Universiẗat, FB Medizin, Diss.--Hamburg, 2005.

Thesis (Ph. D.)--University of Wisconsin, 1965. / Typescript. Vita. eContent provider-neutral record in process. Description based on print version record. Includes bibliographical references.

The main objective of this thesis is the elucidation of the mechanism of demetallation of haemin by L-chain apoferritins by different techniques: Crystallographic studies can give us information about the nature of the porphyrin binding sites. In order to attain maximum occupation of these sites we have used 24 haemin /apoferritin molecules. In contrast, for the EPR studies, which allow us to distinguish between haem and non-haem iron, we have used less than saturating values, typically 8 haemin / apoferritin. For the mass spectrometry studies, which give us information on the molecular weight of the bound porphyrin derivative, we have chosen, after preliminary experiments to use 12 haemin / apoferritin. The same conditions were employed for the EXAFS studies, which give us information concerning the ligand environment of the metal ion. We have analysed the wild type L-chain apoferritin (rHoLF) and its three mutants ( rHoLF E53,56,57,60Q; rHoLF R59M and rHoLF E53,56,57,60Q + R59M) incubated with haemin in acidic and basic conditions and after different times of incubation.

Fourteen Manitoba legume seeds and a pea protein isolate were evaluated for ferritin production. Optimized ferritin concentrate yields from 5 selected isolates ranged from 19.07% (Chick Peas) to 9.69% (Moon Dal Washed). Iron concentrations were between 0.45g (Green Lentils Whole) and 0.30g (Chick Pea)/100g. SDS-PAGE revealed presence of the major ferritin polypeptides in the concentrates. The levels of iron in ferritin appear to be directly related to the amount of negatively charged amino acids. Intrinsic fluorescence and circular dichroic spectra showed that the ferritin concentrates had denatured protein conformations at pH 2 and 7, which is critical to their digestibility and bioavailability. Gel-permeation chromatography revealed differences in elution volumes between pre- and post-digestion ferritin concentrates, and kinetics studies confirmed susceptibility to proteolysis and a high potential for iron release. Results demonstrated the feasibility of phytoferritin production from Manitoba pulses, which could serve as a better iron supplement than inorganic iron during IDA treatment. / October 2016

Ferritins are ubiquitous proteins that serve the dual-function of iron reservoir and sequestering the Fe(II) toxicity. The function of ferritins totally depends on the characteristic spherical structure with a di-iron centre performing the iron oxidation and a hallow cavity enclosing the iron minerals in a bioavailable form. I have characterised the structure, assembly and function of a new member of ferritin superfamily that is natively enclosed within an encapsulin shell. Encapsulin proteins are structurally-related to a virus capsid and form 60-meric or 180-meric icosahedrons. I show that this encapsulin associated ferritin-like protein (EncFtn) possesses two main alpha helices, which assemble in a metal-dependent manner to form a ferroxidase centre at a dimer interface. EncFtn adopts an annular decamer structure in contrast to the 24-meric classical ferritins or 12-meric mini-ferritin (DPS). The resemblance of the dimeric EncFtn and monomeric classical ferritins suggests that it is likely that classical ferritin evolves from EncFtn because of the gene duplication. EncFtn is a catalytically active ferroxidase but with only a limited iron binding ability due to its open structure. The encapsulin itself is not able to oxidise Fe(II), but is able to store about 2200 iron ions. I have demonstrated that the EncFtn must be housed in the encapsulin to achieve a maximum loading of approximately 4200 iron ions. The encapsulin nanocompartments are widely-distributed in both eubacteria and archaeon with distinct life styles and represent a distinct class of iron storage system, where iron oxidation and mineralisation are distributed between two proteins.

Thesis (Ph. D.)--Brigham Young University. Dept. of Chemistry and Biochemistry, 2006. / Includes bibliographical references (p. 191-200).

The main objective of this thesis is the elucidation of the mechanism of demetallation of haemin by L-chain apoferritins by different techniques: Crystallographic studies can give us information about the nature of the porphyrin binding sites. In order to attain maximum occupation of these sites we have used 24 haemin /apoferritin molecules. In contrast, for the EPR studies, which allow us to distinguish between haem and non-haem iron, we have used less than saturating values, typically 8 haemin / apoferritin. For the mass spectrometry studies, which give us information on the molecular weight of the bound porphyrin derivative, we have chosen, after preliminary experiments to use 12 haemin / apoferritin. The same conditions were employed for the EXAFS studies, which give us information concerning the ligand environment of the metal ion. We have analysed the wild type L-chain apoferritin (rHoLF) and its three mutants ( rHoLF E53,56,57,60Q; rHoLF R59M and rHoLF E53,56,57,60Q + R59M) incubated with haemin in acidic and basic conditions and after different times of incubation.

Female mosquitoes lay eggs after the consuming a blood meal. The iron storage protein ferritin could be involved with iron movement among body tissues in insects. Mosquito ferritin is present in hemolymph (blood) and the messages for the heavy and light chain subunits contain secretion signal sequences. These subunits may be targeted to the secretory pathway. We found that Aedes aegypti larval cells (CCL-125) exposed to iron as ferric ammonium citrate (FAC) increased ferritin secretion in a dose-dependent manner. In order to study the secretory pathway of ferritin, we attempted to disrupt the Golgi by treating CCL-125 cells with brefeldin A (BFA) and monensin. Unexpectedly, neither BFA nor monensin inhibits iron-induced ferritin secretion. These data suggest that either CCL-125 cells are highly resistant to these agents or ferritin is secreted independently of the classical ER-Golgi pathway.

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In der vorliegenden Arbeit wurde bei Patienten extra- und intrazelluläres Eisen in Knochenmarksbiopsien vor der Transplantation bestimmt und die Ergebnisse mit dem Erfolg der jeweiligen allogenen HSZT verglichen. Das Ziel dieser Untersuchung bestand darin festzustellen, ob es neben dem etablierten Marker Serum-Ferritin (SF) noch andere Marker gibt, welche für den Erfolg der Transplantation bedeutsam sind. Die Erfolgsparameter waren das Überleben, die rückfallfreie Mortalität sowie die akute und die chronische GvHD. Außerdem wurde die Korrelation von Eisenlagern im Knochenmark mit dem Gentyp (HFE-Genotyp) untersucht. Die Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen aus dem Knochenmark ist eine anerkannte Behandlung von lebensbedrohlichen hämatologischen Erkrankungen. Dennoch sind bis heute nur eingeschränkt Daten vorhanden, welche die Bedeutung der Eisen- und Ferritinablagerung im Knochenmark des Patienten vor der Transplantation in Verbindung mit dem Erfolg der Knochenmarktransplantation zeigen. Es wurden Knochenmarkbiopsien von 123 Patienten am Institut für Pathologie des Uniklinikums Leipzig histologisch untersucht, die zuvor aus diagnostischen Gründen entnommen wurden. Die Biopsien erfolgten innerhalb der letzten drei Monate vor der Transplantation, bei einem Median von 24 Tagen. In den gewonnen Präparaten wurde die Eisenablagerung mit der Berliner Blau Färbung und einer Makrophagenidentifizierung (CD68+) bestimmt. Dabei wurde ein selber generiertes Grading, in Anlehnung an das Grading von Takkunen, von G0 bis G5 für intrazellulär gespeichertem Eisen und g0 bis g3 für interstitielles Eisen verwendet, um die Eisenablagerung quantitativ per Mikroskop darzustellen. Das relative Verhältnis von eisenbeladenen CD68+/CD68+-Makrophagen und das absolute Verhältnis von CD68+-Makrophagen in Bezug auf alle hämatopoetischen Zellen wurde berechnet. Alle Peripheren Blutentnahmen zur Bestimmung des SF-Werts wurden sieben Tage vor der allogenen HSZT durchgeführt. Das Patientenkollektiv wurde in zwei Gruppen CRP < 5 mg/l und CRP > 5 mg/l eingeteilt, um die bekannten Einschränkungen des SF als Akut-Phase-Protein, zu berücksichtigen. Die Gruppe mit einem CRP-Gehalt < 5 mg/l umfasste so 90 Personen (48 Männer und 42 Frauen, Durchschnittsalter 57 Jahre), der Gruppe > 5 mg/l wurden 33 Patienten (20 männlich und 13 weiblich, Durchschnittsalter 56 Jahre) zugeordnet. Der durchschnittliche CRP-Gehalt in dieser Gruppe betrug 18,6 mg/l, bei einer Spanne von 5,7 mg/l - 56,9mg/l. In der Gruppe < 5 mg/l wurde ein veränderter HFE-Genotyp bei 27 Patienten gefunden. Der Median des SF betrug 2009 ng/ml, wobei 25 % der Patienten, einen SF-Gehalt von über 3000 ng/ml hatten. Der Median der vor der Transplantation verabreichten EKs lag bei 26 Konzentraten. In dem Patientenkollektiv CRP < 5mg/l zeigte sich eine starke Signifikanz bei den Korrelationen zwischen den SF-Werten und der verabreichten Anzahl an EKs (r = 0,59; p = 0,001), womit SF als valider Marker, zur Bestimmung des Körpereisens, bestätigt werden konnte. Der von uns generierte Eisenscore zeigte hinsichtlich der intrazellulären Eisenspeicherung ebenfalls eine signifikante Korrelation (r = 0,38; p = 0,005) mit der Anzahl der verabreichten EKs und konnte somit eine exogene Eisenzufuhr, im phagozytierenden System, semiquantitativ gut darstellen. Bezüglich der interstitiellen Eisenablagerung zeigte sich hingegen keine Korrelation (r = 0,19; p = 0,09). Auch die Korrelation von Gesamt-Makrophagengehalt an der Hämatopoesefläche sowie vom Anteil eisenbeladener CD68+-Makrophagen pro CD68+-Makrophagen insgesamt in den Knochenmarkbiopsien, mit der Anzahl der verabreichten EKs, ergab keine signifikante Übereinstimmung. Der fehlende Zusammenhang lässt sich mit der Schlussfolgerung erklären, dass der Makrophagengehalt eine individuelle, anstatt eine adaptative Größe darstellt. Hinsichtlich weiterer Korrelationen zwischen dem Eisengrading mit den SF-Werten ergab sich, dass höhere SF-Werte mit vermehrter intrazellulärer Eisenspeicherung (p = 0,005; r = 0,32), interstitieller Eisenablagerung (p = 0,007; r = 0,31) sowie mit einer höheren Anzahl eisenbeladenen CD68+ pro CD68+-Makrophagen (p = 0,004; r = 0,33) assoziiert waren. Die Anzahl der Gesamtmakrophagen korrelierte, wie schon bei der Korrelation mit der exogenen Eisenzufuhr durch EKs, nicht mit der Höhe der SF-Werte. Zusätzlich zeigte sich die Eisenspeicherung vom HFE-Genotyp nicht beeinflusst. Dies bedeutet, dass eine heterozygote HFE-Mutation des Patienten das Risiko einer toxischen Eisenüberladung im Rahmen des Transplantationsprozesses nicht erhöht. Bezogen auf die homozygoten Mutationen müssen diese Ergebnisse jedoch, aufgrund der geringen Fallzahl, kritisch betrachtet und durch größere Fallzahlen in weiteren Studien bestätigt werden. Nach einem Median von 24 Monaten kamen die akute und chronische GvHD in jeweils 70 % und 53 % bei Patienten vor. Es haben 58% der Patienten überlebt; die rückfallfreie Mortalität betrug 22 %. Intrazellulär gespeichertes Eisen und interstitiell abgelagertes Eisen konnte bei niedrigen Eisengraden (G0 / G1) SF-Werte > 3000 ng/ml, und damit eine toxische Eisenüberladung ausschließen. Allerdings war eine signifikante Aussage in Korrelation mit höheren SF-Werten nicht gegeben, so dass es nicht möglich war, mit dem Eisengrading eine signifikante Aussage über die rückfallfreie Mortalität die Überlebenszeit oder das Auftreten einer GvHD zu treffen. Jedoch zeigten die erhöhten SF-Werte in dem Patientenkollektiv CRP < 5 mg/l eine hohe Aussagekraft bezüglich des Überlebens (p = 0.002) und der rückfallfreien Mortalität (p = 0.007). Bei Patienten mit SF > 3000 ng/ml betrug der Überlebensanteil und die rückfallfreie Mortalität 37 % und 49 % gegenüber 78 % und 9 % bei Patienten mit niedrigem SF (p = 0.001). Zudem korrelierte SF bei einem Niveau > 3000 ng/ml mit der akuten GvHD (p = 0.002). Eine Korrelation mit der mit der chronischen GvHD fand sich nicht. In dem Patientenkollektiv mit einem CRP-Gehalt > 5 mg/l konnte, aufgrund einer Mortalität von 100% und der Heterogenität der Items, keine statistische Aussage über Korrelationen getroffen werden. Demzufolge bleibt SF eine preiswerte und nicht invasive Option um eine Eisenüberladung zu verifizieren und somit den Erfolg einer allogenen HSZT vorauszusagen, wenn die bekannten Einschränkungen berücksichtigt werden. Obwohl somit die histologische Eisenmessung der serologischen Bestimmung des SF-Wertes unterlegen ist, sollte eine sorgfältige Bestimmung des Eisengehalts an den Knochenmarkbiopsien, die im Rahmen der Standarddiagnostik gewonnen wurden, vorgenommen werden. Nur so kann die Wertigkeit der intrazellulären versus der interstitiellen Eisenspeicherung, vor dem Hintergrund des weiteren Verlaufs der Patienten nach Transplantation systematisch weiter untersucht und verbessert werden.