El busulfán a dosis altas es un importante componente de los regímenes de acondicionamiento previo trasplante de progenitores hematopoyéticos. Múltiples estudios han indicado que el busulfán tanto oral como IV presenta una amplia variación en su comportamiento farmacocinético, tanto inter como intraindividual. La individualización posológica a través de programas de monitorización farmacocinética han demostrado reducción de la toxicidad y mejoras en los resultados. La mayoría de estos estudios se han realizado en población pediátrica y utilizando el busulfán en asociación con ciclofosfamida. Pero hay dos poblaciones de pacientes específicas hasta ahora no estudiadas en la literatura: 1) población adulta con mieloma múltiple que recibe busulfán asociado a melfalán en regímenes de intensificación y posterior trasplante autólogo de progenitores hematopoyéticos (población MM) y; 2) población adulta que recibe busulfán asociado a fludarabina en un contexto de régimen de acondicionamiento para un trasplante de intensidad reducida (población AloTIR). Los objetivos del presente trabajo son en estas dos poblaciones de pacientes específicas: 1) estudiar la caracterización farmacocinética individual de cada paciente, a través de un método de regresión no lineal; 2) analizar la toxicidad y la efectividad del tratamiento y su relación con la exposición a busulfán; y 3) caracterizar el comportamiento farmacocinético poblacional de busulfán, identificando y cuantificando la variabilidad observada, y validar el modelo farmacocinético. Se estimaron los parámetros farmacocinéticos individuales de busulfán para cada paciente tras la primera dosis y las dosis posteriores se ajustaron según exposición diana. Se recogió la toxicidad relacionado con el procedimiento según criterios estándar, incluyendo enfermedad veno-oclusiva hepática (EVOH) y enfermedad del injerto contra el huésped. Se analizaron los datos de concentración-tiempo mediante el modelo de efectos mixtos no lineales implementado en el programa NONMEM v.7.3. y aplicando la estrategia de tres etapas. Se realizó una validación tanto interna como externa de los modelos desarrollados para la población de MM y para la población de AloTIR. A la dosis considerada estándar, el 55% de la población MM y el 50% de la población AloTIR tuvieron una exposición tras la primera dosis por encima de la definida como diana y por lo tanto requirieron reducción de la dosis. Ningún paciente desarrolló EVOH. Se observó una relación entre la gravedad de la mucositis y la exposición a busulfán estimada en la población MM. Los datos fueron adecuadamente descritos a través de un modelo monocompartimental caracterizado por aclaramiento plasmático (Cl/F), volumen aparente de distribución (V/F) y constante de absorción (Ka/F). En la población MM se observa la existencia de una influencia significativa de la edad en el aclaramiento plasmático de busulfán y del peso y del sexo en el volumen aparente de distribución. Los resultados en la población AloTIR muestran que el peso influía tanto en el aclaramiento plasmático como en el volumen aparente de distribución. Con los datos procedentes de nuevos pacientes en ambos modelos farmacocinéticos, se observó una precisión y exactitud de 14,9% y 17,6% respectivamente en la población MM y 5,6% y 11,8% en la población AloTIR. En conclusión, los resultados del presente trabajo muestran que hay una amplia variabilidad en el comportamiento PK de busulfán en estas dos poblaciones de pacientes onco-hematológicos (población MM y AloTIR) y que la edad, el peso y el sexo influyen en los prámetros PK. Una adecuada precisión y exactitud de los modelos corrobora su utilidad futura en la práctica clínica con la optimización de la dosis mediante monitorización farmacocinética. / High-dose busulfan is an important component of many hematopoietic stem cell transplantation (SCT) preparative regimens. Studies of oral and IV busulfan indicate wide intrapatient and interpatient variations in pharmacokinetic (PK) behavior and the relationship between busulfan systemic exposure and clinical outcome. Dose adjustment of busulfan based on therapeutic drug monitoring has been shown to reduce toxicity and improves outcome. The majority of these studies are in pediatric population and using busulfan with cyclophosphamide regimen. There are no data regarding pharmacokinetics of busulfan used in two onco-hematology populations: 1) multiple myeloma (MM) patients in first response after front-line chemotherapy that receive the combination of busulfan and melphalan (BUMEL) previous autologous stem cell transplantation (MM population); and 2) reduced intensity conditioning (RIC) allogeneic blood stem cell transplantation with fludarabine and busulphan population (RIC population). The goal of this study was in these two onco-hematology populations: 1) to assess the individual busulfan PK behavior (by nonlineal regression); 2) to analyze the toxicity and effectiveness and their relationship with busulfan systemic exposure and finally 3) to build a population pharmacokinetic model to characterize the population PK parameters, investigating and to quantifing the variability, and to validate the final model. Busulfan pharmacokinetic parameters were estimated for each patient after the first dose based on measured concentrations and subsequent doses were modified as necessary to achieve target exposure. Regimen-related toxicity was analyzed including the diagnosis of hepatic veno-occlussive disease (HVOD) and graft-versus-host disease in RIC population, based on standard criteria. All plasma serum drug concentrations –intensive or sparse samples- vs. time data were analyzed on the basis of the population approach using the non-linear mixed-effect program NONMEM v7.3 and applying the three step strategy. An internal and external validation of the population PK model was performed. Fifty-five patients (55%) of MM population and 50% patient of RIC population at initial dosage required dose adjustment. None of the patients developed HVOD. The severity of mucositis increased with increasing average steady-state busulfan plasma concentration in MM population. A one-compartment PK model characterized by clearance (CL/F), apparent volume of distribution (V/F) and absorption rate constant (Ka/F) with first order absorption and elimination, adequately described the data. In MM population, age significantly influenced busulfan clearance (CL/F) and volume of distribution (V/F) was affected by weight and gender, and in RIC population weight influenced busulfan CL/F and V/F. In a new data set with new patients, bias and precision of the individual predictions resulted in mean values of 14,9% and 17,6%, respectively in MM population and 5,6% and 11,8% in RIC population. In conclusion, the results of the present study show that there are wide variations in PK behavior in two onco-hematology populations (MM and RIC populations) and age, weight and gender influenced PK parameters. The results from predictive accuracy and precision show the usefulness of these models for implementation in a TDM program in the near future in our hospitals.

En el presente trabajo, pranoprofeno (PF) fue asociado a nanopartículas (NPs) poliméricas de ácido poli-láctico-co-glicólico (PLGA), preparadas por la técnica de desplazamiento del disolvente. Las PF-NPs fueron optimizadas usando un diseño factorial. Las formulaciones optimizadas fueron aquellas que se prepararon con un pH de la fase acuosa de 4.5 ó 5.5; una concentración de PF de 1.0 ó 1.50 mg/mL; tensoactivo 5 ó 10 mg/mL y PLGA 9.0 ó 9.5 mg/mL. En estas condiciones experimentales, las PF-NPs optimizadas (PF-F1NPs y PF-F2NPs) mostraron un tamaño de partícula apropiado para la administración ocular y/o dérmica (alrededor de 350 nm) y una alta eficiencia de encapsulación del fármaco en el polimero (80%). Para asegurar la estabilidad de las PF-NPs durante un largo período de almacenamiento las formulaciones optimizadas fueron sometidas a un proceso de liofilización. Las características fisicoquímicas de las PF-NPs antes y después de liofilizar fueron similares entre sí. Las interacciones fármaco – polímero fueron evaluadas a través de difracción de rayos X, mediciones espectrales FTIR y análisis de DSC. Los resultados obtenidos sugieren la ausencia de interacciones químicas y confirman que el fármaco se dispersó en el interior de la matriz polimérica. Las PF-NPs optimizadas fueron incorporadas en un hidrogel de Carbómero (HG_PF-F1NPs y HG_PF-F2NPs) o hydrogel en presencia de un 1% ó 3% de azona (HG_PF-F1NPs-Azona y HG_PF-F2NPs-Azona), con la finalidad de obtener formulaciones semisólidas que permitan prologar el tiempo de contacto del fármaco en la superficie ocular y/o dérmica, incrementar la retención del fármaco y aumentar la eficacia analgésica y antiinflamatoria de PF. El análisis morfológico de las PF-NPs incorporadas en el hidrogel mostro que el diámetro de partícula fue similar al observado para las PF-NPs en suspensión. La evaluación del perfil de liberación in vitro de PF reveló que las formulaciones PF-NPs, HG_PF-NPs y HG_PF-NPs-Azona exhiben una liberación sostenida del fármaco comparado con la solución de fármaco libre. Por otra parte, los resultados obtenidos a partir de los ensayos de permeación transcorneal ex vivo y eficacia antiinflamatoria in vivo pone de manifiesto que las formulaciones de HG_PF-NPs-Azona (azona 1% p/p) pueden ser un sistema más efectivo y apropiado en el tratamiento del edema ocular. Adicionalmente, estas formulaciones mostraron una tolerancia ocular óptima por el método HET-CAM y el test de Draize. Los resultados observados a partir de la permeación transdérmica ex vivo y la eficacia antiinflamatoria in vivo de PF sugieren que la aplicación dérmica de la formulación HG_PF-F2NPs puede ser un sistema más apropiado para tratar el edema de la superficie de la piel, respecto al resto de formulaciones ensayadas. Ningún signo de irritación fue detectado tras la aplicación démica de las formulaciones semisólidas de PF en ausencia o en presencia de un 3% de azona. / In the present work, pranoprofen (PF)-loaded poly (lactic-co-glycolic) acid (PLGA) nanoparticles (NPs) were prepared and optimized by the solvent displacement technique. The optimized formulations were those prepared at aqueous phase pH values of 4.5 and 5.5, PF concentrations of 1.0 and 1.5 mg/mL, surfactant concentration of 5.0 and 10 mg/mL and PLGA concentration of 9.00 and 9.50 mg/mL. Under these conditions, the optimized NPs (PF-F1NPs y PF-F2NPs) showed a size appropriate particle size for topical administration (350 nm) and high entrapment efficiency (80%). Lyophilization assays was performed to ensure the long- term stability of these systems. The physicochemical properties of the NPs before and after freeze-drying were similar between them. The evaluation of the interactions between the drug and the polymer revealed that there is no evidence of any chemical interaction. The optimized PF-NPs formulations were incorporated into Carbomer hydrogel (HG_PF-F1NPs and HG_PF-F2NPs) or hydrogel with 1% or 3% azone (HG_PF-F1NPs-Azone and HG_PF-F2NPs-Azone), in order to obtain semisolid formulations that prolonging the contact of the PF with the eye or skin. The morphological analysis of the PF-NPs after incorporated into hydrogel revealed that the diameter of particle was similar to those of the NPs suspension. The in vitro release assay of PF from PF-NPs, HG_PF-NPs and HG_PF-NPs-Azone formulations revealed that these formulations exhibited sustained release behaviour with a slower release of PF compared to the free drug solution. The results obtained from the ex vivo corneal permeation and in vivo anti-inflammatory efficacy suggest that the ocular application of the semisolid formulations with a 1% azone could be appropriate in the treatment ocular oedema. In addition, these formulations showed an optimal ocular tolerance by HET-CAM method and Draize test. Otherwise, the results observed from the ex vivo transdermal permeation and in vivo anti-inflammatory efficacy assays of the PF indicate that the administration of the HG_PF-F2NPs may be more effective in the treatment of edema on the skin surface respect to the others formulations. No signs of skin irritancy were detected for all the semisolid formulations without or with a 3% azone.

Des dels anys seixanta, la farmacovigilància s’ha basat en la notificació de casos. Des dels vuitanta, els estudis observacionals han identificat nous efectes adversos de medicaments amb fort impacte de salut pública, i n’han quantificat el risc. Des dels 2000, els assaigs clínics i les metanàlisis també han contribuït de manera significativa al descobriment i avaluació del risc d’efectes indesitjats relativament freqüents. El Butlletí Groc s’ha fet ressò de les novetats esdevingudes durant 30 anys en l’estudi dels efectes adversos dels medicaments i el seu impacte sobre la salut pública, i pot ser un observatori del que s’ha descobert, ha preocupat i ha estat motiu de polèmiques. L’objectiu d’aquest treball és examinar l’evolució dels mètodes, els fàrmacs i les patologies de més interès en farmacovigilància a través dels articles publicats al Butlletí Groc en un període de 23 anys. Els articles publicats a Butlletí Groc entre 1988 i 2011 es van classificar en cinc categories i se’n van seleccionar els relatius a toxicitat, per analitzar els fàrmacs i els grups terapèutics implicats (segons l’ATC) i els efectes adversos (segons MedDRA). Les reaccions adverses implicades en els problemes de seguretat d’un fàrmac o grup de fàrmacs van ser classificades segons el mecanisme d’acció (A o B) i el mètode emprat per identificar-les. Dels medicaments retirats a Espanya de 1982 a 2013 per inseguretat, també es van avaluar els fàrmacs i les reaccions adverses implicades, així com el tipus de reacció, el mètode identificat i el temps de comercialització. De 244 articles publicats a Butlletí Groc en el període 1988-2011, 184 van tractar sobre inseguretat de medicaments. Dels 116 seleccionats, 132 feien referència a problemes de seguretat d’un fàrmac o grup de fàrmacs. Els principals grups de fàrmacs implicats van ser d’acció sobre el sistema nerviós, cardiovascular, AINE i altres sobre el sistema musculoesquelètic, fàrmacs actius sobre l’aparell digestiu i el metabolisme, i antiinfecciosos sistèmics. Les principals reaccions adverses van ser hepatobiliars, cardiovasculars, psiquiàtriques i neurològiques. La meitat de les reaccions adverses descrites van ser de tipus A, i l’altra meitat de tipus B, però les patologies han canviat amb el temps, de manera que ha augmentat l’interès pels efectes adversos de tipus A, a expenses dels de tipus B. Paral·lelament, han canviat els mètodes d’identificació i avaluació de la relació causal de la reacció adversa amb l’exposició al medicament, de manera que els estudis observacionals, assaigs clínics i metanàlisis han substituït en part les notificacions i les sèries de casos. La proporció de fàrmacs amb valor intrínsec nul o inacceptable s’ha reduït a partir dels anys noranta. L’anàlisi dels fàrmacs retirats a Espanya entre 1982 i 2013 revela que els principals grups terapèutics implicats van ser els actius sobre el sistema locomotor, nerviós, cardiovascular i digestiu. Els principals subgrups van ser AINE, fàrmacs per a l’obesitat, antidepressius i vasodilatadors. Durant els 30 anys d’observació, el temps transcorregut entre la comercialització i la retirada d’un fàrmac per motius d’inseguretat s’ha allargat, d’uns 8 anys entre 1982-99 al doble entre 2000-03. Les reaccions adverses més freqüents han estat hepàtiques, cardiovasculars i neuropsiquiàtriques. L’hepatotoxicitat ha estat la principal causa de retirades de medicaments durant tot el període d’estudi, però a partir del 2000 les reaccions cardiovasculars són les causes més freqüents. Els motius principals de preocupació han evolucionat des de les reaccions adverses rares i més greus de tipus B, a les de tipus A, de més incidència sobre la salut pública. Els mètodes emprats per decidir retirar un medicament també han evolucionat des de les sèries de casos els primer anys fins als estudis observacionals i les metanàlisis d’assaigs clínics, com a principals generadors de senyals i de quantificació de riscos. / In the 1960’s, pharmacovigilance was mainly based on case reports. Since the 1980’s, observational studies helped to identify new adverse drug reactions which have a big impact on public health, and they have also quantified their risk. Since 2000, clinical trials and meta-analysis have also contributed significantly to the discovery and evaluation of the risk of relatively frequent adverse effects. In the last 30 years, Butlletí Groc has reported on all the news regarding s adverse drug effects and their impact on public health, and through this magazine we can learn about the discoveries, concerns and controversies. The aim of this study is to examine the evolution of methods, drugs and diseases of interest in pharmacovigilance looking at articles published in Butlletí Groc over a period of 23 years. The articles published in Butlletí Groc from 1988 to 2011 were classified into five categories. Those related to toxicity were selected to analyze drugs and therapeutic groups involved (according to ATC) and adverse effects (according to MedDRA). Adverse reactions related to safety problems of a drug or group of drugs were classified according to the mechanism of action (type-A or type-B) and the method used to identify them. Of the drugs withdrawn from the market in Spain from 1982 to 2013 due to safety reasons, drugs and adverse reactions involved were also evaluated, as well as the type of reaction, the method identified, and time to market. Among 244 articles published in Butlletí Groc between 1988 and 2011, 184 dealt with drug toxicity. Of the 116 selected, 132 were concerned with safety problems of a drug or group of drugs. The main groups of drugs involved were those active on the nervous system, cardiovascular, NSAIDs and others active on the musculoskeletal system, active drugs on the digestive system and metabolism, and systemic anti-infectives. The main adverse reactions led to hepatobiliary, cardiovascular, psychiatric and neurological diseases. Half of the adverse reactions were described as type-A, and half type-B, but the diseases have changed over time, so there has been increasing interest in the effects of type-A, at the expense of type-B. Meanwhile, the methods of identification and assessment of adverse reaction causal relationship with exposure to the drug have changed, so that observational studies, clinical trials and meta-analysis have partly replaced reporting and case series. The proportion of drugs with no intrinsic value or described as unacceptable has fallen since the 1990’s. The analysis of the drugs withdrawn in Spain from 1982 to 2013 reveals that the main therapeutic groups involved were those active on the musculoskeletal, nervous, cardiovascular, and digestive systems. The main subgroups were NSAIDs, drugs for obesity, anti-depressants, and vasodilators. During 30 years of observation, the time between the marketing and the withdrawal of a drug for safety reasons has lengthened rising, from 8 years between 1982 and 99 to double the length of time between 2000 and 2003. The most frequent adverse reactions were hepatic, cardiovascular, and neuropsychiatric. Hepatotoxicity has been the main cause of drug withdrawals during the whole study period, but since 2000 cardiovascular reactions are the most common causes. The main reasons for concern have evolved from being worried about rare and severe adverse reactions type-B to worries in type-A, which are more frequent and have more impact on public health. The methods used in deciding to withdraw a drug have also evolved since the case series in the early years to using observational studies and meta-analysis of clinical trials, which are mainly used to detect problems and quantify risks.

Ozenoxacino es una quinolona no fluorada desarrollada como una crema al 1% para el tratamiento tópico del impétigo en adultos y niños (a partir de 2 meses de edad). Ozenoxacino ha demostrado una potente actividad antibacteriana contra diferentes patógenos involucrados en infecciones bacterianas agudas de la piel y estructuras cutáneas. Los estudios de desarrollo preclínico han demostrado que ozenoxacino muestran un amplio margen de seguridad, falta de efectos adversos generalmente asociados con quinolonas fluoradas, (como fototoxicidad, fotoalergia, potencial de sensibilización y toxicidad de tendones y articulaciones) y un bajo potencial de absorción. El desarrollo clínico ha incluido diferentes ensayos clínicos con el fin de evaluar la absorción, seguridad, tolerabilidad y eficacia de aplicaciones tópicas de ozenoxacino. En estos estudios, ozenoxacino ha sido evaluado en diferentes condiciones (diferentes formulaciones, concentraciones, regímenes de administración, duraciones de tratamiento, extensiones de la piel y condiciones de la piel) en voluntarios sanos y en pacientes adultos con lesiones traumáticas secundariamente infectadas, y en pacientes pediátricos y adultos con impétigo. El presente trabajo doctoral incluye los siguientes estudios llevados a cabo para evaluar específicamente la absorción, la seguridad y la tolerabilidad de aplicaciones tópicas de ozenoxacino: • In-vitro percutaneous absorption and metabolism studies. • Systemic bioavailability, safety and tolerability studies. • Skin tissue exposure study. • Dermal tolerability studies. • Systemic bioavailability and safety in impetigo. Estos estudios han sido incluidos en diferentes publicaciones que se presentan y discuten en este trabajo de doctorado. Este trabajo incluye además, una breve revisión de quinolonas, infecciones agudas bacterianas de la piel y estructuras cutáneas, antibióticos tópicos, fármacos en desarrollo para infecciones dermatológicas y ozenoxacino. / Ozenoxacin is a non-fluorinated quinolone currently developed as a 1% cream for the topical treatment impetigo in adults and children (aged 2 months and older). Ozenoxacin has demonstrated a potent antibacterial activity against different pathogens involved in acute bacterial skin and skin structure infections. Preclinical development studies have demonstrated that ozenoxacin show a broad safety margin, a lack of adverse effects usually related to fluorinated quinolones (such as phototoxicity, photoallergenic, sensitizing potential, and tendon and articular toxicity), and a low potential of absorption. The clinical development of ozenoxacin has included different clinical trials to evaluate the absorption, safety, tolerability, and efficacy of topical applications of ozenoxacin. In these studies ozenoxacin has been evaluated under different conditions (different formulations, concentrations, administration regimens, treatment durations, skin extensions and skin conditions) in healthy volunteers and in adult patients with secondarily infected traumatic lesions, and in pediatric and adult patients with impetigo. The present PhD work includes the following clinical studies conducted specifically to evaluate the absorption, safety, and tolerability of ozenoxacin: • In-vitro percutaneous absorption and metabolism studies. • Systemic bioavailability, safety and tolerability studies. • Skin tissue exposure study. • Dermal tolerability studies. • Systemic bioavailability and safety in impetigo. These studies have been published in different papers that are presented and discussed in this PhD work. This work includes as well, a brief review of quinolones, acute bacterial skin and skin structure infections, topical antibiotics, drugs in development for dermatological infections, and ozenoxacin.

En Mozambique, las cabras son una importante fuente de proteína e ingresos para las familias rurales. Los caprinos presentan con mucha frecuencia infecciones por parásitos y estas suponen la mayor causa de mortalidad y morbilidad, provocando importantes problemas en la producción. Una de las enfermedades más frecuentes es la cenurosis, causada por Coenurus cerebralis, la forma larval de Taenia multiceps. No hay datos científicos sobre la caracterización molecular de la T. multiceps en África. El uso del albendazol (ABZ) puede ser una alternativa para el tratamiento de C. cerebralis. El conocimiento de los factores relacionados con farmacocinética del ABZ en cabras es un factor importante para poder valorar su eficacia terapéutica en el tratamiento como antihelmíntico frente a la forma larval de T. multiceps. Teniendo en cuenta estas premisas, el estudio se centró en la caracterización del parásito y en la caracterización de la cinética del ABZ en el tratamiento de cabras sanas o parasitadas experimentalmente. Una alta prevalencia de diferentes parásitos fueron encontrados en estas cabras cuando fueron sacrificadas en el matadero de Tete. Se analizaron los datos correspondientes a la prevalencia, tasa de infección, localización y tamaño de los quistes presentes en las cabras con infecciones naturales. La caracterización molecular mostró las secuencias genéticas de T. multiceps y no se observaran diferencias significativas entre los quistes cerebrales y no cerebrales. Los resultados de los anticuerpos y del antígeno están de acuerdo con trabajos previos en los que se puso de relieve la dificultad de desarrollar imunosensayos de uso práctico basados en antígenos crudos o fraccionados por electroforesis de sodio dodecil sulfato en gel de poliacrilamida. En las cinéticas plasmáticas obtenidas de los estudios en cabras sanas, se observaron diferencias, en sus perfiles cinéticos, entre animales jóvenes y adultos, pero no se encontraron diferencias entre machos y hembras. Los parámetros cinéticos obtenidos para los metabolitos del ABZ, albendazol sulfoxido (ABZSO) y albendazol sulfona (ABZSO2), en cabras infectadas cuando fueron tratadas con 10 o 20 mg/kg del ABZ, han puesto en evidencia diferencias estadísticamente significativas de la concentración plasmática máxima Cmax, del tiempo al cual se obtiene la Cmax (Tmax), del área bajo la curva (AUC), y del tiempo medio de residencia (MRT) entre ambas dosis. Cuando se compararon las cinéticas en cabras sanas con las de infectadas, tras la administración de la misma dosis (10 mg/kg of ABZ), se pudo observar que la Cmax y AUC eran menores en las cabras infectadas. Esto sugiere que los quistes T. multiceps causan cambios fisiopatológicos que podrían haber alterado la cinética del ABZ y sus metabolitos. Tras la administración de una dosis múltiple del ABZ a cabras infectadas (3x10mg/kg), se observó que durante las primeras 24h, el ABZSO apareció antes y en concentraciones mayores que el ABZSO2, no obstante 48 horas más tarde, las concentraciones plasmáticas del ABZSO2 fueron superiores que las del ABZSO. Esto sugiere que el ABZ podría haber inducido el paso metabólico del ABZSO a ABZSO2. Dos meses después de la infección experimental de cabras con T. multiceps, se pudo observar que el tratamiento con ABZ daba una mortalidad de los quistes con una eficacia frente a los controles, del 90.3%, 72.7% y 73.9% según las cabras hubieran recibido una dosis de 10mg/kg/24 durante 3 días, una dosis única de10mg/kg o 20mg/kg. Cinco meses después de la infección no se observaron diferencias en la viabilidad de los quistes entre el grupo de control y el tratado. Se podría concluir que el ABZ es efectivo en el tratamiento de quistes en las cabras, localizado en los tejidos externos del cerebro, dos meses después de la infección del T. multiceps. / In Mozambique, goats are an important protein source and a major form of income for rural families. Goats are seriously affected by parasitic infections which are a major cause of morbidity and mortality and are considered to be an important constraint to goat production. One of these parasitic diseases is coenurosis, caused by Coenurus cerebralis, the larval stage of Taenia multiceps. Coenurosis is a common disease of the central nervous system of ruminants, rarely found in humans. There are no reports on the molecular characterization of T. multiceps from Africa. The use of albendazole (ABZ) could be an alternative for C. cerebralis treatment. Understanding the factors related to the pharmacokinetic behaviour of albendazole in goats is very important to maximize the broad-spectrum anthelmintic activity. In this context, the study focused on the parasite and albendazole in goats. Regarding Taenia multiceps, aspects related to its occurrence in natural conditions and the morphological and molecular characteristics in goats were studied. Moreover, the pharmacokinetics of albendazole in simple and multiple doses in goats that were healthy and infected with T. multiceps were described and the efficacy of albendazole in those experimental infections was assessed. A high prevalence of different parasites was found in goats slaughtered at Tete Municipal Abattoir. Prevalence, infection rates, cyst localization and size at natural and experimental infection of Coenurus cerebralis in goats were described. The molecular characterization showed sequences of Taenia multiceps and no genetic differences were found between cysts with cerebral and non-cerebral localization. The immunochemical results of this study on antibody and antigens corroborate the suggestions from previous reports on the difficulty of developing immunoassays of practical use based on crude or sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis fractioned antigens. The plasma kinetic profile of ABZ and its metabolites after single or multiple oral administration of ABZ in healthy goats of different ages and sex and T. multiceps-infected adult males were analyzed, compared and discussed. Additionally, infected animals were treated with a single oral dose of 10 mg/kg ABZ. Twelve hours after drug administration, muscles, brain and cyst fluid were collected. Plasma, muscles, brain and cyst fluid were analysed using HPLC method. In healthy goats, age differences in the plasma profiles of ABZ metabolites were observed but no gender related differences were observed. The pharmacokinetic parameters of ABZ metabolites, albendazole sulphoxide (ABZSO) and albendazole sulphona (ABZSO2), obtained from infected and healthy goats treated with 10 or 20 mg/kg of ABZ, showed statistically significant differences in concentration (Cmax), time of peak plasma concentration (Tmax), area under the curve (AUC) and mean residence time (MRT). Lower Cmax and AUC for both metabolites were observed in infected goats when compared with healthy goats treated with the same dose, (10 mg/kg of ABZ). This suggests that T. multiceps cysts cause pathophysiological changes that alter the kinetics of ABZ and its metabolites. In a multiple ABZ dose (3x10mg/kg), ABZSO appeared earlier and in higher concentrations than ABZSO2 in the first 24 h, but after 48 hours, the plasma concentrations of ABZSO2 were greater than ABZSO. This suggest that ABZ can induce the ABZSO metabolism to ABZSO2 In a controlled trial with experimental T. multiceps-infected goats, two months after infection, the efficacy of ABZ was 90.3%, 72.7% and 73.9% for 10mg/kg/3 days, single 10mg/kg and 20mg/kg doses, respectively. No differences were observed in cyst viability between treated and control groups for cysts, 5 months after infection. The results of this study indicate that ABZ is effective, in goats, against cysts of T. multiceps located in tissues outside the brain two months after infection.

Tesi realitzada a l'Institut d'Investigació Biomèdica de Girona Dr. Josep Trueta (IdIbGi) / Diferents estudis epidemiològics evidencien un major risc de desenvolupar hipertensió arterial (HTA) en subjectes amb baixes concentracions circulants de 25 (OH) vitamina D com la deficiència de la vitamina D(3) estan associades amb l’obesitat. Es ben conegut que la pèrdua de pes comporta una reducció de la tensió arterial (TA), però la seva relació amb la vitamina D(3) ha estat poc estudiada. El teixit adipós podria jugar un paper en la relació entre obesitat, HTA i el metabolisme de la vitamina D(3) . En aquest treball es va analitzar 3 objectius: 1) L’associació entre la concentració circulant de vitamina D i la TA a individus obesos i no obesos, 2) si la concentració circulant de vitamina D(3) tenia relació amb la baixada de la TA després de pèrdua de pes en pacients amb obesitat mòrbida intervinguts per cirurgia bariàtrica, i 3) l’associació entre l’expressió gènica del receptor de vitamina D (VDR) i la TA, i elements implicats amb la seva fisiopatologia en el teixit adipós subcutani (SAT) i visceral (VAT). El primer objectiu s’analitzà a partir d’un estudi transversal retrospectiu de 509 subjectes (cohort formada per subjectes amb un ampli rang d’índex de massa corporal) on es va observar una associació inversa entre la concentració circulant de vitamina D i la xifra de TA sistòlica i diastòlica, però al realitzar una regressió lineal múltiple, les relacions entre les concentracions circulants de vitamina D i la TA sistòlica i TA diastòlica no van ser independents del grau d’obesitat i l’edat dels subjectes. La concentració plasmàtica de vitamina D(3) va ser inferior en subjectes catalogats com hipertensos (≥135 i/o >85 mmHg o tractament antihipertensiu) respecte als normotensos (15,5 ± 9,2 vers 17,9 ± 9,6; p= 0,011 ng/ml). El segon objectiu s’analitzà a partir d’un estudi longitudinal retrospectiu de 169 subjectes, on es va observar una associació inversa entre la concentració circulant de vitamina D prèvia a la cirurgia i la xifra de la TA diastòlica als 12 i 18 mesos després de la cirurgia bariàtrica. I el tercer objectiu s’analitzà a partir d’un estudi restrospectiu de l’expressió gènica del VDR en mostres de teixit adipós. En el teixit adipós visceral es va objectivar una associació positiva entre l’expressió gènica del VDR i la xifra de la TA sistòlica (r= 0,282; p= 0,020), així com una associació directa amb l’expressió gènica del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa) (r= 0,264; p= 0,045) (n=121). A SAT també es va observar una associació positiva entre l’expressió gènica del VDR i l’expressió gènica de la interleuquina 10 (IL-10) (r= 0,616; p <0,001). Es de destacar que la expressió relativa del VDR es va relacionar de forma inversa amb el grau de sensibilitat a la insulina tant en SAT (r= -0,54; p= 0,021) com en VAT (r= -0,49; p= 0,037) en una cohort independent. En conclusió, la concentració circulant de vitamina D s’associà amb la xifra de la TA en subjectes amb un ampli rang d’adipositat, però aquesta associació no es va mantenir després d’ajustar-ho per possibles factors de confusió en una regressió lineal múltiple. En subjectes amb obesitat mòrbida, la concentració circulant de vitamina D pèrdua de pes) s’associà amb les xifres de TA diastòlica als 12 i 18 mesos posteriors al procediment quirúrgic i la pèrdua de pes assolida. Una major expressió gènica del VDR al teixit adipós de pacients obesos es relaciona amb diferents elements de la fisiopatologia de la HTA, com la sensibilitat a la insulina i la inflamació crònica de baix grau (TNF-alfa i IL-10). / Several epidemiologic studies have evidenced an increased risk for the development of hypertension in subjects with low serum vitamin D3 levels. Both hypertension and vitamin D3 deficiency are associated with obesity. It is well known that weight loss results in decreased blood pressure but there are few studies in the literature about the potential relationship between weight loss and serum vitamin D3 levels. The adipose tissue could have a role in the relationship among obesity, hypertension and vitamin D3 metabolism. In this Thesis, we aimed: 1) To study the association between serum vitamin D3 levels and blood pressure in obese and non obese individuals. 2) To evaluate the effects of bariatric surgery-induced weight loss on serum vitamin D3 levels and their relationship with blood pressure in patients with morbid obesity. 3) To study the potential relationship among vitamin D receptor (VDR) gene expression in subcutaneous (SAT) and visceral adipose tissue (VAT), blood pressure and other elements implicated in the pathophysiology of hypertension. The first objective was studied in cross-sectional study in 509 subjects (including a wide range of adiposity). We observed an inverse association between serum vitamin D3 levels and systolic and diastolic blood pressure levels, but multivariate regression analyses s showed that the association was not independent of the degree of obesity or age. The plasma levels of vitamin D3 were lower among hypertensive subjects (>135 i/o >85 mmHg or antihihypertensive treatment) compared with healthy group of subjects (15.5 ± 9.2 vs. 17.9 ± 9.6; p= 0.011 ng/ml). In a retrospective study of 169 subjects with morbid obesity, we observed an inverse association between serum vitamin D levels before bariatric surgery and diastolic blood pressure 12 and 18 months after bariatric surgery. The third objective was studied also in subjects with morbid obesity. A positive association between VAT VDR gene expression and systolic blood pressure was found (r= 0,282; p= 0,020); VAT VDR mRNA levels were also linked to VAT Tumour Necrosis factor Alfa (TNF-alpha) gene expression (r=0,264; p= 0,045) (n=121); and SAT VDR mRNA levels were linked to SAT interleukin 10 mRNA (IL-10) (r= 0,616; p <0,001). Insulin sensitivity was associated with SAT (r= -0,54; p= 0,021) and VAT mRNA levels (r=-0,49; p=0,037). In conclusion, circulating vitamin D3 concentration was associated with blood pressure in subjects with a wide range of adiposity, but the association did not remain significant after adjusting for potencial confounders in a multivariate regression analyses. In subjects with morbid obesity, baseline pre-surgical serum vitamin D concentrations were associated with diastolic blood pressure 12 and 18 months after bariatric surgery. The increased gene VDR expression in the adipose tissue of obese patients was related to different elements of the hypertension pathophysiology, as insulin sensitivity and chronic low grade inflammation (TNF-alpha and IL-10).

Amb la participació de l'Hospital Germans Tries i Pujol / La variabilidad de los niveles de hemoglobina (Hb) está relacionada con la mortalidad y la morbilidad en los pacientes en hemodiálisis tratados con agentes estimulantes de la eritropoyesis (AEE). La evidencia científica sobre los efectos de la variabilidad de Hb en los pacientes en prediálisis tratados con AEE es escasa e incompleta. OBJETIVOS: El objetivo principal de este estudio es determinar la influencia de la variabilidad de los niveles Hb con la mortalidad y la morbilidad de los pacientes. Los objetivos secundarios son: determinar la correlación de los métodos de determinación de la variabilidad (desviación estándar (DE) de Hb, desviación estándar residual (DE residual) de Hb, niveles fuera del objetivo de Hb 10-12,5g/dL), la influencia de las variables demográficas, hematológicas, bioquímicas, farmacológicas y de la comorbilidad con la variabilidad. METODOLOGÍA: Estudio observacional prospectivo realizado en el Hospital Universitari Germans Trias i Pujol que incluyó 229 pacientes con enfermedad renal crónica tratados con AEE en prediálisis. Los criterios de exclusión fueron: pacientes con cambios de tratamiento durante 6 meses previos, estadios I y II, trasplante renal, talasemia, déficit de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y pacientes con menos de 3 determinaciones de Hb. El periodo de observación fue de 18 meses. RESULTADOS: De los 229 pacientes, 109 eran mujeres (47,6%), con una edad media de 70,44 años (25-94) y un IMC de 28,29Kg/m2 (16,40-46,86).El 34% tenía un estadio III, el 52% estadio IV y el 14% estadio V. Veintitrés pacientes se trataron con eritropoyetina beta,149 con darbepoetina alfa y 57 con CERA. Solo el 24% y el 29,3% de los pacientes mantuvieron 4 ó 3 determinaciones de Hb en el objetivo. Los métodos para determinar la variabilidad se correlacionaron entre sí (p=0,000). No se pudo demostrar su influencia sobre la mortalidad (p=0,569). Se obtuvo un incremento de los índices de hospitalización (p=0,05) y del número de días de estancia (5 días aproximadamente). El deterioro de la función renal también fue mayor en los pacientes con mayor variabilidad (p=0,05). Los niveles séricos de calcio DE, urato DE, fibrinógeno, albúmina y ferritina se relacionaron con la variabilidad (p≤0,05). El intervalo prolongado de administración de los AEE se relacionó con una menor variabilidad (p=0,001). La administración concomitante de IECA, antirretrovirales y citostáticos aumentó la variabilidad (p≤0,05). Solo la enfermedad cerebro vascular, las hemorragias y las transfusiones afectaron la variabilidad (p≤0,05). CONCLUSIONES: La variabilidad de Hb aumenta la morbilidad de los pacientes tratados con AEE en prediálisis (hospitalización y deterioro renal). La pauta de los AEE y cierta medicación concomitante puede afectar la variabilidad de los niveles de Hb. / Hemoglobin (Hb) variability is related with mortality and morbidity in hemodialysis patients treated with erythropoietic agents (EA). Evidence of possible effects of Hb variability in pre-dialysis patients is scarce and incomplete. Objectives: The primary endpoint of this study is to determine the influence of Hb variability with mortality and morbidity of patients. Secondary endpoints are to determine the correlation of methods used to determine Hb variability (Hb standard deviation (SD), Hb residual SD, Hb levels out target 10-12,5g/dL) and the influence of demographic, biochemistry, hematological, and pharmacological variables and co morbidities over Hb variability. Methods: This observational and prospective study carried out in University Hospital Germans Trias i Pujol (Badalona, Spain) included 229 chronic kidney disease (CKD) patients treated with EA in pre-dialysis. Exclusion criteria were: patients with any change in EA treatment during previous 6 months, CKD stages I and II, renal transplantation, thalassemia, glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency, and patients with less than 3 Hb determinations. Observation period was 18 months. Results: Out 229, 109 (47,6%) were females, with 70.44 years of median age (range 25-94),median BMI of 28.29 kg/m2(range 16.40-46.86), with 34% , 52% and 14% of CKD stages III, IV and V respectively.23 patients were treated with EPO beta, 149 with darbepoetina alpha and 57 with CERA. Only 24% and 29.3% of patients achieved 4 or 3 Hb determinations on target (10-12,5g/dL). Methods for Hb variability determination were correlated (p=0.000). No Hb variability correlation with mortality were found (p=0.569. An increase of hospitalization rate was obtained (p=0.05) and with a longer inpatient stay (5 days). Also renal function decline was higher in patients with high Hb variability (p=0.05). Plasma levels of calcium SD, urate SD, fibrinogen, albumin and ferritin were correlated with Hb variability (p≤0.05). More prolonged EA administration were related with less Hb variability ( p=0.001) and concomitant administration of ACEI, antiretrovirals and cytostatics increase Hb variability (p≤0.05). Only cerebral vascular disease, bleeding and transfusions were affected Hb variability (p≤0.05). Conclusions: In pre-dyalisis EA treated patients, high Hb variability increase morbidity (hospitalization and renal function decline). Therapeutic regime of EA and concomitant medication as ACEI, antiretrovirals and cytostatics may affect Hb variability.

Objectius principals Descriure i analitzar els canvis del perfil d’ús dels fàrmacs de la malaltia d’Alzheimer (FMA) iniciats a Catalunya des del 2on semestre de 2006 (2206/2) al 2on semestre de 2009 (2009/2). Analitzar el risc de canvi a memantina o l’addició d’aquesta (RCM), el risc d’institucionalització (RI) i el risc de mort (RM) en funció del FMA utilitzat d’inici. Objectius secundaris Descriure el tractament amb psicotrops i comparar abans-després d’instaurar un FMA. Comparar les característiques dels pacients que inicien un FMA amb les dels pacients dels assaigs clínics (AACC). Mètodes Estudi retrospectiu observacional utilitzant la base de dades SIDIAP (Sistema d’Informació per al Desenvolupament de la Investigació a l’Atenció Primària). Es van analitzar els FMA iniciats per 17.527 pacients a Catalunya mitjançant anàlisi descriptiva i tres models de supervivència pels riscos d’intensificació del tractament, RI i RM en funció del tractament rebut inicialment. Resultats Rang de tractaments iniciats per semestre: 2.120 - 2.754. El 80,7% dels pacients inicià el tractament amb un anticolinesteràsic (IAC). El tractament més iniciat el 2006/2 va ser donepezil (34,5%) seguit de rivastigmina (24%), galantamina (22,2%), memantina (16%) i la combinació d’IAC amb memantina (3,2%). La combinació més freqüent va ser donepezil i memantina. El fàrmac més iniciat el 2009/2 va ser rivastigmina (38,4%), el 90% en la nova formulació apareguda el 2008/2 (pegats transdèrmics). Dones (65,8%), homes (34,2%), promig d’edat 79,1 anys. Diagnosticats de MA 53,6%; sense diagnòstic registrat de demència 26,7%. El 64,4% tenia una puntuació GDS de 4/5. Un 5,1% estava institucionalitzat i un 8,5% inclòs a un programa d’atenció domiciliària. Els que prenien memantina sola o associada eren més grans (promig de 81,1 i 79,9 anys respectivament), tenien GDS més avançats (41% dels que prenien memantina associada GDS 5 i 14,1% GDS≥6 i un 29,8% i 31,6% respectivament dels que prenien memantina sola). El 89,9% dels pacients que iniciaren memantina finalitzaren l’estudi prenent-la (grup que menys va variar el seu tractament). S’ observà una disminució del RCM si el tractament inicial era rivastigmina (HR 0,85; IC95% 0,77-0,93), un augment del RI (HR 1,16; IC95% 1,05-1,27) per memantina sola o combinada i un augment del RM (HR 1,34; IC95%1,19-1,50) i (HR1,27; IC 1,05- 1,56) respectivament per memantina sola o combinada amb un IAC. Després de 6 mesos de tractament amb un FMA els percentatges de pacients tractats amb neurolèptics, antidepressius o ansiolítics-hipnòtics van augmentar (5,2%; 2,7%; 1,3%) i van disminuir els tractats amb psicoestimulants (-4,3%). Els pacients d’aquest estudi respecte els dels AACC eren més grans (79,1 anys en front de 75,1), amb rangs més amplis d’edat (45,5-100,5 en front de 54,1-85,7), un percentatge de dones superior (65,8% en front de 62,3%) i MMSE superior (18,2 punts en front de 16,2). El percentatge d‘institucionalitzats va ser inferior (5,1% en front de 14,6%). Conclusions Una nova forma farmacèutica (pegats transdèrmics de rivastigmina) va modificar el perfil de prescripció dels FMA i es va convertir en el medicament més prescrit del grup. Rivastigmina mostra un efecte protector sobre el canvi o addició de memantina. Els pacients que inicien memantina són els que menys canvien de tractament però els que presenten major RI i/o RM. Amb l’inici de tractament amb FMA s’observa un augment d’utilització de neurolèptics, antidepressius i ansiolítics-hipnòtics i una disminució dels psicoestimulants. Els pacients d’aquest estudi eren més grans, menys institucionalitzats, el percentatge de dones era superior i el valor promig de l’escala MMSE també en comparació als pacients dels AACC. / Primary objectives To describe and analyse changes in specific drugs used to treat Alzheimer (DTA) in Catalonia initiated from the 2nd half of 2006 (2006/2) to the 2nd half of 2009 (2009/2). To analyze the risk of switching to memantine or to have combined treatment including this drug (RSCM), the risk until institutionalization happens (RI) and the risk to die (RD) depending on the DTA initially prescribed. Secondary objectives To describe psicotropic drug consumption before and after a DTA have been initiated. To compare the basal characteristics between patients in this study and patients recruited in clinical assays. Methods Observational retrospective study using the SIDIAP database (Information Service for the Development of Primary Care Investigaton). N=17.527 patients starting DTA in Catalonia were analyzed. Descriptive analysis and 3 survival analysis were performed to analyze risk to be added or changed to memantine, the RI and the RD. Results Range of treatments initiated by semester: 2,120- 2,754. 80.7% began treatment with a cholinesterase inhibitor (CheIAC). The most initiated treatment in 2006/2 was donepezil (34.5%) followed by rivastigmine (24%), galantamine (22.2%), memantine (16%) and CheIAC combined with memantine (3.2%). Donepezil plus memantine was the combination more frequently used. The most initiated drug in 2009/2 was rivastigmine (transdermal formulation that appeared in 2008/2 accounted for 90% of this percentage). Baseline characteristics were: women (65.8%); mean age 79.1 years; Alzheimer disease 53.6%; 26.7% lacking a dementia registered diagnosis; 64.4% had a GDS score of 4/5; 5.1% institutionalized and 8.5% cared for by home care program (HCP). Those who took memantine alone or in combination were older (average 81.1 and 79.9 years respectively), and had worst values in GDS (41% of those taking memantine in combination had GDS=5 and 14.1% GDS≥6 and 29,8% and 31.6% respectively of those taking memantine alone). 89.9% of memantine users ended the study still on it and were the ones who switched the less. A decrease in RSCM was observed in patients who started rivastigmine (HR 0,85; 95% CI 0,77-0,93). In patients on memantine alone or associated an increase in RI (HR 1.16; 95%CI 1.05-1.27) was observed. An increase in RM was observed for memantine alone (HR 1.34; 95% IC 1.19-1.50) or in combination (HR 1.27; 95%CI 1.05-1.56). Patients with neuroleptics , antidepressants or sedatives – hypnotics prescriptions increased (5.2%; 2.7%; 1.3%) and those with psychostimulants decreased (-4.3 %) after 6 months of treatment with a DTA. When compared with patients recruited for clinical trials, patients in this study were older (79.1 vs 75.1), with wider ranges of age (45.5-100.5 vs 54,1-85.7), higher MMSE scores (18.2 vs 16.2), less institutionalized (5.1% vs 14.6%) a with a higher percentage of women (65.8% vs 16.2%). Conclusions A new transdermal formulation of rivastigmine changed the DTA use pattern and rivastigmine became the most prescribed drug in this group. Rivastigmine shows a protective effect on the risk of switching or combining with memantine. Patients who started memantine changed less frequently to another drug, but showed an increased RI and/or RD. After 6 months of treatment with a DTA an increase in antipsychotics, antidepressants and hynotic-sedatives consumption and a decrease in psicoestimulants was observed. When patients in this study were compared with patients recruited in clinical trials they were larger, less institutionalized, the percentage of women was higher as was the MMSE.

Tesi realitzada a l'Institut de Química Avançada de Catalunya (IQAC-CSIC) / Sphingolipids (SLs), essential components of cell membranes, are bioactive molecules involved in the regulation of a variety of cellular processes. Ceramide and sphingosine generally mediate anti-proliferative stimuli, while sphingosine-1-phospate plays an opposite role. The bioactive role of dihydroceramide has also been recently described, showing its involvement in processes like apoptosis and autophagy. Alteration of SLs levels is involved in different disease, including cancer. Sphingolipid metabolism is a complex network of anabolic and catabolic reactions catalyzed by specific enzymes. Consistent with the key role of sphingolipids in cell biology, the modulation of key­enzyme of the sphingolipid metabolism such as dihydroceramide desaturase (Des1), ceramide synthase (CerS), ceramidases (CDases) and sphingosine kinase (SK) represent a strategy to better understand the role of SLs in physiophatological processes. During this PhD thesis three different studies that show the use of SL analogues and SL metabolism inhibitors as pharmacological tools for biomedical investigation in cancer cells were performed. The first study was focused on the alteration of sphingolipid metabolism and cytotoxic effect induced by Jaspine B (JB) in cancer cells. JB, a natural sphingolipid analogue from marine origin, is cytotoxic in a variety of cancer cell lines, including HGC-27 gastric cancer cells. JB induces changes in the sphingolipidome in this cell line, mainly the accumulation of dihydrosphingosine (dhSo) and sphingosine (So), and their phosphorylated forms. Moreover lipidomic analysis show the formation of acyl-JB. These effects appear to be due to inhibitory action of JB on CerS that use the natural sphingolipid as substrate. The hallmark of JB cytotoxicity in HGC-27 cells is the formation of cytoplasmic vacuoles in a time and dose-dependent manner. Apoptosis is not involved in cytoplasmic vacuolation and JB induced cytotoxicity. In addition, despite the accumulation of the autophagic marker LC3-II, autophagy is probably not activated by JB treatment. The micropinocytic nature of vacuoles suggest the involvement of methuosis in JB-induced cell death. The second study was focused on SKI II is a well-known SK inhibitor. In a study on HGC-27 cells we show that SKI II is also an uncompetitive inhibitor of Des1. Des1 inhibition in intact cells is not connected to protein degradation. SKI II, but not the SK1-specific inhibitor PF-543, provoked a remarkable accumulation of dhCers and their metabolites, while both SKI II and PF-543 reduced S1P to almost undetectable levels. SKI II, but not PF-543, reduced cell proliferation, with accumulation of cells in the G0/G1 phase. Similarly SKI II, but not PF543 increases LC3-II levels in HGC-27 cells, suggesting autophagy induction. These overall findings indicate that some of the effects attributed to decreased S1P may actually be caused by augmented dhCers and/or their metabolites. The use of ceramide analogues as chemical tool for ceramidases investigation is the topic of the third study. RBM14 are coumarinic ceramide analogues that differ from the acyl chain length. Among them RBM14C12 was reported as the best substrate for acid ceramidase. In this study it was shown that RBM14 molecules are also hydrolyzed by neutral and alkaline ceramidase. Neutral ceramidase from Pseudomonas aeuriginosa prefers C12 and C14 analogues, while human recombinant NC better hydrolyze RBM14C14 and RBM14C16 molecules. RBM14 substrates are hydrolyzed by MEF cells lacking NC, whit higher activity at basic pH, suggesting alkaline ceramidase activity. SABRAC and RBM1-12 have been designed to inhibit the cysteine protease AC. In this study it was shown that papain, a protein belonging to the same protein family, is not inhibited by SABRAC and RBM1-12. Moreover preliminary studies suggest an irreversible inhibition of AC. These molecules can be used in combination with RBM14C12 substrate as a suitable tool for AC activity determination in intact cancer cells. / Los esfingolípidos (SLs), componentes esenciales de las membranas celulares, son moléculas bioactivas que regulan distintos procesos celulares. Ceramida y esfingosina (So) median estímulos anti-proliferativos, mientras que la esfingosina-1-fosfato (S1P) juega un papel opuesto. La alteración del metabolismo de los SLs está relacionada al desarrollo de muchas enfermedades, entre ellas el cáncer. El metabolismo de los SLs representa una red compleja de reacciones anabólicas y catabólicas catalizadas por enzimas específicas, cuya modulación permite investigar el papel de los SL en los procesos fisiopatológicos. En esta tesis doctoral se han realizado tres estudios que muestran el uso de análogos de SLs y de inhibidores del metabolismo de SLs como herramientas farmacológicas para la investigación biomédica en las células cancerosas. El primer estudio se centró en los efectos de la Jaspina B, un esfingolípido natural, en células de cáncer humano HGC-27. La JB induce alteración del metabolismo de los SLs con aumento de dihidroesfingosina y So y sus formas fosforiladas, como efecto de la inhibición de la ceramida sintasa. Además la JB lleva la célula a muerte celular tras un mecanismo de vacuolización del citoplasma que no implica activación de apoptosis o autofagia. En el segundo estudio se caracterizo el SKI II, un inhibidor de la esfingosina quinasa, como inhibidor no competitivo de la Des1. El SKI II induce acumulación de dihidroceramida (dhCer) y sus metabolitos y a nivel biológico induce parada de ciclo celular y autofagia. Con este estudio se propone que los efectos biológicos del SKI II se deben a aumento de dhCer y sus metabolitos, más que a la reducción de la S1P. El tercer estudio se centró en el utilizo de análogos a ceramida como herramienta para el estudio de las ceramidas. Los análogos RBM14s, descritos como substrato de la ceramidasa acida (AC), también se hidrolizan por las ceramidasas neutra y alcalinas. SABRAC y RBM1-12 son inhibidores específicos de la AC y se pueden utilizar en ensayos bioquímico para identificar selectivamente la actividad de la AC en células cancerosas.

Tesi realitzada a l'Institut d'Investigació Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL) / La cromatina és una estructura nucleoproteica, dinàmica i jeràrquicament organitzada dins del nucli cel•Iular. La seva estructura, organització i funció està controlada al llarg del cicle cel.lular, per processos epigenètics que produeixen canvis heretables que no afecten la seqüència de DNA. Entre aquests canvis es troben la metilació del DNA, les modificacions postraduccionals de les histones i desplegament de la cromatina orquestrat pels complexes remodeladors i proteïnes estructurals. Les modificacions postraduccionals de les histones es donen principalment de forma dinàmica i regulada a l'extrem N-terminal, canviant la seva càrrega i funció. Entre les diferents modificacions descrites, l'acetilació i la metilació de les histones H3 i H4, semblen tenir una importància especial sobre l'estructura i estat de la cromatina. En particular, l'acetilació de la lisina 16 de la histona H4 (H4K16Ac) per se impedeix la formació d'estructures compactes de cromatina. D'aquesta manera, s'associa l'estat desacetilat d'aquest residu a zones d'heterocromatina i transcripcionalment inactives, mentre que la hiperacetilació d'H4K16 està estretament vinculada a zones eucromàtiques i transcripcionalmentactives. La dinàmica d'acetilació-desacetiIació d' H 4K 16 està controlada principalment per l'equilibri de les activitats acetiltransferasa de MOF i desacetilasa de Si rT1 i Si rT2. Per tant, aquests dos grups d'enzims són essencials per el control de l'expressió gènica i de l'arquitectura de la cromatina dins del nucli, regulant la transició entre l'estat transcripcionalment actiu i inactiu de la cromatina. MOF és crucial per el desenvolupament embrionari , I a reparació del DNA i la progressió del cicle cel .lular, i la seva pèrdua està associada a l'augment de les aberracions cromosòmiques, a l'aturada del cicle cel.lular en G2/M i a l'augment de la inestabilitat genòmica. SirT1 i Si rT2 pertanyen a la classe III de desacetilases d'histones (HDACs), conegudes com sirtuïnes, i són crucials per el manteniment de la integritat genòmica, l'adaptació a l'entorn i l'envelliment, entre altres funcions. No obstant, dels set membres de sirtuïnes presents a mamífers, només Si rT2 i en menor mesura SirT1, han estat vinculades amb el control del cicle cel.lular. Concretament, Si rT2, tot i ser principalment citoplasmàtica, és transportada al nucli durant I a transició G2/M , moment en el que a través de la desacetilació d'H4K16 permet la monometilació d'H4K20 per PR-SET7 (la monometiI transferasa d'H4K20), determinant els nivells d'H4K2Ome2,3 en la resta del cicle cel.lular. Com a conseqüència, SirT2 està implicat en processos estrictament associat a aquestes modificacions, com la compactació dels cromosomes metafàsics, Ia progressió a través de mitosi, la replicació i reparació del DNA o la formació de l'heterocromatina. Fins al moment el paper de Si rT2 en el control de I a progressió a través de la mitosi ha estat atribuït a la regulació de diferents substrats. En particular, el control d'H4K2Ome1 dependent de SirT2 ha estat relacionat amb l'activació del checkpoint de G2/M en resposta a estrès, tot i que els mecanismes involucrats en l'aturada del cicle cel.lular eren del tot desconeguts. En aquest treball hem volgut indagar sobre com Si rT2 regula la transició G2/M i la seva coordinació amb la maquinària regulatória del checkpoint. Les nostres dades semblen indicar que SirT2 condueix a l'activació del checkpoint de G2/M a través de la regulació d' H4K 1 6Ac, H4K2Ome1 i el control de I a transcripció de gens relacionats amb el cicle cel.lular. Es descriu per primera vegada, com SirT2 controla H4K16Ac a través de la regulació de l'activitat i de l'estabilitat proteica de MOF durant G2/M. Concretament, SirT2 desacetila MOF durant G2/M i en promou la sortida de la cromatina, la inactivació i degradació, afavorint l'estat desacetilat d'H4K16 i la monometilació d'H4K20. En concordança, hem vist que MOF controla negativament la presència de PR-SET7 a la cromatina, mantenint així uns nivells adequats d'H4K2Omel abans d'entrar a mitosi i evitant la condensació prematura dels cromosomes. El nostre estudi suggereix que la interconnexió entre SirT2 i MOF està directament implicada en el control epigenètic del cicle cel.lular, contribuint al manteniment de l'estabilitat genòmica. / Chromatin is a dynamical structure hierarchically organized to fit inside the nucleus. The structure, organization and function of chromatin are tightly controlled throughout the cell cycle by different epigenetic mechanisms, including DNA methylation and histone modifications. The histone post-translational modifications occur mainly in their N-terminal tail, and give rise to changes in the charge and function of the protein. Among the different histone modifications, lysine acetylation (K) is one of the best characterized. Acetylation of lysine 16 of histone H4 is the most frequently acetylated residue in eukaryotes and is a key regulator of high orders of chromatin structure. Thus, the deacetylated state of this residue is associated with heterochromatic and transcriptional inactive regions, whereas the acetylated form is found in euchromatic and transcriptional active regions. The dynamics of this histone mark is mainly governed by the acetyltransferase MOF and the NAD±-dependent deacetylases SirT1 and SirT2, which makes both groups of enzymes essential for the regulation of the gene expression and the control of chromatin organization. MOF is crucial in embryogenesis, DNA repair and the cell cycle progression. In fact, loss of MOF has been shown to induce cell cycle arrest during G2/M transition, increased chromosomal aberrations and genome instability. SirT 1 and SirT2 belong to Class III of histone deacetylases (HDACs), commonly referred as sirtuins. They play a key role in stress response, and in particular in protecting genome integrity. Among the seven mammalian sirtuins (SirT1-7), only SirT2 and to a lesser extend SirT1, have been linked with cell cycle regulation. In particular, SirT2, which mainly localizes to the cytoplasm during most of the cell cycle, shuttles to the nucleus in G2/M transition, where deacetylates H4K16Ac driving, among other things, H4K2Omel deposition by the histone methyltransferase PR-SETT. The control of H4K2Omel deposition determines the levels of H4K2Ome2,3 in the next cell cycle, which links SirT2 to the regulation of DNA replication and repair, as well as heterochromatin formation. Work from our group and others have shown that SirT2 plays a role in the control of mitosis progression. In particular, SirT2 is required for the cell cycle arrest in the G2/M checkpoint during stress response, process that has been related to SirT2-dependent regulation of H4K2Omel. However, the mechanisms behind the cell cycle arrest are still undefined. In the present work we aimed to elucidate the function of SirT2 in G2/M transition and its coordination with the checkpoint regulatory machinery. Our results seem indicate that SirT2 drives the G2/M checkpoint activation through the regulation of H4K16Ac, H4K2Omel and the control of the expression of cell cycle related genes. We also describe for the first time, a complementary mechanism whereby SirT2 regulates the levels of H4K16Ac during mitosis. We observe that SirT2 not only deacetylates MOF during G2/M, suppressing its acetyltransferase activity, but also induces both chromatin eviction and degradation of MOF. This in turn, results in H4K16 hypoacetylation and subsequent monomethylation of H4K20. Additionally, we show that MOF inhibits PR-SETT chromatin localization, maintaining the appropriate levels of H4K2Omel before entering mitosis and avoiding premature chromosome condensation. Our study suggests that the crosstalk between MOF and SirT2 is directly involved in the epigenetic control of the cell cycle, contributing to the maintenance of genome stability.