Abstract Potential lethal diarrhoea caused by enterotoxigenic Escherichia coli strains is one of the most common diseases in young pigs. It can be cured by single-chain antibody fragments (scFv), which can be produced in recombinant microorganisms. Pichia pastoris, a methylotrophic yeast, is generally considered an interesting production system candidate, as it can secrete properly folded proteins. These proteins accumulate in high concentrations during fermentation, reducing the cost for product recovery. Strong inducible AOX1 promoter, widely used in P. pastoris for fast, inexpensive production, is typically induced by methanol. The high oxygen demand of methanol metabolism makes oxygen supply a major parameter in cultivations requiring special process design strategies. In standard fed-batch cultivation, dissolved oxygen concentration inside a bioreactor is kept at a certain level by pumping air and pure oxygen into the reactor. There are safety concerns over the handling of oxygen, especially at a large scale. Therefore, there is a need to develop a production process under oxygen-limited conditions. This dissertation studies the development of a cost-efficient production process of scFv in P. pastoris. Both methanol and oxygen parameters influence the production process and the objective was to find a robust production process. Fed-batch cultivations were performed in a 10 L scale bioreactor. The effects of lower oxygen level, methanol concentration, glycerol feeding duration and specific substrate-uptake rates on product formation were studied. A P. pastoris GS115 his4 strain under an AOX1 promoter system expressing scFv was used in this study. The fed-batch fermentations were carried out in a bioreactor with basal salt media. In this doctoral dissertation, a process was developed for a single-chain antibody fragment (scFv) production in P. pastoris. The product levels of 3.5 g L-1 scFv in culture supernatant were achieved and a production process was designed without additional need of pure oxygen, thus relieving safety requirements and lowering the amount of methanol. The process developed during this research may potentially be utilised by both academia and industry having interests in expressing proteins in P. pastoris. The methanol-uptake control strategy is beneficial for those products that suffer from degradation or modification during limited feeding of methanol. / Tiivistelmä Enterotoksigeenisten E.coli kantojen aiheuttama ripuli on porsaiden tavallisimpia tauteja, joka voi johtaa jopa kuolemaan. Tautia voidaan hoitaa yhdistelmä-DNA-tekniikalla tuotetuilla vasta-ainefragmenteilla (scFv). Metylotrofista Pichia pastoris hiivaa pidetään kiinnostavana vasta-ainefragmenttien tuottoisäntänä, koska se pystyy erittämään oikealla tavalla laskostuneita proteiineja. Näitä proteiineja kertyy fermentointiprosessissa solujen ulkopuolelle korkeina pitoisuuksina, mikä vähentää tuotteiden talteenottokustannuksia. Vahva metanolilla indusoituva AOX1-promoottori on laajassa käytössä P. pastoris tuottosysteemissä tuoton nopeuden ja alhaisten kustannusten ansiosta. Metanolin aineenvaihdunta vaatii paljon happea, joten riittävän tehokas hapen liuottaminen on tärkeimpiä fermentointiparametreja ja vaatii erityisiä prosessin toteutusstrategioita. Perinteisessä fed-batch-fermentoinnissa liuenneen hapen pitoisuus bioreaktorissa pidetään halutulla tasolla lisäämällä ilmaa ja puhdasta happea reaktoriin. Koska hapen käsittelyyn liittyy turvallisuusriskejä erityisesti teollisuusmittakaavassa, happirajoitteisissa olosuhteissa toimiva tuotantoprosessi olisi hyödyllinen. Tässä väitöstutkimuksessa kehitettiin kustannustehokasta prosessia scFv-:n tuottoon P. pastoris hiivalla. Metanoliin ja happeen liittyvät parametrit ovat olennaisia prosessiin vaikuttavia tekijöitä. Tavoite oli kehittää yksinkertainen ja käytännöllinen prosessi. Työssä tutkittiin alhaisen happitason, metanolin pitoisuuden, glyserolisyötön keston ja substraattien spesifisten kulutusnopeuksien vaikutuksia tuotteen muodostumiseen 10 litran bioreaktorissa. Isäntäkantana oli P. pastoris GS115 his4, jossa scFv-ekspressiota säädeltiin AOX1 promoottorilla. Fed-batch fermentointien kasvatusalustana käytettiin Basal Salt Medium alustaa (BSM). Väitöstyössä kehitettiin tavoitteiden mukainen vasta-ainefragmenttien tuottoprosessi P.pastoris hiivalle. Menetelmällä saavutettiin tuotepitoisuus 3,5 g L-1 kasvatusliemen supernatantissa ilman puhtaan hapen lisäystarvetta, ja siten metanolin kulutus väheni ja prosessiturvallisuus parani verrattuna perinteisiin prosesseihin. Kehitetty prosessi soveltuu käytettäväksi sekä akateemisessa tutkimuksessa että teollisuudessa tuotettaessa erilaisia proteiineja P. pastoris hiivalla. Metanolin kulutuksen säätöstrategia on erityisen hyödyllinen tuotteille, joilla ongelmana on proteolyysi tai muokkautuminen metanolirajoitteisessa fermentoinnissa.

Abstract Production of recombinant proteins and organic molecules by microbial fermentation is a widely used process in pharmaceutical, biofuel, food and chemical industries. Micro-organisms are cultivated in a bioreactor enabling a proper environment and conditions for production of the desired product molecule. Usually, however, the conditions in the bioreactor are inhomogeneous because of technical limitations such as insufficient mixing. This causes gradients in various parameters such as temperature, ph, dissolved oxygen or substrate concentration, which can have a negative effect on product quality and quantity. Understanding the effects of such environmental variations for the host organism and product molecule are crucial for the bioprocess control. The aim of this dissertation was to study the metabolic and gene expression level response of Escherichia coli bacterium for variating conditions in the bioreactor. The responses for rapid temperature increase and oxygen limitation was studied by shift experiments. The effect of oscillating oxygen and glucose concentrations, typical for industrial scale processes, was studied with a scale-down model. The main results were obtained in the oxygen downshift experiments. It was shown that a non-canonical amino acid norvaline, known to replace leucine in recombinant proteins, is accumulated in significant concentration under oxygen limitation. The accumulation of norvaline was also observed in the scale-down model indicating that norvaline could also be found in large scale processes. The quantitative gene expression results for the norvaline pathway genes showed no clear response. This indicates that the norvaline formation occurs due to the changes on metabolic rather than transcriptional level. The second key result of this dissertation was the finding, that the accumulation of formate, a typical anaerobic metabolite, was diminished by medium boosted with trace amounts nickel, selenium and molybdenum, enabling the activity of formate degrading enzyme complex. The results of this dissertation can be utilized in the industrial process optimisation and as a basis for further bioprocess studies. / Tiivistelmä Vierasproteiinien ja orgaanisten molekyylien tuottaminen fermentoimalla on paljon käytetty menetelmä lääke-, bioenergia-, elintarvike- sekä kemianteollisuudessa. Mikrobit kasvatetaan bioreaktorissa, joka mahdollistaa sopivan kasvuympäristön ja tuotanto-olosuhteet halutulle tuotteelle. Usein bioreaktorin olosuhteet ovat kuitenkin epätasaiset teknisten rajoitteiden kuten riittämättömän sekoitustehon vuoksi. Tämä aiheuttaa eri muuttujien, kuten happi- ja ravinnepitoisuuden, pH:n tai lämpötilan vaihtelua ajan ja paikan suhteen, millä voi olla haitallinen vaikutus tuotteen laatuun tai saantoon. Ympäristötekijöiden muutosten isäntäsolulle tai tuotemolekyylille aiheuttamien vaikutusten ymmärtäminen ovat yksi ratkaisevista tekijöistä bioprosessien hallinnassa. Tässä väitöskirjassa tutkittiin Escherichia coli -bakteerin aineenvaihdunnan sekä geeniekspression vasteita bioreaktorin ajan ja paikan suhteen vaihtelevissa olosuhteissa. Hapenpuutteen ja lämpötilan nousun vaikutusta tutkittiin kokeilla, joissa olosuhdetta kertaluontoisesti ja nopeasti muutettiin. Teollisille fermentointiprosesseille tyypillistä happi- ja ravinnepitoisuuksien jatkuvaa vaihtelua tutkittiin suurta bioreaktoria jäljittelevällä pienoismallilla. Tärkeimmät tulokset liittyivät kokeisiin, joissa tutkittiin hapenpuutetta. Kokeissa kävi ilmi, että happirajoitetuissa olosuhteissa muodostuu huomattavia määriä epätavallista aminohappoa norvaliinia, jonka tiedetään korvaavan leusiinia vierasproteiineissa. Norvaliinin muodostumista havaittiin myös pienoismallilla tehdyissä kasvatuksissa, osoittaen että norvaliinia voi mahdollisesti löytyä myös suuren mitan prosesseista. Geeniekspressiomittaukset eivät osoittaneet muutoksia norvaliinin aineenvaihduntareitillä, osoittaen että havaittu norvaliinin muodostuminen tapahtuu aineenvaihdunnallisten muutosten seurauksena. Toinen tässä väitöstutkimuksessa saatu tärkeä tulos oli muurahaishapon kertymisen vähentyminen, kun kasvatusliuokseen lisättiin nikkeliä, seleeniä ja molybdeeniä aktivoimaan muurahaishappoa hajottavaa entsyymikompleksia. Tämän väitöstutkimuksen tuloksia voidaan hyödyntää teollisten prosessien optimoinnissa ja perustana uusille tutkimusaiheille.