La dérégulation du métabolisme glucidique conduisant au développement d’une hyperglycémie est classiquement associée aux maladies métaboliques, telles que le diabète de type 2 et l’obésité. Le foie est un organe clé dans le contrôle de l’homéostasie glucidique. Ainsi, lors d’un état post-prandial (après un repas), il utilise le glucose pour produire de l’énergie par la voie de la glycolyse, mais surtout stocke l’excès de glucose sous forme de glycogène par la voie de synthèse du glycogène et l’excès d’énergie sous forme d’acides gras par la voie de la lipogenèse. Ces voies sont sous le contrôle des hormones insuline et glucagon qui, en fonction des changements nutritionnels, régulent respectivement l’utilisation (glycolyse) et la production (néoglucogenèse) de glucose en induisant l’expression des enzymes de ces voies métaboliques. Plus récemment, il a été montré que les voies de la glycolyse et de la lipogenèse sont également régulées par le glucose qui active le facteur de transcription ChREBP (Carbohydrate Response Element Binding Protein) et induit de ce fait l’expression des gènes de la glycolyse, tels que la LPK (Liver Pyruvate Kinase), et de la lipogenèse, tels que FAS (Fatty Acid Synthase) et ACC1 (Acetyl-CoenzymeA Carboxylase 1). Le récepteur nucléaire Farnesoid X Receptor (FXR), un facteur de transcription activé par des ligands, en plus de son rôle très important dans la régulation des acides biliaires et des lipides, contrôle aussi le métabolisme glucidique dans le foie. Ainsi, FXR inhibe l’expression des gènes des voies de la glycolyse et de la lipogenèse, probablement en interférant avec le facteur de transcription ChREBP, comme le propose une étude récente. Les objectifs de ma thèse ont été de caractériser deux lignées hépatocytaires humaines IHH (Immortalized Human Hepatocytes) et HepaRG d’un point de vue métabolique et d’étudier les mécanismes moléculaires d’interférence du récepteur nucléaire FXR avec l’activité du facteur ChREBP dans ces deux lignées. / Glucose metabolism dysreglation leads to the developpment of hyperglaecemia and is classically associated with metabolic diseases such as Type II diabetes or obesity. The liver is a key organ in the control of glucose homeostasis. Indeed, at a post-prandial state (after a meal), it utilizes glucose to produce energy by the glycolysis pathway, but mostly stores the glucose excess as glycogen by the glycogenesis pathway and the energie excess as fatty acids by the lipogenesis pathway. These pathways are controlled by insulin and glucagon hormones which, in response ton nutritional changes, regulate respectively the utilization (glycolysis) and the production (gluconeogenesis) of glucose by inducing the expression of enzymes involved in these pathways. More recently, it has been shown that glycolyisis and lipogenesis are also regulated by glucose who activates the transcription factor ChREBP (Carbohydrate Response Element Binding Protein) and therefore induces the expression of glycolytic genes, such as LPK (Liver Pyruvate Kinase) and lipogenic genes, such as FAS (Fatty Acid Synthase) and ACC1 (Acetyl-CoenzymeA Carboxylase 1). Nuclear receptor Farnesoid X Receptor, a transcription factor activated by ligands, besides its role in the regulation of bile acids and lipids, also controls the glucose metabolism in liver. Thus, FXR inhibit the expression of genes involved in glycolysis and lipogenesis, probably by interfering with the transcription factor ChREBP, as it has been suggested by a recent study The objectifs of my thesis were to characterize two human hepatocyte cell lines IHH ( (Immortalized Human Hepatocytes) and HepaRG from a metabolic point of view and to study the molecular mecanisms involved in the interference of FXR with the activity of ChREBP in these two cell lines.

Les orosomucoïdes, membres de la superfamille des lipocalines, sont parmi les protéinesplasmatiques les plus abondantes. Ce sont des protéines de la phase aiguë de l’inflammationsecrétées par les hépatocytes en réponse à un stress (inflammation, cancer, cirrhose…), etutilisées couramment en clinique comme marqueur d’un état pathologique. Elles vont lorsd’un état inflammatoire inhiber la prolifération des neutrophiles et des lymphocytes. J’ai pumontrer que le récepteur nucléaire FXR, impliqué dans de nombreuses voies métaboliques etplus récemment comme ayant un rôle anti-inflammatoire dans le foie, régule l’expression desorosomucoïdes exclusivement au niveau hépatique chez la souris. Cela suggère que larégulation de certains processus inflammatoire par FXR pourrait être expliqué par larégulation transcriptionelle des orosomucoïdes.Le second sujet met en évidence une relation entre le récepteur nucléaire Rev-Erba et la OGlcNAcylationau niveau hépatique. La O-GlcNAcylation est une modification posttraductionnelledes protéines qui permet l’ajout d’un groupement O-GlcNAc. De nombreusesprotéines impliquées dans de multiples processus biologiques comme la régulation du cyclecellulaire, du rythme circadien, ou encore dans de nombreuses voies métaboliques, vont êtreO-GlcNAcylées. La dérégulation de la O-GlcNAcylation est également impliquée dans denombreuses pathologies telles que le diabète, le cancer ou encore la maladie d’Alzheimer. Lerythme circadien est un important régulateur du métabolisme. De plus en plus d’indicesindiquent que la O-GlcNAcylation est un intermédiaire essentiel dans la régulationcircadienne du métabolisme. Des modulations circadiennes de la O-GlcNAcylation deBMAL1, CLOCK et PER ont été mises en évidence. Ce lien entre la O-GlcNAcylation et lerythme circadien nous a poussé à essayer d’identifier le rôle potentiel de Rev-Erba, récepteurnucléaire impliqué dans le contrôle de la ryhtmicité circadienne, dans la régulation de la OGlcNAcylation.Nous avons pu montrer par ces travaux que Rev-Erba est un régulateurimportant de la O-GlcNAcylation. La déficience en Rev-Erba induisant une baisse importantede la O-GlcNAcylation. Rev-Erba ne régule pas le niveau de transcription des enzymesimpliquées dans la O-GlcNAcylation mais est capable d’intéragir avec l’OGT (enzymeresponsable de la O-GlcNAcylation) et d’inhiber sa dégradation par le protéasome. Par cemécanisme de stabilisation de l’enzyme OGT, Rev-Erba se révèle être un régulateurimportant de la O-GlcNAcylation. / Orosomucoïdes, members of the superfamily of lipocalines, are among proteins plasmatiques the most plentiful. They are proteins of the acute(sharp) phase of the inflammation secreted by hépatocytes in answer to a stress (inflammation, cancer, cirrhosis), and usually used in private hospital as marker(scorer) of a pathological state. They go during an inflammatory state to inhibit the proliferation of neutrophiles and lymphocytes. I was able to show that the nuclear receiver FXR, implied(involved) in numerous metabolic ways and more recently as having an anti-inflammatory role in the liver, regulates the expression of orosomucoïdes exclusively at the hepatic level to the mouse. (...]

Les acides biliaires sont cruciaux pour l’absorption intestinale des lipides et ils représentent une voie majeure d’élimination du cholestérol. À concentration élevée, ils sont cytotoxiques et potentiellement carcinogènes. Il est donc essentiel de maintenir des niveaux adéquats afin de préserver une homéostasie optimale. Le récepteur nucléaire FXR est grandement impliqué dans cette régulation, en étant activé par les acides biliaires qui agissent comme ligands et en régulant les gènes nécessaires à leur synthèse et leur métabolisme. FXR est aussi impliqué dans le métabolisme lipidique et glucidique, tout en ayant un rôle anti-inflammatoire et antiprolifératif. Les mécanismes régulant l’expression et l’activité transcriptionnelle de FXR sont toutefois peu connus. Leur caractérisation pourrait mener à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour les pathologies associées au syndrome métabolique. L’activation des récepteurs nucléaires peut se faire également de façon indépendante du ligand, soit via les modifications post-transcriptionnelles. Celles-ci permettent l’intégration d’une panoplie de signaux extracellulaires et l’adaptation de la réponse transcriptionnelle des récepteurs nucléaires aux variations de conditions cellulaires. La SUMOylation et l’ubiquitination sont deux modifications pouvant affecter la localisation cellulaire des récepteurs, leur interaction avec des partenaires protéiques, l’affinité de liaison au ligand, à l’ADN, leur dimérisation, la dégradation de leurs cibles et l’arrêt de la transcription. Étant donné le rôle important des modifications post-traductionnelles des récepteurs nucléaires en réponse aux divers signaux cellulaires, nous nous sommes intéressés particulièrement à leur impact sur la dégradation et l’activité transcriptionnelle de FXR. Nos études nous ont permis d’identifier et de caractériser un nouveau site de SUMOylation de FXR, impliqué dans la régulation du récepteur. Le résidu lysine responsable de conjuguer la protéine SUMO est localisé dans un motif non-consensus de SUMOylation, prénommé pSuM, qui est sous le contrôle de la phosphorylation d’un résidu serine régulé par la kinase CK2. Nous avons également déterminé que la modification de FXR par SUMO-2 permet le recrutement de l’ubiquitine E3-ligase SUMO-dépendante RNF4, qui induit l’ubiquitination et la dégradation de FXR. Cette cascade de signalisation est nécessaire pour l’activation transcriptionnelle de FXR et pour la régulation de l’expression des gènes cibles. Elle permet de contrôler ses niveaux protéiques de façon très dynamique et d’assurer ainsi une homéostasie optimale. Dans la deuxième étude, nous identifions un nouveau signal régulant l’activité transcriptionnelle de FXR. Les récepteurs tyrosine kinase de la famille EGFR/ErbB sont connus pour activer plusieurs voies de signalisation favorisant la croissance et la prolifération cellulaire. Cependant, leur expression et activité sont souvent altérées dans différents cancers, menant à une prolifération tumorale soutenue et dérégulée. Nous démontrons que l’activation des récepteurs de la famille EGFR/ErbB mène à la répression de l’activité transcriptionnelle de FXR en induisant la SUMOylation de FXR sur des résidus lysines situés dans des sites consensus de FXR. Étant donné le rôle antiprolifératif de FXR, l’impact répresseur des récepteurs ErbB sur l’activité de FXR pourrait contribuer à leur potentiel tumorigénique. Nos résultats approfondissent notre compréhension des mécanismes de régulation de l’expression et de l’activité de FXR. Étant donné son rôle important dans le métabolisme énergétique, la réponse transcriptionnelle de FXR doit être adaptée efficacement aux variations des conditions cellulaires dans un processus de régulation homéostatique. Les modifications post-traductionnelles assurent une régulation dynamique de l’activité de FXR et leur dérégulation pourrait être impliquée dans les pathologies associées au syndrome métabolique. / Bile acids are crucial for the absorption of intestinal lipids, and are directly involved in the efflux pathway to eliminate cholesterol. At high concentrations, bile acids are cytotoxic and potentially carcinogenic. It is therefore essential to maintain bile acids to adequate levels in order to preserve optimal homeostasis. Nuclear receptor FXR is directly involved in bile acid homeostasis by being activated by bile acids to regulate critical genes required for their synthesis and their metabolism. FXR is also involved in lipid and glucose metabolism, as well as having anti-inflammatory and anti-proliferative roles. However, the exact mechanisms regulating the degradation and activity of FXR are not well understood. Therefore, elucidation of FXR activity and response to cellular signals is essential to develop novel strategies and therapeutic targets for pathologies associated with the metabolic syndrome. Besides ligand activation, nuclear receptor can be regulated in a ligand-independent manner, mainly via post-translational modifications. Such modifications are important to allow homeostatic integration of diverse extracellular signals to ensure adaptation and transcriptional response of nuclear receptors. Among them, SUMOylation and ubiquitination are two modifications that modulate cellular localization of receptors, their interaction with protein partners, ligand binding and sensitivity, DNA affinity, receptor dimerisation, stability of their targets and transcriptional dynamics. Because of the important role of post-translational modifications in nuclear receptor function, we therefore study their specific impact in respect to FXR regulation and transcriptional competence. In this study, we have identified and characterized a new and non-consensus SUMOylation site involved in the regulation of FXR activity. This site, termed pSuM for phosphorylation-dependent SUMOylation motif, consists of a targeted lysine residue that conjugates SUMO proteins under the control of kinase CK2-mediated phosphorylation. We also determined that such modification of FXR with SUMO-2 induced the recruitment of SUMO-dependent E3 ligase RNF4, resulting in FXR ubiquitination and degradation. We demonstrate that this signaling cascade involving CK2 and RNF4 is required for FXR transcriptional activation and regulation of target gene expression. Our findings identify a cellular pathway that allows a dynamic control of FXR function to ensure efficient bile acid and energy metabolism in cells. In the second study, we identify a novel cellular signal that regulates FXR activity. Tyrosine kinase receptors of the EGFR/ErbB family are well known to participate in many signaling pathways, promoting cell growth and proliferation. Aberrant expression and activity of ErbB receptors are often associated to various cancers, leading to deregulated proliferation of tumors. Here, we show that ErbB activation leads to repression of FXR transcriptional activity by inducing FXR phosphorylation and specific SUMOylation at consensus sites. Because of the antiproliferative role of FXR, the negative impact of ErbB receptors on FXR transcriptional activity is thought to contribute to their tumorigenic potential. Altogether, our results expand our understanding of the mechanisms regulating FXR expression and activity. Because of its important role in lipid and energy metabolism, the transcriptional response of FXR needs to be efficiently adapted to variations of cellular conditions in order to achieve essential homeostatic control. As such, post-translational modifications ensure a dynamic regulation of FXR activity and their pathologic deregulation may be involved in diverse diseases associated with metabolic syndrome.

Nuclear receptors play significant roles in the regulation of transporters and enzymes to balance the level of endogenous molecules and to protect the body from foreign molecules. The vitamin D receptor (VDR) and its natural ligand, 1alpha,25-dihydroxyvitamin D3 [1,25(OH)2D3], was shown to upregulate rat ileal apical sodium dependent bile acid transporter (Asbt) to increase the reclamation of bile acids, ligands of the farnesoid X receptor (FXR). FXR is considered to be an important, negative regulator of the cholesterol metabolizing enzyme, Cyp7a1, which metabolizes cholesterol to bile acids in the liver. In rats, decreased Cyp7a1 and increased P-glycoprotein/multidrug resistance protein 1 (P-gp/Mdr1) expressions pursuant to 1,25(OH)2D3 treatment was viewed as FXR effects in which hepatic VDR protein is poorly expressed. In contrast, changes in rat intestinal and renal transporters such as multidrug resistance associated proteins (Mrp2, Mrp3, and Mrp4), Asbt, and P-gp after administration of 1,25(OH)2D3 were attributed directly as VDR effects due to higher VDR levels expressed in these tissues. Higher VDR expressions were found among mouse hepatocytes compared to those in rats. Hence, fxr(-/-) and fxr(+/+) mouse models were used to discriminate between VDR vs. FXR effects in murine livers. Hepatic Cyp7a1 in mice was found to be upregulated with 1,25(OH)2D3 treatment, via the derepression of the short heterodimer partner (SHP). Putative VDREs, identified in mouse and human SHP promoters, were responsible for the inhibitory effect on SHP. The increase in hepatic Cyp7a1 expression and decreased plasma and liver cholesterol were observed in mice prefed with a Western diet. A strong correlation was found between tissue Cyp7a1 and P-gp changes and 1,25(OH)2D3 plasma and tissue concentrations, confirming that VDR plays an important role in the disposition of xenobiotics and cholesterol metabolism. Moreover, renal and brain Mdr1a/P-gp were found to be directly upregulated by the VDR in mice, and concomitantly, increased renal and brain secretion of digoxin, a P-gp substrate, in vivo. The important observations: the cholesterol lowering and increased brain P-gp efflux activity properties suggest that VDR is a therapeutic target for treatment of hypercholesterolemia and Alzheimer’s diseases, since beta amyloid, precursors of plague, are P-gp substrates.

Nuclear receptors play significant roles in the regulation of transporters and enzymes to balance the level of endogenous molecules and to protect the body from foreign molecules. The vitamin D receptor (VDR) and its natural ligand, 1alpha,25-dihydroxyvitamin D3 [1,25(OH)2D3], was shown to upregulate rat ileal apical sodium dependent bile acid transporter (Asbt) to increase the reclamation of bile acids, ligands of the farnesoid X receptor (FXR). FXR is considered to be an important, negative regulator of the cholesterol metabolizing enzyme, Cyp7a1, which metabolizes cholesterol to bile acids in the liver. In rats, decreased Cyp7a1 and increased P-glycoprotein/multidrug resistance protein 1 (P-gp/Mdr1) expressions pursuant to 1,25(OH)2D3 treatment was viewed as FXR effects in which hepatic VDR protein is poorly expressed. In contrast, changes in rat intestinal and renal transporters such as multidrug resistance associated proteins (Mrp2, Mrp3, and Mrp4), Asbt, and P-gp after administration of 1,25(OH)2D3 were attributed directly as VDR effects due to higher VDR levels expressed in these tissues. Higher VDR expressions were found among mouse hepatocytes compared to those in rats. Hence, fxr(-/-) and fxr(+/+) mouse models were used to discriminate between VDR vs. FXR effects in murine livers. Hepatic Cyp7a1 in mice was found to be upregulated with 1,25(OH)2D3 treatment, via the derepression of the short heterodimer partner (SHP). Putative VDREs, identified in mouse and human SHP promoters, were responsible for the inhibitory effect on SHP. The increase in hepatic Cyp7a1 expression and decreased plasma and liver cholesterol were observed in mice prefed with a Western diet. A strong correlation was found between tissue Cyp7a1 and P-gp changes and 1,25(OH)2D3 plasma and tissue concentrations, confirming that VDR plays an important role in the disposition of xenobiotics and cholesterol metabolism. Moreover, renal and brain Mdr1a/P-gp were found to be directly upregulated by the VDR in mice, and concomitantly, increased renal and brain secretion of digoxin, a P-gp substrate, in vivo. The important observations: the cholesterol lowering and increased brain P-gp efflux activity properties suggest that VDR is a therapeutic target for treatment of hypercholesterolemia and Alzheimer’s diseases, since beta amyloid, precursors of plague, are P-gp substrates.