Por mais de 30 anos, a utilização do meio de cultura, enriquecido com soro bovino, e de fibroblastos murinos, com a taxa de proliferação controlada por irradiação ou por ação de drogas anti-cancerígenas, vem desempenhando com sucesso o seu papel de auxiliar no desenvolvimento dos queratinócitos em cultura, para fins clínicos. Porém, atualmente há uma preocupação crescente acerca da possibilidade de transmissão de príons e virose animais, aos pacientes transplantados. Levando em conta esta preocupação, o presente trabalho tem como objetivo cultivar fibroblastos humanos em meio enriquecido com lisado de plaquetas humanas e determinar a dose de irradiação dessas células, para obtenção da camada de sustentação na cultura de células da epiderme. Para realização do objetivo proposto, padronizamos a lise das plaquetas, utilizamos este lisado para cultivar os fibroblastos humanos e verificamos a dose de irradiação suficiente para inibir sua duplicação. Queratinócitos humanos foram cultivados nestas camadas de sustentação, em meio de cultura suplementado com o lisado. Com os resultados obtidos concluímos que o lisado de plaquetas a 10% promoveu uma melhor adesão e proliferação dos fibroblastos humanos e em todas as doses testadas (60 a 300 Gy), estes tiveram as suas atividades mitóticas inativadas pela radiação ionizante, sendo que as camadas de sustentação obtidas com doses de 70 a 150 Gy foram as que proporcionaram o melhor desenvolvimento dos queratinócitos em meio contendo 2,5% de lisado de plaquetas humanas. Portanto, foi possível padronizar, tanto o cultivo dos fibroblastos humanos, quanto sua inativação para utilização como camada de sustentação na cultura de queratinócitos, de maneira a eliminar os componentes xenobióticos. / For over 30 years, the use of culture medium, enriched with bovine serum, and murines fibroblasts, with the rate of proliferation controlled by irradiation or by share anticarcinogenic drugs, has been playing successfully its role in assisting in the development of keratinocytes in culture, for clinical purposes. However, currently there is a growing concern about the possibility of transmitting prions and animals viruses to transplanted patients. Taking into account this concern, the present work aims to cultivate human fibroblasts in a medium enriched with human platelets lysate and determine the irradiation dose of these cells, for obtaining feeder layer in epidermal cell culture. For carrying out the proposed objective, platelets lysis has standardized, this lysate was used for human fibroblasts cultivation and the irradiation dose enough to inhibit its duplication was evaluated. Human keratinocytes were cultivated in these feeder layers, in culture medium enriched with the lysate. With these results we conclude that the 10% platelets lysate promoted a better adhesion and proliferation of human fibroblasts and in all dose levels tested (60 to 300 Gy), these had their mitotic activity inactivated by ionizing irradiation, being that the feeder layers obtained with doses from 70 to 150 Gy were those that provided the best development of keratinocytes in medium containing 2.5% of human platelet lysate. Therefore, it was possible to standardize both the cultivation of human fibroblasts as its inactivation for use as feeder layer in culture of keratinocytes, so as to eliminate xenobiotics components.

Por mais de 30 anos, a utilização do meio de cultura, enriquecido com soro bovino, e de fibroblastos murinos, com a taxa de proliferação controlada por irradiação ou por ação de drogas anti-cancerígenas, vem desempenhando com sucesso o seu papel de auxiliar no desenvolvimento dos queratinócitos em cultura, para fins clínicos. Porém, atualmente há uma preocupação crescente acerca da possibilidade de transmissão de príons e virose animais, aos pacientes transplantados. Levando em conta esta preocupação, o presente trabalho tem como objetivo cultivar fibroblastos humanos em meio enriquecido com lisado de plaquetas humanas e determinar a dose de irradiação dessas células, para obtenção da camada de sustentação na cultura de células da epiderme. Para realização do objetivo proposto, padronizamos a lise das plaquetas, utilizamos este lisado para cultivar os fibroblastos humanos e verificamos a dose de irradiação suficiente para inibir sua duplicação. Queratinócitos humanos foram cultivados nestas camadas de sustentação, em meio de cultura suplementado com o lisado. Com os resultados obtidos concluímos que o lisado de plaquetas a 10% promoveu uma melhor adesão e proliferação dos fibroblastos humanos e em todas as doses testadas (60 a 300 Gy), estes tiveram as suas atividades mitóticas inativadas pela radiação ionizante, sendo que as camadas de sustentação obtidas com doses de 70 a 150 Gy foram as que proporcionaram o melhor desenvolvimento dos queratinócitos em meio contendo 2,5% de lisado de plaquetas humanas. Portanto, foi possível padronizar, tanto o cultivo dos fibroblastos humanos, quanto sua inativação para utilização como camada de sustentação na cultura de queratinócitos, de maneira a eliminar os componentes xenobióticos. / For over 30 years, the use of culture medium, enriched with bovine serum, and murines fibroblasts, with the rate of proliferation controlled by irradiation or by share anticarcinogenic drugs, has been playing successfully its role in assisting in the development of keratinocytes in culture, for clinical purposes. However, currently there is a growing concern about the possibility of transmitting prions and animals viruses to transplanted patients. Taking into account this concern, the present work aims to cultivate human fibroblasts in a medium enriched with human platelets lysate and determine the irradiation dose of these cells, for obtaining feeder layer in epidermal cell culture. For carrying out the proposed objective, platelets lysis has standardized, this lysate was used for human fibroblasts cultivation and the irradiation dose enough to inhibit its duplication was evaluated. Human keratinocytes were cultivated in these feeder layers, in culture medium enriched with the lysate. With these results we conclude that the 10% platelets lysate promoted a better adhesion and proliferation of human fibroblasts and in all dose levels tested (60 to 300 Gy), these had their mitotic activity inactivated by ionizing irradiation, being that the feeder layers obtained with doses from 70 to 150 Gy were those that provided the best development of keratinocytes in medium containing 2.5% of human platelet lysate. Therefore, it was possible to standardize both the cultivation of human fibroblasts as its inactivation for use as feeder layer in culture of keratinocytes, so as to eliminate xenobiotics components.

Submitted by biblioteca unifenas (biblioteca@unifenas.br) on 2018-03-05T22:12:22Z No. of bitstreams: 1 Sávio Carneiro Martins Dissertacao.pdf: 1917056 bytes, checksum: 1e6b06de6f8c419963c162ad0230fffa (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-05T22:12:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sávio Carneiro Martins Dissertacao.pdf: 1917056 bytes, checksum: 1e6b06de6f8c419963c162ad0230fffa (MD5) Previous issue date: 2015-03-30 / Due to the importance of in vitro embryo production (IVEP) to accelerate genetic improvement is important the search for technological innovation that can enhance the in vitro embryo development. Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) have been widely used as a feeder layer to support embryonic stem cells due to their release of growth factors. Mesenchymal stem cells (MSCs) from different sources were also found to release bioactive factors that can support cell growth. This study aims to investigate the effect of co-culture of MSC from rat bone marrow or MEF as a feeder source for in vitro production of bovine embryos. Cumulus oophorus complexes were matured into three groups: control (CTRL), co-culture with monolayer of mesenchymal cells of rats (MSC) or co-cultured with monolayer of embryonic fibroblasts of mice (MEF). Fertilization was performed in control condition for all groups, and in vitro fertilized embryos were cultured from fourth day on in CTRL, co-culture with MSC or co-cultured with MEF, so that the following groups were performed: (CTRL / CTRL) - maturation and embryo development in CTRL conditions; (CTRL / MSC) - maturation in CTRL and embryo development with MSC from the fourth day on after the beginning of the in vitro embryo culture; (CTRL / MEF) - maturation CTRL and embryo development with MEF from the fourth day on after the beginning of the in vitro embryo culture; (MSC / CTRL) - MSC during maturation and embryo development in CTRL; (MSC / MSC) - maturation and embryo development in MSC from the fourth day on after the beginning of the in vitro embryo culture; (MEF / CTRL) - maturation and embryo development in MEF and CTRL (MEF / MEF) - maturation and embryo development in MEF from the fourth day on after the beginning of embryo development in vitro. No significant difference was found among the oocytes matured in CTRL, MSC and MEF conditions for metaphase II and apoptosis rates and for cleavage rate in embryos at 4th day after the beginning of the in vitro culture. The number of cells in the inner cell mass, trophoblast cells, apoptotic cells and total cells were similar (P> 0.05) in the embryos from all experimental groups. The rates of blastocyst formation, expanded, hatched and the total of blastocysts did not differ among experimental groups (P> 0.05) at 7th day of embryo development. At eighth day of embryo culture we observed a difference (P <0.05) in hatched blastocyst rate which was higher in the CTRL /CTRL group when compared to MSC/MSC group, however, the proportion of blastocyst, expanded and total blastocysts was not different (P> 0.05). We conclude that there was no significant improvement in bovine embryo development using co-cultures of MSC from rats or MEF when compared to control culture system. However more studies investigating the use of stem cells from other sources or their conditioned medium are needed to better understand the effect of these cells on embryonic development. / Diante da importância da produção in vitro de embriões (PIVE) na expansão do melhoramento genético, é importante a busca de inovações tecnológicas que possam potencializar o desenvolvimento embrionário in vitro. Fibroblastos embrionários de camundongo (MEFs) têm sido amplamente utilizados como camada alimentadora para suportar as células-tronco embrionárias, devido à sua liberação de fatores de crescimento. As células-tronco mesenquimais (MSCs) identificadas a partir de diferentes fontes, também liberam fatores bioativos que possam suportar o crescimento celular. Este estudo tem como objetivo investigar o efeito da co-cultura de MSC de medula óssea de rato ou MEF como fonte alimentadora na produção in vitro de embriões bovinos. Complexo cumulus oophorus foram maturados em três grupos distintos: Controle (CTRL), co-cultura com monocamada de células mesenquimais de ratos (MSC) ou co-cultura com monocamada de fibroblastos embrionários de camundongos (MEF). A fecundação foi realizada em condição controle para todos os grupos e os embriões fecundados in vitro foram também cultivados a partir do quarto dia em CTRL, co-cultura com MSC ou co-cultura com MEF, formando os seguintes grupos experimentais: (CTRL/CTRL) – maturação e cultivo embrionário em condições CTRL; (CTRL/MSC) – maturação em CTRL e cultivo embrionário em MSC a partir do quarto dia após o início do cultivo embrionário in vitro; (CTRL/MEF) – maturação em CTRL e cultivo embrionário em MEF a partir do quarto dia após o início do cultivo embrionário in vitro; (MSC/CTRL) – maturação em MSC e cultivo embrionário em CTRL; (MSC/MSC) – maturação e cultivo embrionário em MSC a partir do quarto dia após o início do cultivo embrionário in vitro; (MEF/CTRL) – maturação em MEF e cultivo embrionário em CTRL e (MEF/MEF) – maturação e cultivo embrionário em MEF a partir do quarto dia após o início do cultivo embrionário in vitro. Nenhuma diferença significativa foi encontrada entre os oócitos dos grupos CTRL, MSC e MEF, na taxa de estruturas em metáfase II, apoptose e clivagem nos embriões de 4 dias após o início do cultivo in vitro. O número de células da massa celular interna, células do trofoblasto, células em apoptose e células totais foram iguais (P>0,05) entre os embriões dos diferentes grupos experimentais. As taxas de embriões em estágio de blastocisto, blastocisto expandido, blastocisto eclodido e blastocistos totais dos grupos experimentais não se diferiram (P>0,05) no sétimo dia de cultivo embrionário. No oitavo dia de cultivo embrionário houve diferença (P<0,05) da taxa de blastocisto eclodido, sendo maior no grupo CTRL/CTRL quando comparado ao grupo MSC/MSC; no entanto, a proporção de blastocisto, blastocisto expandido e blastocistos totais não foram diferentes (P>0,05) entre os grupos experimentais. Concluímos que não houve melhora significativa no desenvolvimento embrionário bovino utilizando co-culturas com MSC de ratos ou MEF de camundongos, quando comparado com sistema de cultura controle. Entretanto, mais estudos investigando o uso de células-tronco de outras fontes ou seu meio condicionado são necessários para se entender melhor o efeito destas células no desenvolvimento embrionário.