'ai montré que Rab11FIP1 et Rab35 semblent avoir des fonctions dans la polarité apico-basale des cellules Caco-2 et MCF-10a. Enfin, j'ai aussi montré que Rab35 est impliquée dans la régulation de la migration collective. En conclusion, mes données établissent Rab11FIP1 et Rab35 comme des régulateurs importants de divers processus cellulaires. Ces résultats constituent un point de départ important pour une étude plus approfondie de l'abscission, de l'établissement de la polarité cellulaire, de la formation du Apical Membrane Initiation Site (AMIS) et de la migration cellulaire collective. Cela aura des implications de grande envergure, car ces cascades de signalisation peuvent avoir un impact sur pratiquement tous les processus cellulaires. / Vesicular trafficking plays a crucial role in the secretion and internalization of extracellular or plasma membrane components. Moreover, it controls the spatiotemporal distribution of many proteins during different processes. Also, it can control the delivery of proteins to various domains of the plasma membranes. With this in mind, my research focused on the Rab11 Family of Interacting Proteins of Class I (Rab11FIPs), more specifically of Rab11FIP1 and its function in different cellular processes that require vesicular trafficking, those being mitosis, cytokinesis, establishment of cell polarity and cellular migration, both single and collective. Indeed, these processes require exquisite vesicular control, for example, mitosis/cytokinesis require the recruitment of different protein complexes containing vesicle-bound cargoes. Cell polarity establishment requires the sorting and delivery of protein complexes and cell migration requires fine-tuned polarization of the entire cell to allow for directional movement. My work has elucidated one such pathway involving Rab11FIP1 and Rab35 in the control of both cytokinesis and the establishment of polarity. Indeed, while others have shown that Rab35 is critical for the removal of actin in the intercellular bridge via recruitment of its cargoes MICAL1 and OCRL, I showed that Rab11FIP1 is vital for maintaining Rab35 in the midbody. In fact, I showed that lack of Rab11FIP1 and subsequent mislocalization of Rab35 can lead to similar phenotypes observed during dysregulated abscission, such as binucleation and cytokinesis delay, which are hallmarks of cancer. These phenotypes however, can be rescued using low doses of an actin depolymerizing drug called Latrunculin A. Furthermore, I showed that both Rab11FIP1 and Rab35 seem to have functions in the establishment of apico-basal polarity of both Caco-2 and MCF-10a. Finally, I showed that Rab35 seems to regulate the collectiveness of migrating cells. Altogether, these data establish Rab11FIP1 and Rab35 as important regulators of various cellular processes. These results will be an important stepping stone for further studies into abscission, establishment of cellular polarity, Apical Membrane Initiation Site (AMIS) formation, and collective cell migration. This will have far reaching implications, as these signaling cascades can impact virtually all cellular processes.