Au cours de la réplication, la réparation des cassures double brin (CDB) par recombinaison homologue (RH), basée sur la synthèse d’ADN à partir de la chromatide sœur, permet le maintien de la stabilité du génome. La religature d’extrémités (EJ) éloignées de CDB peut quant à elle générer des réarrangements menaçant son intégrité. Nous avons étudié le mécanisme de réparation par EJ en fonction de la distance séparant deux cassures double brin. En utilisant des substrats intra-chromosomiques permettant la mesure de l’efficacité et de la fidélité du EJ après ligature d’extrémités éloignées ou proximales, nous avons mis en évidence l’implication du complexe de cohésion dans l’inhibition du EJ d’extrémités distales. Le complexe de cohésion joue donc un rôle central dans l’interface réplication/réparation ; la cohésion des chromatides sœurs favorise la réparation par RH et permet l’inhibition spécifique du EJ d’extrémités éloignées, probablement en limitant la mobilité de la chromatine endommagée et la formation d’une synapse propice au rapprochement des extrémités. La religature d’extrémités éloignées est également nécessaire aux mécanismes de diversification des gènes des immunoglobulines tels que la recombinaison V(D)J et la commutation de classe. L’étude de souris Rad21+/- a également démontré une implication du complexe de cohésion dans ces mécanismes essentiels à la diversité de l’information génétique. Le complexe de cohésion étant impliqué dans ces mécanismes et dans l’inhibition des réarrangements complexes tels que les translocations et insertions il est un acteur essentiel de la diversité et de la stabilité génomique. / DNA double-strand breaks (DSBs) repair is essential for genome stability/diversity, but can also generate genome rearrangements. Although non-homologous end-joining (NHEJ) is required for genome stability maintenance, the joining of distant double strand ends (DSE) should inexorably lead to genetic rearrangements. We analyzed the efficiency and accurency of close or distal EJ repair. Our data show that global end-joining is more efficient on close ends (34bp) compared to distal ends (3200bp) and that C-NHEJ is favored on close ends, resulting in more accurate outcome, compared to distal ends where more mutagenic A-EJ events takes place. In addition, the joining of distal ends favors the insertion/capture of DNA sequences. These data show only few kb distances between two DSEs are sufficient to jeopardize DSB repair efficiency and accuracy, leading to complex scars at the re-sealed junctions, and cell response is sufficiently sensitive to differently process such distal ends. We next addressed the question of the mechanisms preventing the joining of distant DSE. We show that depletion of the cohesin complex proteins specifically stimulates the end-joining of I-SceI-induced DSBs distant of 3200bp, while the joining of close DSEs (34bp) remained unaffected. Consistently, exome sequencing and cytogenetic analysis revealed that RAD21 ablation generates large chromosome rearrangements and a strong induction of replication stress-induced chromosome fusions. These data reveal a role for the cohesin complex in the protection against profound genome rearrangements arising through ligation of distant DSEs.

Le génome du virus de l’Hépatite C est constitué d’un ARN monocaténaire linéaire de polarité positive (+). Les interactions ARN-ARN prennent une place essentielle dans la régulation du cycle viral.La synthèse de l’ARN est réalisée par l’ARN-polymérase ARN-dépendante (RdRp) codée par le virus. Elle serait initiée à l’extrémité 3’ des molécules à répliquer. Un ARN génomique complémentaire de polarité négative (-) est d’abord synthétisé. Il sert ensuite de matrice pour la production des brins génomiques. Les mécanismes qui président au recrutement de la polymérase et à l’initiation de la synthèse d’ARN restent, aujourd’hui, mal connus.Les structures ARN présentes aux extrémités 3’ et leurs rôles ont donc étés étudiés au cours des travaux de cette thèse. Au niveau de l’extrémité 3’ de l’ARN (+), la dimérisation a été montrée indispensable à la réplication du virus in cellulo. Ces travaux ont par la suite permis de caractériser par gel retard et cryo-microscopie la dimérisation des ARN génomiques en solution. Au niveau de l’extrémité 3’ de l’ARN (-), la dimérisation de deux molécules a également pu être caractérisée par des approches biochimiques et biophysiques. Par ailleurs la présence d’un G-quadruplex introduit un remaniement conformationnel qui se révèle indispensable à une synthèse performante de l’ARN. De manière similaire au brin génomique, la dynamique structurale résultante de ces interactions semble donc nécessaire à une réplication efficace de l’ARN par la RdRp.Les résultats obtenus soulignent l’importance de la dimérisation et des variations conformationnelles prisent aux extrémités 3’ pour la réplication de l’ARN. Ces données ouvrent alors la voie vers de nouvelles perspectives quant à la compréhension des mécanismes qui président au fonctionnement de la polymérase du VHC. / The hepatitis C virus genome consists of a linear positive sens (+) single-stranded RNA. RNA-RNA interactions play an essential role in the regulation of the viral cycle.RNA synthesis is performed by the RNA-dependent RNA-polymerase (RdRp) encoded by the virus. It would be initiated at the 3 'end of the molecule to be replicated. A complementary genomic RNA of negative polarity (-) is first synthesized. It then serves as a matrix for the production of genomic strands. The mechanisms that govern the recruitment of the polymerase and the initiation of RNA synthesis remain poorly understood today.The RNA structures found at the 3 'ends and their roles have therefore been studied during the work of this thesis. At the 3 'end of the (+) RNA, dimerization was shown to be essential for replication of the virus in cellulo. This work made it possible to characterize by gel shift assay and cryo-microscopy the dimerization of the genomic RNAs in solution. At the 3 'end of (-) RNA, the dimerization of two molecules could also be characterized by biochemical and biophysical approaches. Moreover, the presence of a G-quadruplex introduces a conformational reshuffle which proves to be indispensable for an efficient RNA synthesis. Similarly to the genomic strand, the resulting structural dynamics of these interactions appear to be necessary for efficient RNA replication by the RdRp.The results obtained here underline the importance of dimerization and conformational variations at the 3 'ends for RNA replication. These data then open the way to new perspectives on understanding the mechanisms that govern the functioning of HCV polymerase.

Les modifications post-traductionnelles des protéines par des polymères d’ADP-ribose (PAR) ou par phosphorylation permet l’assemblage des complexes de la réparation de l’ADN à la chromatine endommagée dont les fonctions sont essentielles pour assurer le maintien de la stabilité du génome. En réponse aux lésions de l’ADN, l’activité de synthèse de PAR des protéines PARP1 et PARP2 est fortement stimulée. Les PAR servent de signalisation pour le recrutement de multiples protéines, dont la protéine plateforme XRCC1.Les études menées au cours de cette thèse ont porté sur l’étude de la régulation des fonctions des protéines PARP1, PARP2 dans la réparation des cassures double brins (CDB) et l’étude des modifications de XRCC1 par phosphorylation en réponse à des dommages de l’ADN. En utilisant des substrats permettant de mesurer l’efficacité des différentes voies de réparation des CDB, nous avons démontré que PARP2, et non PARP1, est impliqué dans la régulation du choix des voies de la réparation des CDB. Plus spécifiquement, nous avons montré que PARP2 stimule l’initiation de la résection des extrémités des CDB dépendante de CtIP, indépendamment de son activité catalytique. Par des approches de vidéo-microscopie, nous avons pu déterminer que PARP2 limite l’accumulation de 53BP1 aux sites de dommages induits par micro-irradiation laser. Nous proposons que la protéine PARP2, en limitant le recrutement de la protéine 53BP1 aux sites de dommages, favorise la réparation des CDB dépendante de la résection des extrémités d’ADN, au détriment de la voie canonique de jonction des extrémités. Ces résultats sont les premiers démontrant un rôle de PARP2 dans le choix des voies de réparation des CDB.En parallèle, nous avons analysé comment la phosphorylation régule les fonctions de la protéine XRCC1. Par des approches in vitro et in vivo, nous avons pu déterminer que l’interdomaine 1 de XRCC1 est phosphorylé par la kinase CDK5. En réponse aux dommages induits par un agent alkylant, XRCC1 est activement déphosphorylé in vivo. De plus, nous avons observé que lorsque l’interdomaine 1 ne peut pas être phosphorylé in vitro, l’interaction de XRCC1 avec les PAR synthétisés par PARP1 et PARP2 augmente, et le recrutement de XRCC1 aux sites de dommages de l’ADN est accru. Ces résultats indiquent pour la première fois que la déphosphorylation de XRCC1 en réponse à un stress génotoxique participe activement à son recrutement aux sites de dommages.Dans leur ensemble, ces travaux ont contribué à améliorer nos connaissances fondamentales des réseaux de protéines impliquées dans la prise en charge des dommages de l’ADN. La compréhension de ces mécanismes est essentielle non seulement car ils participent au maintien de la stabilité du génome mais aussi du fait du développement exponentiel de nouvelles stratégies anti-tumorales qui visent à inhiber les voies de la réparation dans la but de cibler spécifiquement les cellules cancéreuses. / Post-translational modifications of proteins by polymers of ADP-ribose (PAR) or by phosphorylation allow the assembly of DNA repair protein complexes at damaged chromatin and are crucial to ensure genome stability. In response to DNA insults, the synthesis of PAR by the PARP1 and PARP2 proteins is strongly induced. PAR act as a signaling platform for the recruitment of multiples proteins at the sites of DNA damages, including the scaffold protein XRCC1. Research conducted during this PhD have been focused on studying the regulation of PARP1 and PARP2 functions in double-strands break repair (DSBR), and in investigating the role of XRCC1 modifications by phosphorylation in response to DNA damage.Using DNA repair assay allowing us to assess the accuracy of the different DSBR pathways, we demonstrated that PARP2, and not PARP1, is involved in the regulation of DNA double-strands break repair pathway choice. More precisely, we showed that PARP2 stimulates CtIP dependent initiation of end-resection at DSB, independently of its catalytic activity. By live cell imaging, we were able to determine that PARP2 limit 53BP1 accumulation at DNA damage sites induced by laser-microirradiation. We propose that by limiting 53BP1 accumulation at DNA damage sites, PARP2 stimulate DSB repair pathway that depend on DNA end-resection, thus counteracting the canonical end-joining pathway. These results are the first demonstrating a role for PARP2 in DNA DBSR pathway choice.In addition, we analyzed how the functions of XRCC1 are regulated by phosphorylation. Using in vitro and in vivo approaches, we were able to demonstrate that the linker 1 region of XRCC1 is phosphorylated by the CDK5 kinase. XRCC1 is actively dephosphorylated in response to DNA damage induced by an alkylating agent in vivo. We also observed that when the linker 1 cannot be phosphorylated, the XRCC1 interaction between the PAR synthetized by PARP1 and PARP2 is stimulated, and XRCC1 recruitement at the sites of DNA damage is far more efficient. These evidences indicate for the first time that the dephosphorylation of XRCC1 actively participate in its recruitment at the site of DNA damage. Put together, this work contributed to strengthen our fundamental knowledge of the protein network involved in the DNA damage response. Knowledge of those mechanisms is crucial since they participate in maintaining genome stability, and because new antitumoral drugs targeting DNA repair pathways in the attempt to specifically killed tumor cells are exponentially released.

Notre laboratoire a récemment découvert un mode d’expression des gènes mitochondriaux inédit chez le protozoaire biflagellé Diplonema papillatum. Outre son ADNmt formé de centaines de chromosomes circulaires, ses gènes sont fragmentés. Le gène cox1 qui code pour la sous unité I de la cytochrome oxydase est formé de neuf modules portés par autant de chromosomes. L’ARNm de cox1 est obtenu par épissage en trans et il est également édité par insertion de six uridines entre deux modules. Notre projet de recherche a porté sur une étude globale des processus post-transcriptionnels du génome mitochondrial de diplonémides. Nous avons caractérisé la fragmentation de cox1 chez trois autres espèces appartenant aux deux genres du groupe de diplonémides à savoir : Diplonema ambulator, Diplonema sp. 2 et Rhynchopus euleeides. Le gène cox1 est fragmenté en neuf modules chez tous ces diplonémides mais les modules sont portés par des chromosomes de taille et de séquences différentes d’une espèce à l’autre. L’étude des différentes espèces a aussi montrée que l’édition par insertion de six uridines entre deux modules de l’ARNm de cox1 est commune aux diplonémides. Ainsi, la fragmentation des gènes et l’édition des ARN sont des caractères communs aux diplonémides. Une analyse des transcrits mitochondriaux de D. papillatum a permis de découvrir quatre autres gènes mitochondriaux édités, dont un code pour un ARN ribosomique. Donc, l'édition ne se limite pas aux ARNm. De plus, nous avons montré qu’il n’y a pas de motifs d’introns de groupe I, de groupe II, de type ARNt ou d’introns impliqués dans le splicéosome et pouvant être à l’origine de l’épissage des modules de cox1. Aucune complémentarité significative de séquence n’existe entre les régions flanquantes de deux modules voisins, ni de résidus conservés au sein d’une espèce ou à travers les espèces. Nous avons donc conclu que l’épissage en trans de cox1 chez les diplonémides fait intervenir un nouveau mécanisme impliquant des facteurs trans plutôt que cis. L’épissage et l’édition de cox1 sont dirigés probablement par des ARN guides, mais il est également possible que les facteurs trans soient des molécules protéiques ou d’ADN. Nous avons élucidé les processus de maturation des transcrits mitochondriaux de D. papillatum. Tous les transcrits subissent trois étapes coordonnées et précises, notamment la maturation des deux extrémités, l’épissage, la polyadénylation du module 3’ et dans certains cas l’édition. La maturation des extrémités 5’ et 3’ se fait parallèlement à l’épissage et donne lieu à trois types d’intermédiaires. Ainsi, un transcrit primaire avec une extrémité libre peut se lier à son voisin. Cet épissage se fait apparemment sans prioriser un certain ordre temporel alors que dans le cas des transcrits édités, l’édition précède l`épissage. Ces études donnant une vue globale de la maturation des transcrits mitochondriaux ouvrent la voie à des analyses fonctionnelles sur l’épissage et l’édition chez D. papillatum. Elles sont le fondement pour finalement élucider les mécanismes moléculaires de ces deux processus post-transcriptionnels de régulation dans ce système intriguant. / Our laboratory has recently discovered an unprecedented mode of expression of mitochondrial genes in D. papillatum, a biflagellate protozoan. In addition to its mtDNA formed of hundreds of circular chromosomes, genes are fragmented. For example, the cox1 gene which encodes the subunit one of the cytochrome oxidase complex, comprises nine modules carried by nine chromosomes. The cox1 mRNA is obtained by trans-splicing and is also edited by the insertion of six uridines between two modules. My thesis project focused on the study of post-transcriptional processes in diplonemid mitochondria. We characterized the fragmentation of cox1 in three other species belonging to two diplonemids genera: Diplonema ambulator, Diplonema sp. 2 and Rhynchopus euleeides. The cox1 gene is fragmented into nine modules in all species but the modules are carried by chromosomes of different size and sequences from one species to another. We have shown that there are no motifs for classical introns, including spliceosomal and archaeal introns, as well as introns of group I and II, that might be implicated in the trans-splicing of cox1 modules. No significant complementarity exists between the flanking regions of two neighboring modules, nor are any conserved residues within a species or across species. We therefore concluded that the trans-splicing of cox1 in diplonemids involves a novel mechanism implicating trans rather than cis-factors. Trans-splicing and editing of cox1 probably involve guide RNAs, but it is also possible that the trans-factors are proteins or DNA molecules. The study of different species has also shown that the insertion of six uridines between two cox1 modules in mRNA is a shared trait in these diplonemids. We discovered that four other mitochondrial genes are also edited in D. papillatum and that RNA editing is not limited to mRNA. So, fragmented genes and RNA editing are common characteristics of diplonemids. We elucidated D. papillatum’s mitochondrial transcript maturation steps. All transcripts undergo three coordinated and precise processes including end processing, trans-splicing and / or editing and polyadenylation. The processing of the 5 'and 3' ends gives rise to three kinds of maturation intermediates. A primary transcript with one free end can bind to its neighbor and trans-splicing occurs without directionality. In the case of edited transcripts, editing precedes trans-splicing. These studies have prepared the ground for functional studies of trans-splicing and RNA editing with the long term goal to elucidate the molecular mechanisms involved in post-transcriptional regulation in this intriguing system.

La Résonance Magnétique Nucléaire RMN DOSY (Diffusion Ordered SpectroscopY) 1H est une technique permettant de mesurer les coefficients de diffusion des espèces en solution. Elle permet ainsi d’obtenir des informations structurales de par sa dimension RMN conventionnelle mais également des informations physico-chimiques telles que la taille de la (macro)molécule ou encore la formation d’agrégats. L’objectif de ces travaux a été d’examiner comment les méthodes de RMN (RMN 1D ,2D et DOSY), permettent de fournir des informations sur la caractérisation des matériaux polymères. La première partie de ce travail souligne l’intérêt de la RMN pour la caractérisation de la microstructure de quelques matériaux polymères en s’attardant plus particulièrement sur l’exploration de leurs extrémités de chaînes. La RMN s’est en effet révélée très performante pour établir le lien entre extrémité de chaîne et méthode de polymérisation appliquée. Le deuxième volet de ces travaux concerne l’étude de quelques architectures complexes (type dibloc et tribloc) et la mise en évidence du caractère contrôlé d’une copolymérisation radicalaire grâce à la RMN diffusionnelle. Nous avons également vu comment déterminer la masse moyenne en poids (Mw) par une simple mesure du coefficient d’autodiffusion. Finalement, l’ensemble des travaux présentés dans ce manuscrit a été valorisé grâce à l’étude des interactions par RMN diffusionnelle. Plus particulièrement la RMN DOSY 1H a permis d’observer des phénomènes de micellisation, d’agrégation, d’encapsulation et de relargage de molécules de principe actif. / Diffusion Ordered Spectroscopic Nuclear Magnetic Resonance (DOSY NMR 1H) makes it possible to determine physicochemical data such diffusion coefficients. While typical NMR data on the structure of molecules can be obtained, this technique also permits determinations of the physicochemical characteristics, such as molecular sizes or aggregate formation. The objective of this work was to examine how various NMR methodologies, specifically, 1 and 2 dimensional DOSY NMR, can be applied to the characterization of polymers. The first part of the manuscript relates the NMR characterization of some polymeric materials with a special interest in chain-end groups. In particular, we demonstrate the relationships between chain-ends and the polymerization methods employed. In a second part, the potential of the DOSY technique is used to determine controlled features of a radical polymerization resulting in di- and triblock architectures. Molecular weights are also determined by self-diffusion coefficient measurements. The results presented herein demonstrate that diffusional NMR can be effectively employed to understand interactions in polymeric structures. Indeed, DOSY 1H-NMR provides new interesting results concerning micellization, aggregation, encapsulation phenomena and the release of active molecules.

Notre laboratoire a récemment découvert un mode d’expression des gènes mitochondriaux inédit chez le protozoaire biflagellé Diplonema papillatum. Outre son ADNmt formé de centaines de chromosomes circulaires, ses gènes sont fragmentés. Le gène cox1 qui code pour la sous unité I de la cytochrome oxydase est formé de neuf modules portés par autant de chromosomes. L’ARNm de cox1 est obtenu par épissage en trans et il est également édité par insertion de six uridines entre deux modules. Notre projet de recherche a porté sur une étude globale des processus post-transcriptionnels du génome mitochondrial de diplonémides. Nous avons caractérisé la fragmentation de cox1 chez trois autres espèces appartenant aux deux genres du groupe de diplonémides à savoir : Diplonema ambulator, Diplonema sp. 2 et Rhynchopus euleeides. Le gène cox1 est fragmenté en neuf modules chez tous ces diplonémides mais les modules sont portés par des chromosomes de taille et de séquences différentes d’une espèce à l’autre. L’étude des différentes espèces a aussi montrée que l’édition par insertion de six uridines entre deux modules de l’ARNm de cox1 est commune aux diplonémides. Ainsi, la fragmentation des gènes et l’édition des ARN sont des caractères communs aux diplonémides. Une analyse des transcrits mitochondriaux de D. papillatum a permis de découvrir quatre autres gènes mitochondriaux édités, dont un code pour un ARN ribosomique. Donc, l'édition ne se limite pas aux ARNm. De plus, nous avons montré qu’il n’y a pas de motifs d’introns de groupe I, de groupe II, de type ARNt ou d’introns impliqués dans le splicéosome et pouvant être à l’origine de l’épissage des modules de cox1. Aucune complémentarité significative de séquence n’existe entre les régions flanquantes de deux modules voisins, ni de résidus conservés au sein d’une espèce ou à travers les espèces. Nous avons donc conclu que l’épissage en trans de cox1 chez les diplonémides fait intervenir un nouveau mécanisme impliquant des facteurs trans plutôt que cis. L’épissage et l’édition de cox1 sont dirigés probablement par des ARN guides, mais il est également possible que les facteurs trans soient des molécules protéiques ou d’ADN. Nous avons élucidé les processus de maturation des transcrits mitochondriaux de D. papillatum. Tous les transcrits subissent trois étapes coordonnées et précises, notamment la maturation des deux extrémités, l’épissage, la polyadénylation du module 3’ et dans certains cas l’édition. La maturation des extrémités 5’ et 3’ se fait parallèlement à l’épissage et donne lieu à trois types d’intermédiaires. Ainsi, un transcrit primaire avec une extrémité libre peut se lier à son voisin. Cet épissage se fait apparemment sans prioriser un certain ordre temporel alors que dans le cas des transcrits édités, l’édition précède l`épissage. Ces études donnant une vue globale de la maturation des transcrits mitochondriaux ouvrent la voie à des analyses fonctionnelles sur l’épissage et l’édition chez D. papillatum. Elles sont le fondement pour finalement élucider les mécanismes moléculaires de ces deux processus post-transcriptionnels de régulation dans ce système intriguant. / Our laboratory has recently discovered an unprecedented mode of expression of mitochondrial genes in D. papillatum, a biflagellate protozoan. In addition to its mtDNA formed of hundreds of circular chromosomes, genes are fragmented. For example, the cox1 gene which encodes the subunit one of the cytochrome oxidase complex, comprises nine modules carried by nine chromosomes. The cox1 mRNA is obtained by trans-splicing and is also edited by the insertion of six uridines between two modules. My thesis project focused on the study of post-transcriptional processes in diplonemid mitochondria. We characterized the fragmentation of cox1 in three other species belonging to two diplonemids genera: Diplonema ambulator, Diplonema sp. 2 and Rhynchopus euleeides. The cox1 gene is fragmented into nine modules in all species but the modules are carried by chromosomes of different size and sequences from one species to another. We have shown that there are no motifs for classical introns, including spliceosomal and archaeal introns, as well as introns of group I and II, that might be implicated in the trans-splicing of cox1 modules. No significant complementarity exists between the flanking regions of two neighboring modules, nor are any conserved residues within a species or across species. We therefore concluded that the trans-splicing of cox1 in diplonemids involves a novel mechanism implicating trans rather than cis-factors. Trans-splicing and editing of cox1 probably involve guide RNAs, but it is also possible that the trans-factors are proteins or DNA molecules. The study of different species has also shown that the insertion of six uridines between two cox1 modules in mRNA is a shared trait in these diplonemids. We discovered that four other mitochondrial genes are also edited in D. papillatum and that RNA editing is not limited to mRNA. So, fragmented genes and RNA editing are common characteristics of diplonemids. We elucidated D. papillatum’s mitochondrial transcript maturation steps. All transcripts undergo three coordinated and precise processes including end processing, trans-splicing and / or editing and polyadenylation. The processing of the 5 'and 3' ends gives rise to three kinds of maturation intermediates. A primary transcript with one free end can bind to its neighbor and trans-splicing occurs without directionality. In the case of edited transcripts, editing precedes trans-splicing. These studies have prepared the ground for functional studies of trans-splicing and RNA editing with the long term goal to elucidate the molecular mechanisms involved in post-transcriptional regulation in this intriguing system.

Les défauts dans la réparation des cassures double-brin de l'ADN (DSBs) peuvent avoir d'importantes conséquences pouvant entrainer une instabilité génomique et conduire à la mort cellulaire ou au développement de cancers. Dans la plupart des cellules mammifères, le mécanisme de Jonction des Extrémités Non Homologues (NHEJ) est le principal mécanisme de réparation des DSBs. L'ADN Ligase IV (LigIV) est une protéine unique dans sa capacité à promouvoir la NHEJ classique. Elle s'associe avec deux autres protéines structuralement similaires, XRCC4 et XLF (ou Cernunnos). LigIV interagit directement avec XRCC4 pour former un complexe stable, tandis que l'interaction entre XLF et ce complexe est médiée par XRCC4. XLF stimule fortement l'activité de ligation du complexe LigIV/XRCC4 par un mécanisme encore indéterminé. Récemment, un rôle structurel non catalytique a été attribué à LigIV (Cottarel et al., 2013). Dans le travail de thèse présenté ici, nous avons reconstitué l'étape de ligation de la NHEJ en utilisant des protéines recombinantes produites dans des bactéries afin d’une part, d'explorer les bases moléculaires du rôle structural de LigIV, d’autre part de comprendre le mécanisme par lequel XLF stimule le complexe de ligation, et enfin de mieux comprendre comment ces trois protéines coopèrent au cours de la NHEJ. Nos analyses biochimiques suggèrent que XLF via son interaction avec XRCC4 lié à LigIV, pourrait induire un changement conformationnel dans la LigIV. Ce réarrangement de la ligase exposerait son interface de liaison à l'ADN ce qui lui permettrait alors de ponter deux molécules indépendantes d'ADN, une capacité indépendante de l'activité catalytique de LigIV. / Failure to repair DNA double-strand breaks (DSBs) may have deleterious consequences inducing genomic instability and even cell death. In most mammalian cells, Non-Homologous End Joining (NHEJ) is a prominent DSB repair pathway. DNA ligase IV (LigIV) is unique in its ability to promote classical NHEJ. It associates with two structurally related proteins called XRCC4 and XLF (aka Cernunnos). LigIV directly interacts with XRCC4 forming a stable complex while the XLF interaction with this complex is mediated by XRCC4. XLF strongly stimulates the ligation activity of the LigIV/XRCC4 complex by an unknown mechanism. Recently, a structural noncatalytic role of LigIV has been uncovered (Cottarel et al., 2013). Here, we have reconstituted the end joining ligation step using recombinant proteins produced in bacteria to explore not only the molecular basis for the structural role of LigIV, but also to understand the mechanism by which XLF stimulates the ligation complex, and how these three proteins work together during NHEJ. Our biochemical analysis suggests that XLF, through interactions with LigIV/XRCC4 complex, could induce a conformational change in LigIV. Rearrangement of the LigIV would expose its DNA binding interface that is able to bridge two independent DNA molecules. This bridging ability is fully independent of LigIV’s catalytic activity. We have mutated this interface in order to attempt to disrupt the newly identified DNA bridging ability. In vitro analysis of this LigIV mutant will be presented as well as a preliminary in vivo analysis.