Nos últimos anos, o sistema do peptídeo natriurético do tipo C (CNP) e seu receptor (NPR-B) foi apontado como um importante regulador do processo de ossificação endocondral. Vários estudos em animais evidenciam o seu papel de estímulo à proliferação e diferenciação de condrócitos e secreção de matriz extracelular. Mutações bialélicas com perda de função do gene do NPR-B (NPR2) levam a uma doença denominada displasia acromesomélica do tipo Maroteaux (AMDM), uma displasia esquelética caracterizada por baixa estatura extrema. Observa-se que familiares de pacientes com AMDM carreadores de mutação no NPR2 têm estatura abaixo da média da população a qual pertencem, sugerindo um papel de mutações em heterozigose do NPR2 como causadoras de baixa estatura idiopática (BEI). Os objetivos deste estudo foram avaliar a presença de mutações no gene NPR2 em um grupo de pacientes com BEI e correlacionar os achados moleculares com o fenótipo dos pacientes e familiares. A região codificadora do gene NPR2 foi sequenciada pelo método de Sanger em 60 pacientes com diagnóstico de BEI. Foram identificadas cinco diferentes variantes alélicas missense em heterozigose no NPR2, cada uma em um único paciente. Essas variantes foram submetidas à análise funcional in vitro para avaliação da atividade da guanililciclase e microscopia confocal para localização intracelular dos receptores NPR-B. As variantes c.226T > C / p.Ser76Pro, c.788G > C / p.Arg263Pro e c.2455C > T / p.Arg819Cys segregam com o fenótipo de baixa estatura dentro das famílias e determinam um prejuízo funcional ao NPR-B. As três variantes geram proteínas que exercem efeito dominante negativo e os receptores NPR-B com as mutações p.Ser76Pro e p.Arg263Pro não se localizam na membrana celular. As variantes c.491C > G / p.Ala164Gly e c.1636A > T / p.Asn546Tyr não segregam com o fenótipo de baixa estatura nas famílias e não se evidenciou um efeito dominante negativo. O escore-Z da altura dos indivíduos carreadores das variantes funcionalmente deletérias variou de -4,5 a -1,7. Um dos pacientes e dois familiares apresentam desproporção corporal e um paciente tem metacarpos curtos. Como conclusão, mutações em heterozigose no gene NPR2 são causa de baixa estatura em 3 de 60 pacientes com diagnóstico inicial de BEI (5% da nossa casuística). Os indivíduos afetados têm graus variados de baixa estatura, sem um fenótipo característico / Over the past several years, C-type natriuretic peptide (CNP) and its receptor (NPR-B) system has emerged as an important regulator of endochondral bone growth. Animal models showed a CNP/NPR-B role in promoting chondrocyte proliferation and differentiation and matrix synthesis. Biallelic loss-of-function mutations in NPR-B gene (NPR2) cause acromesomelic dysplasia type Maroteux (AMDM), a skeletal dysplasia with extreme short stature. Relatives of patients with AMDM, heterozygous for NPR2 mutations, were noted to be shorter than expected for their population of origin, suggesting that heterozygous mutations in NPR2 could be a cause of idiopathic short stature (ISS). The objective of this study was to investigate the presence of NPR2 mutations in a group of patients with ISS and to correlate molecular findings with phenotype. The NPR2 coding region was sequenced by Sanger\'s method in 60 patients with ISS. Five different heterozygous missense variants in NPR2 were identified in five patients. The functional consequences of those variants were established using in vitro cell-based assay to determine guanylate cyclase activity and confocal microscopy to determine intracellular localization of NPR-B. The variants c.226T > C / p.Ser76Pro, c.788G > C / p.Arg263Pro and c.2455C > T / p.Arg819Cys segregated with short stature phenotype and were functionally deleterious. NPR-B receptors with these three variants have a dominantnegative effect and p.Ser76Pro and p.Arg263Pro NPR-B were not localized in the cell membrane. Cosegregation analysis of the variants c.491C > G / p.Ala164Gly and c.1636A > T / p.Asn546Tyr was inconclusive and they did not have a dominant negative effect. Carriers of functionally deleterious variants have a height SD score that ranged from -4.5 to -1.7. One of these patients and two relatives have disproportionate short stature and one has shortened metacarpal. In conclusion, heterozygous mutations in NPR2 gene are cause of short stature in 3 of 60 patients initially classified as ISS (5% of our cohort). Affected individuals have variable degrees of short stature without a distinct phenotype

Introdução: Crianças nascidas pequenas para a idade gestacional (PIG) apresentam maior risco de permanecerem com baixa estatura na vida adulta. Os fatores de crescimento insulino-símile tipo 1 e 2 (IGF-1 e IGF-2) são os principais fatores endócrinos determinantes do crescimento fetal. A maioria das ações conhecidas do IGF-1 e 2 é mediada via um receptor tirosina quinase, conhecido como IGF-1R. Recentemente, a insensibilidade ao IGF-1 foi identificada como uma das causas de retardo de crescimento em crianças nascidas PIG que não apresentaram recuperação espontânea do crescimento na vida pós-natal. Crianças afetadas apresentavam níveis elevados de IGF-1, IGFBP-3 além de microcefalia. O papel de defeitos pósreceptor na sinalização do IGF-1 como causa de retardo de crescimento pré e pós-natal ainda não foi investigado. Objetivo: Analisar in vitro a ação do IGF-1 em fibroblastos de crianças nascidas PIG. Material e métodos: Desenvolvemos cultura de fibroblastos de 2 controles (C1 e C2) e de 4 pacientes nascidos PIG (SGA1, SGA2, SGA3 e SGA4) com suspeita de insensibilidade ao IGF-1 por ausência de recuperação do crescimento na vida pós natal, resposta insatisfatória ao tratamento com hGH apesar de níveis normais/elevados de IGF-1. Foi confirmado do ponto de vista molecular que um dos pacientes (SGA1) apresenta Síndrome de Sílver- Russell com perda da metilação do alelo paterno da região ICR1 (imprinting center region 1) importante para a expressão do IGF-2. Defeitos no gene do IGF1 e IGF1R foram afastados por sequenciamento direto. As ações do IGF- 1 foram determinadas por ensaios de proliferação, análise da produção de IGFPB-3 em meio de cultura e estudos de fosforilação de proteínas da via de sinalização do IGF-1 em fibroblastos (AKT e ERK). Resultados: As linhagens SGA1, SGA2 e SGA3 proliferaram respectivamente 31%, 60% e 78% a menos sob estímulo de IGF-1 em relação ás linhagens controles. Já a linhagem SGA4 apresentou comportamento semelhante ás linhagens controles. No estudo da expressão do RNAm do IGF1R por PCR em tempo real, não foi observada diferença significativa na expressão do IGF1R nas diversas linhagens PIG em relação aos controles, assim como o conteúdo total da proteína IGF-1R. Em relação á ativação da via MAPK, todas as linhagens dos pacientes PIGs apresentaram menor fosforilação ERK1/2 basal e após estímulo com IGF-1, quando comparadas com as linhagens controles (p < 0.001) apesar do conteúdo total de ERK1/2 ser semelhante. Já em relação a ativação da via PI3K, as linhagens SGA1, SGA2, SGA3 e SGA4 não diferiram significantemente em relação aos fibroblastos controles quanto à ativação de AKT pelo IGF-1. O conteúdo total de AKT também foi semelhante em todas as linhagens estudadas. O estudo da expressão de IGFBP3 mostrou um aumento da expressão deste peptídeo na linhagem de fibroblastos do paciente SGA1 (14X). O conteúdo de IGFBP-3 intracelular não sofreu alteração, porém comprovamos que a linhagem SGA1 secretava 2x mais IGFBP-3 para o meio de cultura. Apesar de apresentarem estrutura, expressão e conteúdo de IGF1R normais, essas mesmas 3 linhagens celulares que apresentaram menor proliferação também apresentaram diminuição na fosforilação de ERK após tratamento com IGF-1. Mesmo sob o estímulo com desIGF-1 (um análogo do IGF-1 com baixa afinidade por IGFBPs mas que preserva sua capacidade de ativar o receptor IGF-1R) a ativação de ERK e a proliferação celular se manteve abaixo dos das linhagens controles. O estudo do conteúdo total de GRB10 foi semelhante em todas as linhagens celulares. Conclusão: Três dos 4 pacientes PIG estudados apresentaram insensibilidade pós-receptor ao IGF-1. A linhagem celular SGA1, obtida de um paciente com hipometilação do ICR1 11p15 causando SSR, demonstramos um aumento da expressão e secreção de IGFBP-3, o qual não se mostrou responsável por inibir a ação do IGF-1 nestes fibroblastos. Novos estudos devem ser desenvolvidos para identificar o defeito molecular responsável pela insensibilidade ao IGF-1 a nível pósreceptor observada nestes pacientes. / Introduction: Children born small for gestational age (SGA) have a higher risk of staying with short stature in adulthood. The insulin-like growth factors (IGF-1 and IGF-2) are the main endocrine factor determining fetal growth. Most of the known actions of IGFs are mediated by IGF-1R, a tyrosine kinase receptor. Recently, the IGF-1 insensitivity was identified causing growth retardation in children born SGA who who did not present spontaneous catch-up growth in postnatal life. Affected children had elevated IGF-1 and IGFBP-3 levels in addition to microcephaly. The role of post receptor defects in IGF-1 signaling on the deficit of growth is still unclear. Objective: To assess IGF-1 action and signaling in vitro in fibroblasts from SGA children. Methods: Fibroblasts cell cultures were developed from 2 controls (C1 and C2) and 4 patients with pre- and post-natal growth retardation (SGA1, SGA2, SGA3 and SGA4). IGF-1 insensitivity was demonstrated by severe pre and postnatal growth impairment without any evident cause, IGF1 SDS > 0 and poor growth response during high doses of hGH treatment. Three SGA patients presented microcephaly. Defects in the gene of the IGF1 and IGF1R were excluded by direct sequencing. One patient (SGA1) presents the Silver- Russell syndrome (SRS) with loss of methylation of the paternal allele in the ICR1 (imprinting center region 1) chromosome 11p15, important for IGF-2 expression. IGF-1 action was assessed by cell proliferation by colorimetric assay. IGF-1 signaling was assessed by AKT and ERK phosphorylation after IGF-1 stimulation through SDS-PAGE of intracellular extract followed by immunoblotting with specific antibodies. The expression of IGF1R and IGFBP3 gene was determined by Real-time quantitative PCR and the levels of the IGF-1R and IGBP-3 protein by direct immunoblotting. Results: The SGA1, SGA2 and SGA3 cell lines proliferated 31%, 60% and 78% less under IGF-1 stimulation in comparison of controls fibroblasts, respectively. The expression of IGF1R mRNA and the level of total amount of IGF-1R protein were similar in all SGA and control cell lines. Despite normal IGF-1R structure and quantity, the same 3 SGA cell lines that presented low proliferation response also had 50 to 85% lower ERK phosphorylation after IGF-1 treatment (p <0.001), although the similar total content of ERK1/2. In relation to PI3K pathway activation, all SGA cell cultures presented normal AKT phosphorilation. Fibroblasts from the SGA1 patient presented a 14x increase in IGFBP3 mRNA and 2x more IGFBP-3 secretion to culture serum medium. Treatment with desIGF-1, an IGF-1 analogue with low affinity for IGFBPs although retains its ability to activate the IGF-1R, did not recover cell proliferation or ERK phosphorylation. All cell lines presented similar amount of GRB10 protein Conclusion: Three of 4 SGA patients showed evidence of post-receptor IGF-1 insensitivity. The cell line SGA1, obtained from a SRS patient with ICR1 hypomethylation, showed increased expression and secretion of IGFBP-3, which was not directly responsible for inhibition in IGF- 1 action. Further studies should be developed to identify the molecular cause of IGF-1 post-receptor insensitivity observed in our patients.

A ghrelina, hormônio secretado principalmente por células gástricas, liga-se ao seu receptor, o receptor de secretagogo de GH (GHSR - Growth hormone secretagogue receptor), localizado no hipotálamo e na hipófise, estimulando a síntese e secreção do GH. Recentemente foram identificadas mutações no gene GHSR em crianças com baixa estatura idiopática (BEI) e com deficiência isolada de GH (DGH). No presente estudo investigamos a presença de mutações no gene GHSR em crianças com DGH isolada de causa não identificada e crianças com BEI, incluindo um subgrupo de crianças com atraso constitucional de crescimento e desenvolvimento (ACCD). Foram selecionados 14 pacientes com deficiência isolada de GH sem alterações anatômicas da região hipotálamo-hipofisária e 96 pacientes com BEI, destes 31 (32%) apresentavam ACCD. Também foram estudados 150 controles adultos e 197 crianças controle com crescimento e puberdade normais. A região codificadora do GHSR foi amplificada utilizando-se oligonucleotídeos iniciadores específicos, seguida de purificação enzimática e seqüenciamento automático. Encontramos 6 variantes alélicas em heterozigose no GHSR: nenhuma delas presente nos controles estudados, e quatro destas variantes estão localizadas em regiões conservadas do gene. Uma variante foi encontrada em uma paciente do grupo DGH (p.Val249Leu) e as outras cinco (c.-6 G>C, p.Ser84Ile, p.Val182Ala, p.Ala169Thr e p.Ala358Thr) foram encontradas em pacientes do subgrupo ACCD do grupo BEI. As variantes missense foram submetidas a estudo funcional que evidenciou que as mutações p.Ser84Ile e p.Val182Ala possuem diminuição na atividade basal associadas à diminuição da expressão do receptor na superfície celular. Adicionalmente, a mutação p.Ser84Ile também apresenta redução na atividade do GHSR induzida pelo ligante. A variante p.Val249Leu foi encontrada em uma paciente do sexo feminino com diagnóstico de DGH isolado. A falta de segregação familiar associada à ausência de déficit funcional da variante nos estudos in vitro sugere que, neste caso, a variante p.Val249Leu não é a causa do fenótipo de DGH nesta família e trata-se de uma variante alélica rara. As 5 variantes alélicas no GHSR (c.-6 G>C, p.Ser84Ile, p.Val182Ala, p.Ala169Thr e p.Ala358Thr) encontradas nos pacientes com BEI foram identificadas apenas naqueles com puberdade atrasada, ou seja, pertencentes ao subgrupo ACCD (3 do sexo masculino e 2 do sexo feminino). A freqüência de variantes neste grupo de pacientes foi de 16%, significativamente maior que nos outros grupos, e a ausência de variantes gênicas novas no grupo de crianças obesas com altura normal e mesmo no grupo de crianças com BEI sem ACCD sugere que nosso achado não foi casual e que as alterações descritas podem estar associadas ao fenótipo de ACCD. Os estudos in vitro mostraram prejuízos funcionais em 2 destas variantes (p.Ser84Ile e p.Val182Ala) porém, devido à limitação dos estudos funcionais (celulas heterólogas) não podemos afastar que as demais não tenham algum impacto funcional in vivo. Em conclusão, nossos resultados sugerem um envolvimento dos defeitos no GHSR na etiologia do atraso constitucional do crescimento e desenvolvimento em uma parcela de pacientes com esta condição / Ghrelin, hormone secreted by gastric cells, stimulates growth hormone secretion by acting on its receptor GHSR, located in the hypothalamus and pituitary. Recently, mutations in the GHSR gene were described in patients with growth hormone deficiency (GHD) and idiopathic short stature (ISS). In the present study we analyzed the GHSR gene in patients with isolated GHD and patients with ISS, including a subgroup of patients with constitutional delay of growth and puberty (CDGP). We studied 14 GHD patients with normal pituitary magnetic resonance imaging and 96 patients with ISS, 31 of them with CDGP. We also studied 150 adults and in 197 children with normal stature. The entire coding region as well as the exon-intron boundaries of GHSR were PCR amplified in all patients and control group and PCR products were bidirectionally sequenced. Six different heterozygous variants in GHSR were identified: none of them were found in the control group and four of these amino acid substitutions occurred at a conserved position within the GHSR. One variant (p.Val249Leu) was found in a GHD patient and the other five (c.-6 G>C, p.Ser84Ile, p.Val182Ala, p.Ala169Thr e p.Ala358Thr) were found in patients with CDGP. The missense variants were submitted to functional studies. Two of these variants (p.Ser84Ile and p.Val182Ala) result in a decrease in basal activity that was in part explained by a reduction in cell surface expression. The p.Ser84Ile mutation was also associated with a defect in ghrelin potency. The p.Val249Leu variant, found in a female patient with isolated GHD, did not segregate with the phenotype in the family and had no functional impairment in vitro. This suggests that p.Val249Leu is not the cause of the GHD in the family and may be a rare allelic variant. The other variants (c.-6 G>C, p.Ser84Ile, p.Val182Ala, p.Ala169Thr e p.Ala358Thr) were identified only in patients with CDGP (3 male and 2 female). The frequency of allelic variants observed in this group (16%) was higher than expected by chance in contrast with ISS and GHD children, and the absence of other GHSR mutations in the large group of control children suggests that the association between GHSR mutations and CDGP phenotype is unlikely to be fortuitous. Functional studies revealed that two of the identified missense variants (p.Ser84Ile and p.Val182Ala) are functionally significant. These functional studies were performed in heterologous cell expression systems; therefore it is not possible to completely rule out that the other identified variants might cause some unrevealed impairment on GHSR function or expression in vivo. In conclusion, our data raise the possibility that abnormalities in ghrelin receptor function may be implicated in the ethiology of CDGP in some patients

As doenças que comprometem o crescimento humano apresentam uma forte influência genética. O objetivo geral do projeto atual é desenvolver e aplicar a tecnologia de sequenciamento paralelo em larga escala para compreensão desses distúrbios de crescimento, com foco principal em crianças nascidas pequenas para idade gestacional (PIG), definida como criança com Escore-Z de comprimento e/ou peso ao nascimento menor ou igual a -2. PIG é uma condição heterogênea, que inclui como causa fatores maternos, placentários e fetal, dentre o qual, destacam-se as alterações genéticas. Crianças nascidas PIG e que não recuperaram seu déficit estatural espontaneamente nos primeiros anos de vida apresentam uma alta probabilidade de serem adultos baixos e costumam evoluir com quadros clínicos complexos, envolvendo retardo de crescimento persistente na vida pós-natal, dismorfismos, anomalias congênitas e distúrbios de desenvolvimento neuropsicomotor. Foi utilizada a tecnologia de sequenciamento Sure Select (Agilent Technologies, CA, USA) para estudar aproximadamente 390 genes escolhidos por pertencerem à via IGFs/IGF1R, principal eixo regulador hormonal do crescimento, genes sabidamente envolvidos em doenças associadas com distúrbio de crescimento, além de genes candidatos identificados em estudos prévios do laboratório, associados à regulação do crescimento, em um grande número de pacientes. Foram sequenciados 80 pacientes, obtendo uma cobertura média de 354 vezes e com mais de 99% da região alvo com cobertura > 10 reads. Nestas amostras foram identificadas 58 variantes, 18 consideradas patogênicas ou provavelmente patogênicas em 19 pacientes, 32 de significado incerto, 7 provavelmente benigna e 1 provavelmente patogênica para condição não associada a distúrbio de crescimento (\"achado acidental\"). Dentre as variantes consideradas patogênicas ou provavelmente patogênicas houve uma grande heterogeneidade entre os genes, sendo identificadas variantes nos genes PTPN11 (x3), BLM (x3), NPR2 (x2), ANKRD11 (x2), SRCAP (x2), FGFR3 (x2), IGF1R, SHOC2, SHOX, NIPBL e deleção 22q11. Podemos concluir que a técnica de sequenciamento paralelo em larga escala de genes alvo é eficiente em estabelecer o diagnóstico molecular de crianças nascidas PIG. Foi possível identificar a etiologia genética em 23,75% da casuística estudada, em sua maior parte, de pacientes com síndromes reconhecidas clinicamente. Contudo, defeitos no sistema IGFs/IGF1R não foram frequentes nesta condição / Diseases affecting human growth are most likely caused by genetic factors. The main goal of this project is to apply the technology of massive parallel sequencing to comprehend growth disturbs in children born small for gestational age (SGA), known as the children with Z-score of height and/or weight at birth less or equal -2. SGA is a heterogeneous condition, and as its causes we can find maternal, placental and fetal factors, of which, the most important are the genetic alterations. Children born SGA that do not have catch-up growth spontaneously up to the second year of life may remain with short stature when adults and they usually present other clinical features, such as dimorphisms, congenital anomalies and neuropsychomotor developmental delay. We used the Sure Select technology (Agilent Technologies, CA, USA) to study approximately 390 genes chosen by participate of the IGFs/IGF1R system, or genes already associated with growth disorders, or candidate genes found in previous studies of aCGH (Array Comparative Genomic Hybridization) or exome sequencing. We sequenced 80 patients, and had a mean coverage of 354x, with more than 99% of the target region with > 10 reads. We found 58 variants, 18 classified as pathogenic or probably pathogenic in 19 patients, 32 variants of unknown significance and 7 probably benign and 1 probably pathogenic for a condition non associated to short stature (``incidental finding``) Among the probably pathogenic and pathogenic we found a great heterogeneity in genes, with variants identified in 10 different genes PTPN11 (x3), BLM (x3), NPR2 (x2), ANKRD11 (x2), SRCAP (x2), FGFR3 (x2), IGF1R, SHOC2, SHOX, NIPBL and a 22q11 deletion. In conclusion, the technique of targeted gene panel sequencing is a useful tool to establish the molecular diagnose in children SGA. We could identify the molecular cause in 23.75% of the casuistic, mostly patients with clinically recognized syndromes. However, variants at IGFs/IGF1R system are not frequently associated with the studied condition