Este trabalho objetivou coletar e isolar fungos filamentosos de diferentes regiões do estado de São Paulo com potenciais para produção de enzimas amilolíticas com características físico-químicas desejáveis para aplicação industrial. Foram coletados 19 fungos nas três coletas realizadas e estes juntamente com outros cinco fungos, isolados anteriormente durante o projeto Biota/FAPESP, foram submetidos a uma seleção para a escolha do melhor produtor de amilases. Aspergillus niveus foi o que melhor produziu amilases nas condições avaliadas e foi tomado para dar continuidade ao trabalho. A etapa seguinte consistiu em avaliar as melhores condições de cultivo para a produção das amilases. Os maiores níveis de atividade enzimática foram detectados em meio Khanna, em cultivos estáticos, pH inicial 6,0, a 40°C, com 72 horas de crescimento. Milho moído, farinha de aveia, palha de arroz, maisena, amido solúvel, casca de mandioca, maltose, farelo de trigo, penetrose, amilopectina e rafinose foram as fontes de carbono que melhor induziram a síntese de amilases. Extratos enzimáticos de A. niveus obtidos sob condições ótimas de cultivo, foram submetidos a eluição em diferentes colunas cromatográficas (DEAE-Fragtogel e Sephacryl S-200) e três amilases foram purificadas (uma glucoamilase e 2 a-glucosidases- I e II), cujas massas moleculares determinadas por SDS-PAGE corresponderam à 77, 59 e 55 kDa. Os pontos isoelétricos e o conteúdo de carboidrato corresponderam respectivamente a de 3,8 e 15% para glucoamilase, 6,6 e 4% para a-glucosidase I e 6,8 e 29% para a- glucosidase II. O pH ótimo para atividade de glucoamilase foi de 5,0-5,5 e pH 6,0 para a atividade de a-glucosidase I e II. A temperatura ótima para as três enzimas foi de 65°C e as mesmas apresentaram boa estabilidade a 60 e 65°C. A glucoamilase apresentou alta afinidade para o amido, já a a-glucosidase I apresentou alta afinidade para amido, glicogênio e maltose. A maior eficiência catalítica foi verificada na presença de VII glicogênio, seguido de amido e maltose. A a-glucosidase II apresentou atividade sobre vários substratos e os valores de Kcat/Km obtidos mostraram maior preferência dessa enzima pelo glicogênio, seguido de amido, amilopectina, maltose e -NPG. A análise de Dicroísmo Circular demonstrou que as três amilases são ricas em a-hélices nas suas estruturas secundárias e o sequenciamento de aminoácidos revelou similaridade da glucoamilase de A. niveus com glucoamilases de A. terreus, A. niger, A. ficcum, A. awamori, A. kawachi e A. shirousami. O sequenciamento das a-glucosidases I e II revelaram homologia destas com a-glucosidase de A. fumigatus. Estudos do efeito de N-glicanas nas propriedades das enzimas foram avaliados mediante tratamento do meio de cultivo com tunicamicina. A glucoamilase e a a-glucosidase I perderam significativamente a especificidade pelo substrato, já a a-glucosidase II perdeu termoestabilidade com a remoção das N-glicanas. Glucoamilase e a-glucosidase II foram imobilizadas em suportes com interação iônica e por ligação covalente. Os suportes trocadores iônicos usados foram Glioxil-PEI, Glioxil-MANAE, DEAESephacel e Sepharose Q. Os suportes utilizados para interação covalente foram agarose ativada com brometo de cianogênio (BrCN) e Glioxil-Agarose, pH 10,5. A estabilidade apresentada com os derivados formados por ligações covalentes foi maior que aquela apresentada para os derivados formados a partir de ligações iônicas. O uso da trealose como aditivo aumentou significativamente a estabilidade de todos os derivados / This study aimed to collect and isolate filamentous fungi from different regions of São Paulo state with potential for amylases production with desirable physical and chemical characteristics for industrial application. It was collected 19 fungi during three different expeditions. These fungi with other five microorganisms previously isolated during the Biota project were submitted to screening tests to select a good amylases producer. Aspergillus niveus was one of the best amylase producers under experimental conditions and was chosen to continue this work. The next step was to determine the best growth conditions for the amylases production. The highest levels of enzymatic synthesis were detected in Khanna medium under static conditions, initial pH 6.0, at 40°C during 72 hours. Corn, oatmeal, rice straw, corn starch, soluble starch, cassava peel, maltose, wheat bran, penetrose, amylopectin and raffinose were the best carbon sources for amylase production. Enzymatic extracts from A. niveus obtained under the optimal culture conditions, were loaded in different chromatography columns (DEAE-Fragtogel and Sephacryl S200) where three amylases were purified (a glucoamylase and two a-glucosidases, named I and II), whose molecular weights determined by SDS-PAGE corresponded to 77, 59 and 55 kDa. The isoelectric points and carbohydrate content were 3.8 and 15% for glucoamylase, 6.6 and 4% for -glucosidase I and 6.8 and 29% for -glucosidase II, respectively. The glucoamylase optimum pH was 5.0-5.5 and 6.0 for -glucosidases I and II. The optimum reaction temperatures were 65° C for all studied enzymes and all of them showed stability at 60 and 65°C. The glucoamylase presented high affinity for starch and -glucosidase I presented high affinity for starch, glycogen and maltose. The highest catalytic efficiency was observed using glycogen, starch and maltose as substrates. The -glucosidase II hydrolyzed several substrates and the kcat/Km values showed greater performance under glycogen, followed by starch, amylopectin, maltose and -NPG hydrolysis. The Circular Dichroism (CD) analyses showed that all the studied amylases were predominantly constituted by -helices in its secondary structure. The amino acid sequencing revealed similarity among the glucoamylase from A. niveus, A. terreus, A. niger, A. ficcum, A. awamori, A. kawachi and A. shirousami. Comparing the sequencing of a-glucosidases I and II from A. niveus, both showed homology with other a-glucosidases from A. fumigatus. Studies about the effect of N-glycans under enzymatic properties were done by addition of tunicamycin in the culture medium. Glucoamylase and a-glucosidase I lost significantly their substrate specificity, and a- glucosidase II lost its thermostability after the N-glycans removal. Glucoamylase and a- glucosidase II were immobilized in ionic interaction supporters and by covalent bonds. The ion exchangers supporters used were glyoxylic-PEI, glyoxylic-MANA, DEAESephacel and Sepharose Q. The supporters used for covalent interaction were agarose activated with cyanogen bromide (BRCN) and glyoxylic-Agarose, pH 10.5. The stability presented with derivatives formed by covalent bonds was higher than those reported for the derivatives formed from ionic bonds. The use of trehalose as an additive really improved the stability of all derivatives.

Este trabalho objetivou coletar e isolar fungos filamentosos de diferentes regiões do estado de São Paulo com potenciais para produção de enzimas amilolíticas com características físico-químicas desejáveis para aplicação industrial. Foram coletados 19 fungos nas três coletas realizadas e estes juntamente com outros cinco fungos, isolados anteriormente durante o projeto Biota/FAPESP, foram submetidos a uma seleção para a escolha do melhor produtor de amilases. Aspergillus niveus foi o que melhor produziu amilases nas condições avaliadas e foi tomado para dar continuidade ao trabalho. A etapa seguinte consistiu em avaliar as melhores condições de cultivo para a produção das amilases. Os maiores níveis de atividade enzimática foram detectados em meio Khanna, em cultivos estáticos, pH inicial 6,0, a 40°C, com 72 horas de crescimento. Milho moído, farinha de aveia, palha de arroz, maisena, amido solúvel, casca de mandioca, maltose, farelo de trigo, penetrose, amilopectina e rafinose foram as fontes de carbono que melhor induziram a síntese de amilases. Extratos enzimáticos de A. niveus obtidos sob condições ótimas de cultivo, foram submetidos a eluição em diferentes colunas cromatográficas (DEAE-Fragtogel e Sephacryl S-200) e três amilases foram purificadas (uma glucoamilase e 2 a-glucosidases- I e II), cujas massas moleculares determinadas por SDS-PAGE corresponderam à 77, 59 e 55 kDa. Os pontos isoelétricos e o conteúdo de carboidrato corresponderam respectivamente a de 3,8 e 15% para glucoamilase, 6,6 e 4% para a-glucosidase I e 6,8 e 29% para a- glucosidase II. O pH ótimo para atividade de glucoamilase foi de 5,0-5,5 e pH 6,0 para a atividade de a-glucosidase I e II. A temperatura ótima para as três enzimas foi de 65°C e as mesmas apresentaram boa estabilidade a 60 e 65°C. A glucoamilase apresentou alta afinidade para o amido, já a a-glucosidase I apresentou alta afinidade para amido, glicogênio e maltose. A maior eficiência catalítica foi verificada na presença de VII glicogênio, seguido de amido e maltose. A a-glucosidase II apresentou atividade sobre vários substratos e os valores de Kcat/Km obtidos mostraram maior preferência dessa enzima pelo glicogênio, seguido de amido, amilopectina, maltose e -NPG. A análise de Dicroísmo Circular demonstrou que as três amilases são ricas em a-hélices nas suas estruturas secundárias e o sequenciamento de aminoácidos revelou similaridade da glucoamilase de A. niveus com glucoamilases de A. terreus, A. niger, A. ficcum, A. awamori, A. kawachi e A. shirousami. O sequenciamento das a-glucosidases I e II revelaram homologia destas com a-glucosidase de A. fumigatus. Estudos do efeito de N-glicanas nas propriedades das enzimas foram avaliados mediante tratamento do meio de cultivo com tunicamicina. A glucoamilase e a a-glucosidase I perderam significativamente a especificidade pelo substrato, já a a-glucosidase II perdeu termoestabilidade com a remoção das N-glicanas. Glucoamilase e a-glucosidase II foram imobilizadas em suportes com interação iônica e por ligação covalente. Os suportes trocadores iônicos usados foram Glioxil-PEI, Glioxil-MANAE, DEAESephacel e Sepharose Q. Os suportes utilizados para interação covalente foram agarose ativada com brometo de cianogênio (BrCN) e Glioxil-Agarose, pH 10,5. A estabilidade apresentada com os derivados formados por ligações covalentes foi maior que aquela apresentada para os derivados formados a partir de ligações iônicas. O uso da trealose como aditivo aumentou significativamente a estabilidade de todos os derivados / This study aimed to collect and isolate filamentous fungi from different regions of São Paulo state with potential for amylases production with desirable physical and chemical characteristics for industrial application. It was collected 19 fungi during three different expeditions. These fungi with other five microorganisms previously isolated during the Biota project were submitted to screening tests to select a good amylases producer. Aspergillus niveus was one of the best amylase producers under experimental conditions and was chosen to continue this work. The next step was to determine the best growth conditions for the amylases production. The highest levels of enzymatic synthesis were detected in Khanna medium under static conditions, initial pH 6.0, at 40°C during 72 hours. Corn, oatmeal, rice straw, corn starch, soluble starch, cassava peel, maltose, wheat bran, penetrose, amylopectin and raffinose were the best carbon sources for amylase production. Enzymatic extracts from A. niveus obtained under the optimal culture conditions, were loaded in different chromatography columns (DEAE-Fragtogel and Sephacryl S200) where three amylases were purified (a glucoamylase and two a-glucosidases, named I and II), whose molecular weights determined by SDS-PAGE corresponded to 77, 59 and 55 kDa. The isoelectric points and carbohydrate content were 3.8 and 15% for glucoamylase, 6.6 and 4% for -glucosidase I and 6.8 and 29% for -glucosidase II, respectively. The glucoamylase optimum pH was 5.0-5.5 and 6.0 for -glucosidases I and II. The optimum reaction temperatures were 65° C for all studied enzymes and all of them showed stability at 60 and 65°C. The glucoamylase presented high affinity for starch and -glucosidase I presented high affinity for starch, glycogen and maltose. The highest catalytic efficiency was observed using glycogen, starch and maltose as substrates. The -glucosidase II hydrolyzed several substrates and the kcat/Km values showed greater performance under glycogen, followed by starch, amylopectin, maltose and -NPG hydrolysis. The Circular Dichroism (CD) analyses showed that all the studied amylases were predominantly constituted by -helices in its secondary structure. The amino acid sequencing revealed similarity among the glucoamylase from A. niveus, A. terreus, A. niger, A. ficcum, A. awamori, A. kawachi and A. shirousami. Comparing the sequencing of a-glucosidases I and II from A. niveus, both showed homology with other a-glucosidases from A. fumigatus. Studies about the effect of N-glycans under enzymatic properties were done by addition of tunicamycin in the culture medium. Glucoamylase and a-glucosidase I lost significantly their substrate specificity, and a- glucosidase II lost its thermostability after the N-glycans removal. Glucoamylase and a- glucosidase II were immobilized in ionic interaction supporters and by covalent bonds. The ion exchangers supporters used were glyoxylic-PEI, glyoxylic-MANA, DEAESephacel and Sepharose Q. The supporters used for covalent interaction were agarose activated with cyanogen bromide (BRCN) and glyoxylic-Agarose, pH 10.5. The stability presented with derivatives formed by covalent bonds was higher than those reported for the derivatives formed from ionic bonds. The use of trehalose as an additive really improved the stability of all derivatives.