Este trabalho objetivou coletar e isolar fungos filamentosos de diferentes regiões do estado de São Paulo com potenciais para produção de enzimas amilolíticas com características físico-químicas desejáveis para aplicação industrial. Foram coletados 19 fungos nas três coletas realizadas e estes juntamente com outros cinco fungos, isolados anteriormente durante o projeto Biota/FAPESP, foram submetidos a uma seleção para a escolha do melhor produtor de amilases. Aspergillus niveus foi o que melhor produziu amilases nas condições avaliadas e foi tomado para dar continuidade ao trabalho. A etapa seguinte consistiu em avaliar as melhores condições de cultivo para a produção das amilases. Os maiores níveis de atividade enzimática foram detectados em meio Khanna, em cultivos estáticos, pH inicial 6,0, a 40°C, com 72 horas de crescimento. Milho moído, farinha de aveia, palha de arroz, maisena, amido solúvel, casca de mandioca, maltose, farelo de trigo, penetrose, amilopectina e rafinose foram as fontes de carbono que melhor induziram a síntese de amilases. Extratos enzimáticos de A. niveus obtidos sob condições ótimas de cultivo, foram submetidos a eluição em diferentes colunas cromatográficas (DEAE-Fragtogel e Sephacryl S-200) e três amilases foram purificadas (uma glucoamilase e 2 a-glucosidases- I e II), cujas massas moleculares determinadas por SDS-PAGE corresponderam à 77, 59 e 55 kDa. Os pontos isoelétricos e o conteúdo de carboidrato corresponderam respectivamente a de 3,8 e 15% para glucoamilase, 6,6 e 4% para a-glucosidase I e 6,8 e 29% para a- glucosidase II. O pH ótimo para atividade de glucoamilase foi de 5,0-5,5 e pH 6,0 para a atividade de a-glucosidase I e II. A temperatura ótima para as três enzimas foi de 65°C e as mesmas apresentaram boa estabilidade a 60 e 65°C. A glucoamilase apresentou alta afinidade para o amido, já a a-glucosidase I apresentou alta afinidade para amido, glicogênio e maltose. A maior eficiência catalítica foi verificada na presença de VII glicogênio, seguido de amido e maltose. A a-glucosidase II apresentou atividade sobre vários substratos e os valores de Kcat/Km obtidos mostraram maior preferência dessa enzima pelo glicogênio, seguido de amido, amilopectina, maltose e -NPG. A análise de Dicroísmo Circular demonstrou que as três amilases são ricas em a-hélices nas suas estruturas secundárias e o sequenciamento de aminoácidos revelou similaridade da glucoamilase de A. niveus com glucoamilases de A. terreus, A. niger, A. ficcum, A. awamori, A. kawachi e A. shirousami. O sequenciamento das a-glucosidases I e II revelaram homologia destas com a-glucosidase de A. fumigatus. Estudos do efeito de N-glicanas nas propriedades das enzimas foram avaliados mediante tratamento do meio de cultivo com tunicamicina. A glucoamilase e a a-glucosidase I perderam significativamente a especificidade pelo substrato, já a a-glucosidase II perdeu termoestabilidade com a remoção das N-glicanas. Glucoamilase e a-glucosidase II foram imobilizadas em suportes com interação iônica e por ligação covalente. Os suportes trocadores iônicos usados foram Glioxil-PEI, Glioxil-MANAE, DEAESephacel e Sepharose Q. Os suportes utilizados para interação covalente foram agarose ativada com brometo de cianogênio (BrCN) e Glioxil-Agarose, pH 10,5. A estabilidade apresentada com os derivados formados por ligações covalentes foi maior que aquela apresentada para os derivados formados a partir de ligações iônicas. O uso da trealose como aditivo aumentou significativamente a estabilidade de todos os derivados / This study aimed to collect and isolate filamentous fungi from different regions of São Paulo state with potential for amylases production with desirable physical and chemical characteristics for industrial application. It was collected 19 fungi during three different expeditions. These fungi with other five microorganisms previously isolated during the Biota project were submitted to screening tests to select a good amylases producer. Aspergillus niveus was one of the best amylase producers under experimental conditions and was chosen to continue this work. The next step was to determine the best growth conditions for the amylases production. The highest levels of enzymatic synthesis were detected in Khanna medium under static conditions, initial pH 6.0, at 40°C during 72 hours. Corn, oatmeal, rice straw, corn starch, soluble starch, cassava peel, maltose, wheat bran, penetrose, amylopectin and raffinose were the best carbon sources for amylase production. Enzymatic extracts from A. niveus obtained under the optimal culture conditions, were loaded in different chromatography columns (DEAE-Fragtogel and Sephacryl S200) where three amylases were purified (a glucoamylase and two a-glucosidases, named I and II), whose molecular weights determined by SDS-PAGE corresponded to 77, 59 and 55 kDa. The isoelectric points and carbohydrate content were 3.8 and 15% for glucoamylase, 6.6 and 4% for -glucosidase I and 6.8 and 29% for -glucosidase II, respectively. The glucoamylase optimum pH was 5.0-5.5 and 6.0 for -glucosidases I and II. The optimum reaction temperatures were 65° C for all studied enzymes and all of them showed stability at 60 and 65°C. The glucoamylase presented high affinity for starch and -glucosidase I presented high affinity for starch, glycogen and maltose. The highest catalytic efficiency was observed using glycogen, starch and maltose as substrates. The -glucosidase II hydrolyzed several substrates and the kcat/Km values showed greater performance under glycogen, followed by starch, amylopectin, maltose and -NPG hydrolysis. The Circular Dichroism (CD) analyses showed that all the studied amylases were predominantly constituted by -helices in its secondary structure. The amino acid sequencing revealed similarity among the glucoamylase from A. niveus, A. terreus, A. niger, A. ficcum, A. awamori, A. kawachi and A. shirousami. Comparing the sequencing of a-glucosidases I and II from A. niveus, both showed homology with other a-glucosidases from A. fumigatus. Studies about the effect of N-glycans under enzymatic properties were done by addition of tunicamycin in the culture medium. Glucoamylase and a-glucosidase I lost significantly their substrate specificity, and a- glucosidase II lost its thermostability after the N-glycans removal. Glucoamylase and a- glucosidase II were immobilized in ionic interaction supporters and by covalent bonds. The ion exchangers supporters used were glyoxylic-PEI, glyoxylic-MANA, DEAESephacel and Sepharose Q. The supporters used for covalent interaction were agarose activated with cyanogen bromide (BRCN) and glyoxylic-Agarose, pH 10.5. The stability presented with derivatives formed by covalent bonds was higher than those reported for the derivatives formed from ionic bonds. The use of trehalose as an additive really improved the stability of all derivatives.

Este trabalho objetivou coletar e isolar fungos filamentosos de diferentes regiões do estado de São Paulo com potenciais para produção de enzimas amilolíticas com características físico-químicas desejáveis para aplicação industrial. Foram coletados 19 fungos nas três coletas realizadas e estes juntamente com outros cinco fungos, isolados anteriormente durante o projeto Biota/FAPESP, foram submetidos a uma seleção para a escolha do melhor produtor de amilases. Aspergillus niveus foi o que melhor produziu amilases nas condições avaliadas e foi tomado para dar continuidade ao trabalho. A etapa seguinte consistiu em avaliar as melhores condições de cultivo para a produção das amilases. Os maiores níveis de atividade enzimática foram detectados em meio Khanna, em cultivos estáticos, pH inicial 6,0, a 40°C, com 72 horas de crescimento. Milho moído, farinha de aveia, palha de arroz, maisena, amido solúvel, casca de mandioca, maltose, farelo de trigo, penetrose, amilopectina e rafinose foram as fontes de carbono que melhor induziram a síntese de amilases. Extratos enzimáticos de A. niveus obtidos sob condições ótimas de cultivo, foram submetidos a eluição em diferentes colunas cromatográficas (DEAE-Fragtogel e Sephacryl S-200) e três amilases foram purificadas (uma glucoamilase e 2 a-glucosidases- I e II), cujas massas moleculares determinadas por SDS-PAGE corresponderam à 77, 59 e 55 kDa. Os pontos isoelétricos e o conteúdo de carboidrato corresponderam respectivamente a de 3,8 e 15% para glucoamilase, 6,6 e 4% para a-glucosidase I e 6,8 e 29% para a- glucosidase II. O pH ótimo para atividade de glucoamilase foi de 5,0-5,5 e pH 6,0 para a atividade de a-glucosidase I e II. A temperatura ótima para as três enzimas foi de 65°C e as mesmas apresentaram boa estabilidade a 60 e 65°C. A glucoamilase apresentou alta afinidade para o amido, já a a-glucosidase I apresentou alta afinidade para amido, glicogênio e maltose. A maior eficiência catalítica foi verificada na presença de VII glicogênio, seguido de amido e maltose. A a-glucosidase II apresentou atividade sobre vários substratos e os valores de Kcat/Km obtidos mostraram maior preferência dessa enzima pelo glicogênio, seguido de amido, amilopectina, maltose e -NPG. A análise de Dicroísmo Circular demonstrou que as três amilases são ricas em a-hélices nas suas estruturas secundárias e o sequenciamento de aminoácidos revelou similaridade da glucoamilase de A. niveus com glucoamilases de A. terreus, A. niger, A. ficcum, A. awamori, A. kawachi e A. shirousami. O sequenciamento das a-glucosidases I e II revelaram homologia destas com a-glucosidase de A. fumigatus. Estudos do efeito de N-glicanas nas propriedades das enzimas foram avaliados mediante tratamento do meio de cultivo com tunicamicina. A glucoamilase e a a-glucosidase I perderam significativamente a especificidade pelo substrato, já a a-glucosidase II perdeu termoestabilidade com a remoção das N-glicanas. Glucoamilase e a-glucosidase II foram imobilizadas em suportes com interação iônica e por ligação covalente. Os suportes trocadores iônicos usados foram Glioxil-PEI, Glioxil-MANAE, DEAESephacel e Sepharose Q. Os suportes utilizados para interação covalente foram agarose ativada com brometo de cianogênio (BrCN) e Glioxil-Agarose, pH 10,5. A estabilidade apresentada com os derivados formados por ligações covalentes foi maior que aquela apresentada para os derivados formados a partir de ligações iônicas. O uso da trealose como aditivo aumentou significativamente a estabilidade de todos os derivados / This study aimed to collect and isolate filamentous fungi from different regions of São Paulo state with potential for amylases production with desirable physical and chemical characteristics for industrial application. It was collected 19 fungi during three different expeditions. These fungi with other five microorganisms previously isolated during the Biota project were submitted to screening tests to select a good amylases producer. Aspergillus niveus was one of the best amylase producers under experimental conditions and was chosen to continue this work. The next step was to determine the best growth conditions for the amylases production. The highest levels of enzymatic synthesis were detected in Khanna medium under static conditions, initial pH 6.0, at 40°C during 72 hours. Corn, oatmeal, rice straw, corn starch, soluble starch, cassava peel, maltose, wheat bran, penetrose, amylopectin and raffinose were the best carbon sources for amylase production. Enzymatic extracts from A. niveus obtained under the optimal culture conditions, were loaded in different chromatography columns (DEAE-Fragtogel and Sephacryl S200) where three amylases were purified (a glucoamylase and two a-glucosidases, named I and II), whose molecular weights determined by SDS-PAGE corresponded to 77, 59 and 55 kDa. The isoelectric points and carbohydrate content were 3.8 and 15% for glucoamylase, 6.6 and 4% for -glucosidase I and 6.8 and 29% for -glucosidase II, respectively. The glucoamylase optimum pH was 5.0-5.5 and 6.0 for -glucosidases I and II. The optimum reaction temperatures were 65° C for all studied enzymes and all of them showed stability at 60 and 65°C. The glucoamylase presented high affinity for starch and -glucosidase I presented high affinity for starch, glycogen and maltose. The highest catalytic efficiency was observed using glycogen, starch and maltose as substrates. The -glucosidase II hydrolyzed several substrates and the kcat/Km values showed greater performance under glycogen, followed by starch, amylopectin, maltose and -NPG hydrolysis. The Circular Dichroism (CD) analyses showed that all the studied amylases were predominantly constituted by -helices in its secondary structure. The amino acid sequencing revealed similarity among the glucoamylase from A. niveus, A. terreus, A. niger, A. ficcum, A. awamori, A. kawachi and A. shirousami. Comparing the sequencing of a-glucosidases I and II from A. niveus, both showed homology with other a-glucosidases from A. fumigatus. Studies about the effect of N-glycans under enzymatic properties were done by addition of tunicamycin in the culture medium. Glucoamylase and a-glucosidase I lost significantly their substrate specificity, and a- glucosidase II lost its thermostability after the N-glycans removal. Glucoamylase and a- glucosidase II were immobilized in ionic interaction supporters and by covalent bonds. The ion exchangers supporters used were glyoxylic-PEI, glyoxylic-MANA, DEAESephacel and Sepharose Q. The supporters used for covalent interaction were agarose activated with cyanogen bromide (BRCN) and glyoxylic-Agarose, pH 10.5. The stability presented with derivatives formed by covalent bonds was higher than those reported for the derivatives formed from ionic bonds. The use of trehalose as an additive really improved the stability of all derivatives.

O método empregado na produção de fungos entomopatogênicos teve poucas alterações em mais de 40 anos de utilização no Brasil. A produção adotada nas biofábricas em larga escala é basicamente através da fermentação sólida em arroz com elevado uso de mão de obra e longo tempo de produção. Assim, o presente estudo consistiu em desenvolver estratégias que possam ser implementadas nas diferentes etapas do sistema de produção de Metarhizium anisopliae ESALQ1037, como adição ao arroz de materiais inertes (bagaço de cana-de-açúcar, maravalha, esponja vegetal e palha de arroz) e outros substratos (milheto, flocos de arroz e sagu) para separação dos grãos de arroz e aumento da aeração, uso de blastosporos como inóculo em sistemas bifásicos tendo como substrato sólido o arroz ou mistura de farelos (trigo, milho, aveia, arroz, soja e algodão) ou suportes de crescimento e esporulação (bagaço de cana-de-açúcar, vermiculita, tecido de lã, palha de arroz e maravalha). Foi testado o uso da esterilização por fervura em substituição à autoclavagem e recuperação de conídios por extração em água como substituto ao peneiramento, além de armazenamento em condições de alta e baixa temperatura e umidade: 97%UR e 22ºC; 97%UR e 4ºC; 0%UR e 22ºC; 0%UR e 4ºC. O meio líquido M11 (a base de 45g L-1 glicose e 36g L-1 extrato de levedura) foi o mais adequado para produção de blastosporos (3,0 x 108 blastosporos/mL) e biomassa. A inoculação de blastosporos em arroz resultou em produção maior e mais rápida de conídios (4,51 x 108 conídios/g) em 7 dias de crescimento fúngico. O farelo de trigo inoculado com blastosporos produzidos em meio M11 resultou em maior produção de conídios (1,2 x 109 conídios/g) quando comparado aos farelos e arroz inoculados com suspensão de conídios (máximo de 7,8 x 108 conídios/g). O bagaço de cana-de-açúcar autoclavado seco foi o suporte que resultou em maior produção do fungo quando associado ao meio líquido. A adição ao arroz de bagaço de cana-de-açúcar umedecido, maravalha e esponja vegetal não umedecidas promoveu incremento na produção de conídios (> 3,3 x 109 conídios/g) quando comparado ao arroz somente (1,00 x 109 conídios/g). A exposição do arroz à fervura por 10 e 15 minutos resultou em produção de conídios semelhante à produção em arroz autoclavado, sem a presença de contaminantes. Farelo de trigo foi o substrato mais promissor para produção do fungo especialmente quando misturado ao farelo de arroz (1,75 x 109 conídios/g) na fermentação sólida. Conídios extraídos do arroz por peneiramento ou lavagem em água e recuperados com ou sem a adição de argilas, terra de diatomácea e caulim apresentaram viabilidade superior a 92% após armazenamento por 60 dias a 22°C e 97% UR. A 22°C e 0% UR, somente os conídios extraídos do arroz por peneiramento e os extraídos em água e recuperados com a adição de argila preta e caulim apresentaram viabilidade superior a 92% após armazenamento por 60 dias. Estratégias testadas neste estudo para produção e extração de conídios de M. anisopliae são alternativas viáveis para serem incorporadas na produção em larga escala e reduzir o tempo de fermentação e mão de obra, aumentando a eficiência de conversão de substrato em conídios. / The method used in the production of entomopathogenic fungi had few changes in more than 40 years of use in Brasil. The production of large-scale biofactories is basically through solid fermentation in rice with high labor and long production time. Thus, the present study consisted in developing strategies that could be implemented in the different stages of the production system of Metarhizium anisopliae ESALQ1037, as addition to rice of inert materials (sugarcane bagasse, shavings, vegetable sponge, rice straw) and other substrates (millet, rice flakes and sago) for separation of rice grains and increased aeration, use of blastospores as inoculum in biphasic systems having as a solid substrate the rice or mixture of bran (wheat, corn, oats, rice, soybean and cotton) or growth and sporulation supports (sugarcane bagasse, vermiculite, wool, rice straw and shavings). The use of boiling sterilization to replace autoclaving and recovery of conidia by water extraction as a substitute for sieving was tested, as well as storage under high and low temperature and humidity conditions: 97% RH and 22 ºC; 97% RH and 4°C; 0% RH and 22°C; 0% RH and 4°C. The M11 liquid medium (the base of 45g L-1 glucose and 36g L-1 yeast extract) was the most suitable for the production of blastospores (3.0 x 108 blastospores / mL) and biomass. The inoculation of blastospores in rice resulted in larger and faster production of conidia (4.51 x 108 conidia / g) in 7 days of fungal growth. The wheat bran inoculated with blastospores produced in M11 medium resulted in higher conidia production (1.2 x 109 conidia / g) when compared to the bran and rice inoculated with conidial suspension (maximum of 7.8 x 108 conidia / g). The dried autoclaved sugarcane bagasse was the carrier that resulted in higher fungus production when associated with the liquid medium. The addition of moistened sugarcane bagasse and non-moistened shavings and vegetable sponges promoted increase in the production of conidia (> 3.3 x 109 conidia / g) when compared to rice only (1.0 x 109 conidia / g). Exposure of the boil rice for 10 and 15 minutes resulted in conidial production similar to the production in autoclaved rice without the presence of contaminants. Wheat bran was the most promising substrate for the fungus production especially when mixed with rice bran (1.75 x 109 conidia / g) in solid fermentation. Conidia extracted from rice by sieving or washing in water and recovered with or without the addition of clays, diatomaceous earth and kaolin showed viability higher than 92% after storage for 60 days at 22 °C and 97% RH. At 22 °C and 0% RH, only the conidia extracted from the rice by sieving and those extracted in water and recovered with the addition of black clays and kaolin had viability higher than 92% after storage for 60 days. Strategies tested in this study for the production and extraction of conidia of M. anisopliae are viable alternatives to be incorporated in the large scale production and to reduce the time of fermentation and manpower, to increasing the efficiency of conversion of substrate in conidia.

O método empregado na produção de fungos entomopatogênicos teve poucas alterações em mais de 40 anos de utilização no Brasil. A produção adotada nas biofábricas em larga escala é basicamente através da fermentação sólida em arroz com elevado uso de mão de obra e longo tempo de produção. Assim, o presente estudo consistiu em desenvolver estratégias que possam ser implementadas nas diferentes etapas do sistema de produção de Metarhizium anisopliae ESALQ1037, como adição ao arroz de materiais inertes (bagaço de cana-de-açúcar, maravalha, esponja vegetal e palha de arroz) e outros substratos (milheto, flocos de arroz e sagu) para separação dos grãos de arroz e aumento da aeração, uso de blastosporos como inóculo em sistemas bifásicos tendo como substrato sólido o arroz ou mistura de farelos (trigo, milho, aveia, arroz, soja e algodão) ou suportes de crescimento e esporulação (bagaço de cana-de-açúcar, vermiculita, tecido de lã, palha de arroz e maravalha). Foi testado o uso da esterilização por fervura em substituição à autoclavagem e recuperação de conídios por extração em água como substituto ao peneiramento, além de armazenamento em condições de alta e baixa temperatura e umidade: 97%UR e 22ºC; 97%UR e 4ºC; 0%UR e 22ºC; 0%UR e 4ºC. O meio líquido M11 (a base de 45g L-1 glicose e 36g L-1 extrato de levedura) foi o mais adequado para produção de blastosporos (3,0 x 108 blastosporos/mL) e biomassa. A inoculação de blastosporos em arroz resultou em produção maior e mais rápida de conídios (4,51 x 108 conídios/g) em 7 dias de crescimento fúngico. O farelo de trigo inoculado com blastosporos produzidos em meio M11 resultou em maior produção de conídios (1,2 x 109 conídios/g) quando comparado aos farelos e arroz inoculados com suspensão de conídios (máximo de 7,8 x 108 conídios/g). O bagaço de cana-de-açúcar autoclavado seco foi o suporte que resultou em maior produção do fungo quando associado ao meio líquido. A adição ao arroz de bagaço de cana-de-açúcar umedecido, maravalha e esponja vegetal não umedecidas promoveu incremento na produção de conídios (> 3,3 x 109 conídios/g) quando comparado ao arroz somente (1,00 x 109 conídios/g). A exposição do arroz à fervura por 10 e 15 minutos resultou em produção de conídios semelhante à produção em arroz autoclavado, sem a presença de contaminantes. Farelo de trigo foi o substrato mais promissor para produção do fungo especialmente quando misturado ao farelo de arroz (1,75 x 109 conídios/g) na fermentação sólida. Conídios extraídos do arroz por peneiramento ou lavagem em água e recuperados com ou sem a adição de argilas, terra de diatomácea e caulim apresentaram viabilidade superior a 92% após armazenamento por 60 dias a 22°C e 97% UR. A 22°C e 0% UR, somente os conídios extraídos do arroz por peneiramento e os extraídos em água e recuperados com a adição de argila preta e caulim apresentaram viabilidade superior a 92% após armazenamento por 60 dias. Estratégias testadas neste estudo para produção e extração de conídios de M. anisopliae são alternativas viáveis para serem incorporadas na produção em larga escala e reduzir o tempo de fermentação e mão de obra, aumentando a eficiência de conversão de substrato em conídios. / The method used in the production of entomopathogenic fungi had few changes in more than 40 years of use in Brasil. The production of large-scale biofactories is basically through solid fermentation in rice with high labor and long production time. Thus, the present study consisted in developing strategies that could be implemented in the different stages of the production system of Metarhizium anisopliae ESALQ1037, as addition to rice of inert materials (sugarcane bagasse, shavings, vegetable sponge, rice straw) and other substrates (millet, rice flakes and sago) for separation of rice grains and increased aeration, use of blastospores as inoculum in biphasic systems having as a solid substrate the rice or mixture of bran (wheat, corn, oats, rice, soybean and cotton) or growth and sporulation supports (sugarcane bagasse, vermiculite, wool, rice straw and shavings). The use of boiling sterilization to replace autoclaving and recovery of conidia by water extraction as a substitute for sieving was tested, as well as storage under high and low temperature and humidity conditions: 97% RH and 22 ºC; 97% RH and 4°C; 0% RH and 22°C; 0% RH and 4°C. The M11 liquid medium (the base of 45g L-1 glucose and 36g L-1 yeast extract) was the most suitable for the production of blastospores (3.0 x 108 blastospores / mL) and biomass. The inoculation of blastospores in rice resulted in larger and faster production of conidia (4.51 x 108 conidia / g) in 7 days of fungal growth. The wheat bran inoculated with blastospores produced in M11 medium resulted in higher conidia production (1.2 x 109 conidia / g) when compared to the bran and rice inoculated with conidial suspension (maximum of 7.8 x 108 conidia / g). The dried autoclaved sugarcane bagasse was the carrier that resulted in higher fungus production when associated with the liquid medium. The addition of moistened sugarcane bagasse and non-moistened shavings and vegetable sponges promoted increase in the production of conidia (> 3.3 x 109 conidia / g) when compared to rice only (1.0 x 109 conidia / g). Exposure of the boil rice for 10 and 15 minutes resulted in conidial production similar to the production in autoclaved rice without the presence of contaminants. Wheat bran was the most promising substrate for the fungus production especially when mixed with rice bran (1.75 x 109 conidia / g) in solid fermentation. Conidia extracted from rice by sieving or washing in water and recovered with or without the addition of clays, diatomaceous earth and kaolin showed viability higher than 92% after storage for 60 days at 22 °C and 97% RH. At 22 °C and 0% RH, only the conidia extracted from the rice by sieving and those extracted in water and recovered with the addition of black clays and kaolin had viability higher than 92% after storage for 60 days. Strategies tested in this study for the production and extraction of conidia of M. anisopliae are viable alternatives to be incorporated in the large scale production and to reduce the time of fermentation and manpower, to increasing the efficiency of conversion of substrate in conidia.