Com o objetivo de demonstrar a existência de substâncias extracelulares em urediniosporos de Hemileia vastatrix , capazes de desencadear a formação de fitoalexinas, foram utilizados bioensaios com cotilédones de soja. Para tanto foi inicialmente selecionada, através de bioensaios, a variedade de soja IAC-8, entre as variedades IAC-7, IAC-8, IAC-11, IAC-12 e Cristalina, por ser a mais adequada quanto à capacidade de sintetizar a fitoalexina gliceolina e quanto à uniformidade de resposta em presença de um elicitor ativo nestes tecidos, proveniente de extrato comercial de células autolisadas da levedura Saccharomyces ceresiviae Meyen. Foi possível verificar que substâncias presentes no filtrado de suspensão aquosa de urediniosporos autoclavados de H. Vastatrix são capazes de desencadear a síntese da fitoalexina gliceolina em cotilédones de soja, variedade IAC-8. Objetivando o isolamento da substância elicitora extracelular, mais ativa, proveniente de urediniosporos de H. vastatrix, o filtrado aquoso foi submetido à purificação através de precipitação etanólica fracionada, seguida de cromatografias em colunas de Concanavalina-A Sepharose 4B, DEAE-celulose e Bio-Gel P-60, sendo estas etapas intercaladas por diálise. Pôde-se verificar que a atividade elicitora relativa aumentou gradativamente durante o processo de purificação, sendo que a fração elicitora mais pura apresentou uma atividade relativa 16,7 vezes maior do que aquela detecta- da para o filtrado aquoso bruto. O elicitor extracelular mostrou-se ativo mesmo quando concentrações equivalentes a 0,92 µg de carboidratos foram aplicadas por cotilédone. A atividade elicitora aumentou quando foram utilizadas concentrações crescentes do elicitor, atingindo um máximo à concentrações equivalentes a 10 µg de carboidratos por cotilédone. Foi possível observar que o elicitor, extracelular de H. vastatrix, solúvel em água e termoestável, e precipitado com etanol a 80% (v/v), não apresenta afinidade pela lectina Concanavalina-A e nem tampouco pelo trocador aniônico dietilaminoetil-celulose e possui um peso molecular menor que 60.000 e maior que 6.000 daltons. Visando elucidar a natureza química do elicitor extracelular de H. vastatrix, frações ativas foram submetidas a testes químicos para quantificação de carboidratos e proteínas, análise por cromatografia em fase gasosa e a tratamentos com metaperiodato de sódio e com as enzimas pronase, α-manosidase, β-galactosidase e β-glucosidase. O elicitor extracelular é oxidado pelo metaperiodato de sódio, o que acarreta a perda de sua atividade elicitora (94,63%), sendo esta parcialmente recuperada (56,20%) por redução com borohidreto de sódio e posterior hidrólise ácida fraca. Entretanto, a atividade elicitora não é alterada pelos tratamentos com as referidas enzimas. Os resultados ,obtidos evidenciam que o elicitor extracelular de H. vastatrix possui natureza polissacarídica, apresentando como principal componente a manose (88,77%), seguida pela glucose (6,67%) e a galactose (4,56%), sendo que os monossacarídeos componentes das moléculas dos polissacarídeos estão unidos entre si por ligações do tipo β.O polissacarídeo extracelular isolado de urediniosporos de H. vastatrix possui uma atividade biológica inespecífica, pois é capaz de desencadear a formação de fitoalexinas em uma planta não-hospedeira a H. vastatrix como a soja. / In order to demonstrate the presence of extracellular substances from uredionospores of Hemileia vastatrix, able to elicit the accumulation of phytoalexins, bioassays on soybean cotyledons were employed. Firstof all, among the soybean cultivars IAC-7, IAC-8, IAC-11, IAC-12 and Cristalina, the IAC-8 cultivar was selected through the cotyledon bioassays for further experiments, since it exhibited a more suitable and uniform response to an active glyceollin elicitor, isolated from a commercially available extract of the yeast Saccharomyces cerevisiae Meyen. It was possible to verify that substances present in the filtrate of water-washes from autoclaved urediniospores of H. vastatrix were able to stimulate the synthesis of the phytoalexin glyceollin in IAC-8 soybean cotyledons. In order to isolate the extracellular elicitor from H. vastatrix, filtrates of water-washes of the autoclaved urediniospores, were purified through fractionated ethanolic precipitation, followed by column chromatography on Concanavalin-A Sepharose 4B, DEAE-cellulose and Bio-Gel P-60, intercalated with dialysis. It was possible to verify that the relative elicitor activity gradually increased throughout the purification steps and that the purest elicitor fraction showed a relative elicitor activity 16.7 times greater than that exhibited by the crude filtrate. The purified extracellular elicitor was active even when concentration equivalent to 0.92 μg of carbohydrate were applied per cotyledon. It was observed that the water-soluble extracellular elicitor from H. vastatrix was heat-stable, precipitated with 80% ethanol (v/v), had no affinity neither for the Concanavalin-A lectin nor for the anion exchanger diethyl aminoethyl-cellulose. The elicitor showed a molecular weight lower than 60,000 and greater than 6,000 daltons. In order to elucidate the chemical nature of the extracellular elícitor from H. vastatrix, active fractions were submitted to chemical tests, analysis through gas-liquid chromatography and treatments with sodium metaperiodate and a150 with pronase, α-mannosidase, β-galactosidase and β-glucosidase. The extracellular elicitor was sensitive to the sodium metaperiodate, that caused the elimination of its elicitor activity (94.63%). The biological activity was partially regained (56.20%) when the periodate-degraded polymers were reduced with sodium borohydride, followed by a mild acid hydrolysis. However, the elicitor activity was not affected by the mentioned enzyme treatments. Yet, the results showed that the extracellular elicitor from H. vastatrix was a β-linked polysaccharide that presented mannose the major component (88.77%), followed by glucose (6.67%) and galactose (4.56%). The extracellular polysaccharide isolated from urediniospores of H. vastatrix showed an unspecific biological activity, due to its ability to elicit phyto alexin accumulation on a non-host plant to H. vastatric as the soybean.

Através da diferenciação de estruturas de infecção do fungo Hemileia vastatrix, sobre suportes artificiais de germinação foi possível o isolamento de proteínas, carboidratos e lipídeos do patógeno. Concluímos que a diferenciação de estruturas de infecção do fungo e dependente de estímulos topográficos do suporte de germinação. Durante o desenvolvimento do tubo germinativo ocorrem modificações dos açúcares presentes na parede do fungo com a diminuição de alfa-macanas e alfa-glucanas e aumento do total de quitina. Durante o processo de germinação ocorre diminuição dos níveis totais de carboidratos, enquanto durante a formação dos opressórios, lipídeos são os compostos preferencialmente metabolizados. Os níveis de proteína, que decrescem durante a germinação, aumentam durante a diferenciação dos opressórios. Vesículas sub-estomáticas podem se formar sobre suportes artificiais, mas não se observou nunca nenhum desenvolvimento posterior dessas estruturas / not available

A soja [Glycine max (L.) Merrill] é uma espécie da família Fabaceae que possui grande importância econômica mundial. A ferrugem asiática (ASR), causada pelo fungo Phakopsora pachyrhizi Sydow, tornou-se nos últimos anos uma das maiores ameaças às lavouras de soja ao redor do mundo. Cinco genes dominantes relacionados à resistência à ASR foram identificados. Entretanto, até o momento, nenhuma cultivar com resistência efetiva ao ataque pelo patógeno foi obtida, uma vez que todos os loci avaliados tiveram sua resistência quebrada por ao menos um isolado do fungo. A identificação de diversas fontes de resistência que possibilitem a construção de um “arsenal” contra a ASR no germoplasma comercial de soja, além do entendimento ao nível molecular dos mecanismos de defesa desta espécie contra P. pachyrhizi, podem contribuir significativamente no combate ao patógeno. Os fatores de transcrição WRKY são membros de uma superfamília com ampla distribuição no Reino Vegetal; embora suas funções regulatórias ainda não estejam bem definidas, inúmeros estudos realizados ao longo dos últimos anos têm reunido evidências de seu envolvimento nas respostas a ataques por patógenos. Estas requerem uma ampla reprogramação transcricional na célula vegetal, na qual fatores de transcrição WRKY parecem desempenhar um papel crucial no “ajuste-fino” da expressão de genes de defesa. O objetivo deste trabalho é caracterizar a função de dois genes da família WRKY em soja, envolvidos nas respostas ao ataque pelo fungo P. pachyrhizi, através de estratégias de genética reversa e estudos de expressão gênica. As seqüências genômicas e codificantes completas desses genes foram isoladas e identificadas respectivamente como GmWRKY20 e GmWRKY46. Vetores para sua superexpressão e silenciamento em soja foram construídos e os processos de transformação genética desta espécie foram realizados por bombardeamento ou via sistema integrado “bombardeamento/Agrobacterium”, nos quais embriões somáticos foram utilizados como tecido alvo. Além disso, a análise do perfil de expressão desses genes foi realizada em diversos tecidos, fases do desenvolvimento, condições de estresse salino e em resposta à infecção por P. pachyrhizi. / Soybean [Glycine max (L.) Merrill] is one of the most important legume crop worldwide. In the past few years, Asian Soybean Rust (ASR), caused by Phakopsora pachyrhizi Sydow, has become one of the major threats affecting the main soybean producers. Even though five dominant genes related to ASR resistance have been identified, there has been no report of a soybean variety presenting effectiveness towards the pathogen’s attack, since the resistance ruled by every single one of these genes has already been overcome by at least one isolate around the world. The identification of resistance sources allowing the construction of an arsenal against ASR in commercial soybean germplasm, as well as the understanding of soybean’s defense mechanisms against P. pachyrhizi at the molecular level, may therefore be extremely helpful regarding the pathogen’s eradication. WRKY proteins belong to a superfamily of transcription factors with wide distribution amongst plants. Although their regulatory function is not yet clear, there have been several studies in the past few years raising evidences towards their involvement in pathogen’s attack responses. These responses usually require a wide transcriptional reprogramming in the plant cell, at which WRKY proteins seem to play a central role fine-tuning the expression of defense related genes. The purpose of this study is to functionally characterize two soybean WRKY proteinencoding genes involved in soybean defense against P. pachyrhizi, by combining reverse genetics strategies with gene expression tools. Their genomic and complete coding sequences (cds) were isolated and the genes were identified as GmWRKY20 and GmWRKY46, respectively. Besides, vectors for their silencing and overexpression in soybean were constructed and this plant species was genetically transformed by particle bombardment or by an integrated bombardment/Agrobacterium transformation system. Soybean somatic embryos were used as target tissue at both processes. In addition, an expression profile analysis of both GmWRKY20 and GmWRKY46 in several plant tissues and developmental stages as well as under salt stress and in response to P. pachyrhizi infection was accomplished.

A ferrugem da folha, causada por Puccinia coronata Corda. f. sp. avenae Eriksson, é a moléstia mais danosa para a cultura da aveia (Avena sativa L.). O uso de cultivares resistentes tem sido limitado devido à extrema diversidade genética presente nas populações de P. coronata. Geralmente a superação dos genes de resistência acaba ocorrendo em um curto intervalo de tempo. Desta forma a busca por uma resistência eficiente e durável é o objetivo dos programas de melhoramento deste cereal. Com o objetivo de compreender alguns aspectos da resistência genética a Puccinia coronata em aveia, este trabalho abordou dois aspectos distintos. No ano de 2005, o experimento avaliou o comportamento da resistência quantitativa em uma população F6:11 resultante do cruzamento entre as cultivares UFRGS910906 e UFRGS7. Este ano caracterizou-se por ser extremamente favorável à doença, sendo que a maioria das linhagens apresentou uma ASCPD maior que o genitor suscetível. Uma análise avaliando os valores de ASCPD do período de 1998 a 2005 demonstrou que este tipo de resistência é altamente influenciado pelo ambiente, portanto em condições muito favoráveis ao fungo não é indicado selecionar genótipos com resistência parcial. Em 2006, as análises realizadas focaram na resistência do tipo qualitativa, buscando a identificação de marcadores do tipo AFLP para o gene de resistência Pc68, e ampliação do mapa genético da população de linhagens recombinantes em F6 oriundas do cruzamento entre os genótipos Pc68/5*Starter e UFRGS8, contrastantes quanto à presença deste gene. Um total de 78 marcadores polimórficos que segregaram na taxa esperada, formaram um mapa composto por 12 grupos de ligação, totalizando 409,4 cM do genoma de Avena sativa. Quanto às análises de ligação entre o gene Pc68 e os marcadores AFLP, foram detectados dois marcadores em repulsão: U8PM22 e U8PM25, os quais encontram-se flanqueando o gene a uma distância de 18,60 e 18,83 cM respectivamente. / Crown rust, caused by Puccinia coronata Corda. f. sp. avenae Eriksson, is the most damaging disease of cultivated oat (Avena sativa L.). Use of resistant genotypes is limited by P. coronata extremely high genetic diversity. In general, the pathogen races overcome single resistance genes in a short period of time. Oat breeding programs are continuously in searching for an efficient and durable host resistance. This work involved two distinct studies on oat crown rust resistance. In the first study quantitative resistance was evaluated in a F6:11 inbred line population derived from the cross UFRGS910906 X UFRGS7. Expression of host resistance was very dependent of environmental conditions as demonstrated by the comparison among AUDPC values from 1998 to 2005. The environment in 2005 was very favorable for disease development, and a large number of lines showed an AUDPC higher than the susceptible genitor one’s. Under conditions that favor disease, genetic selection for partial host resistance is not recommended. The second study was related to qualitative host resistance aiming to identify AFLP markers linked to the resistance gene Pc68, and amplify the F6 genetic map from Pc68/5*Starter X UFRGS8. Seventy-eight markers with normal segregation were discovered and distributed in 12 linkage groups. The map covered 409.4 cM of the Avena sativa genome. Two AFLP markers were linked in repulsion to Pc68: U8PM22 and U8PM25, which are flanking the gene at 18.60 and 18.83 cM respectively.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-06-02T14:47:20Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 535262 bytes, checksum: 00421f94daf70463c86c818e417df696 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-02T14:47:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 535262 bytes, checksum: 00421f94daf70463c86c818e417df696 (MD5) Previous issue date: 2004-02-13 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O cultivar de feijão preto Diamante Negro além da boa aceitação comercial, apresenta resistência ao crestamento-bacteriano-comum e ao mosaico comum. No Programa de Melhoramento do Feijoeiro do BIOAGRO/UFV, foi produzida uma isolinha de grãos tipo carioca (Rudá “R”) contendo simultaneamente genes de resistência à Colletotrichum lindemuthianum (genes Co-6 e Co-4), à Uromyces appendiculatus (genes Ur-?) e à Phaeoisariopsis griseola (gene Phg –1), com o auxílio de marcadores moleculares ligados a cada um desses genes. Os objetivos deste trabalho foram: caracterizar o cultivar Diamante Negro quanto à reação às principais raças de C. lindemuthianum (antracnose), U. appendiculatus (ferrugem) e P. griseola (mancha-angular) e também quanto ao seu fingerprint molecular por meio de marcadores do DNA, e transferir genes de resistência já piramidados na isolinha Rudá “R”, para esse cultivar. O Diamante Negro foi inoculado com 10 patótipos de C. lindemuthianum, 10 de U. appendiculatus e seis de P. griseola. No resultado da avaliação, o Diamante Negro mostrou-se suscetível a três patótipos de C. lindemuthianum (65, 81 e 89) e resistente, mas segregante, a quatro (55, 87, 95 e 342). Com relação a U. appendiculatus, comportou-se como suscetível a todos os patótipos. Com relação a P. griseola, foi suscetivel a quatro patótipos (31.17, 63.19, 63.23 e 63.55). Para sua caracterização molecular frente a outros cultivares do tipo preto e ao cultivar Rudá, pela técnica de RAPD, foram utilizados 78 primers, gerando 146 bandas polimórficas que permitiram o cálculo das distâncias genéticas e análise de agrupamento. A maior distância observada em relação ao Diamante Negro foi com o cultivar andino Preto 60 dias (26,79%), a menor com o Ouro Negro (6,42%) e o Rudá mostrou-se a uma distância de 28,11%. Três grupos foram formados: um contendo o Preto 60 dias (andino), um contendo o Rudá (mesoamericano-carioca) e um contendo os demais cultivares (mesoamericanos-pretos). Para a introgressão dos genes de resistência, cruzamentos entre Diamante Negro e o Rudá “R” foram realizados e as plantas F 1 foram retrocruzadas com o Diamante Negro gerando 394 plantas. Com inoculações seriadas com os três patógenos, foi possível selecionar 32 plantas resistentes às três doenças. O DNA destas 32 plantas foi amplificado com os marcadores SCAR Y20 830a (Co-4), SCAR H13 490a (Phg-1), SCAR AZ20 940a (Co-6) e SCAR F10 1050a e SCAR BA08 560a (Ur-?). Com o resultado desta amplificação foi possível selecionar 21 plantas que possuíam pelo menos quatro marcas, sendo que quatro destas plantas (75, 93, 141 e 270) apresentaram as cinco marcas. As distâncias genéticas relativas entre estas plantas RC 1 F 1 e o Diamante Negro variaram de 37 a 65%. Todas as 21 plantas RC 1 F 1 foram conduzidas para o segundo retrocruzamento, gerando 231 plantas RC 2 F 1 . A amplificação do DNA destas plantas RC 2 F 1 com os marcadores SCAR, permitiu selecionar 18 plantas com pelo menos quatro marcas. Seis destas (75.8, 93.8, 141.2, 141.4, 141.6 e 141.7) apresentaram as cinco marcas. As distâncias genéticas relativas entre as plantas selecionadas e o Diamante Negro foram de 32 a 48%. As 18 plantas selecionadas foram usadas para o terceiro retrocruzamento. O objetivo final deste trabalho é o de selecionar linhagens de grãos pretos com resistência à antracnose, ferrugem, mancha-angular, crestamento- bacteriano-comum e mosaico comum, com bom potencial produtivo. / Diamante Negro, a black-seeded common bean cultivar, is not only outstanding because of its excellent commercial acceptability, but also because it is resistant to common bean leaf blight and to common bean mosaic virus. Using molecular marker assisted selection, the common bean breeding program of the Universidade Federal de Viçosa (BIOAGRO) developed an isoline with carioca type grains (Rudá “R”) containing genes for resistance to Colletotrichum lindemuthianum (genes Co-6 and Co-4), to Uromyces appendiculatus (genes Ur-?), and to Phaeoisariopsis griseola (gene Phg –1). The objectives of this study were: a) to characterize the cultivar Diamante Negro in relation to its reaction to the main C. lindemuthianum (anthracnose), U. appendiculatus (rust), and P. griseola (angular leaf spot) races; b) to determine its molecular fingerprint using DNA markers; and c) to transfer the resistance genes present in Rudá “R” to this cultivar. Diamante Negro was inoculated with 10 pathotypes of C. lindemuthianum, 10 of U. appendiculatus, and six of P. griseola. Diamante Negro was susceptible to three pathotypes of C. lindemuthianum (65, 81, and 89) and resistant, though segregant, to four other (55, 87, 95, and 342). The cultivar was susceptible to all pathotypes of U. appendiculatus and to four pathotypes of P. griseola (31.17, 63.19, 63.23, and 63.55). The genetic distances between Diamante Negro and xother black-seeded cultivars and cultivar Rudá were determined. Seventy- eight RAPD primers produced 146 polymorphic bands. Andean cultivar Preto 60 dias presented the greatest distance in relation to Diamante Negro (26.79%), Ouro Negro, the shortest distance (6.42%), and Rudá a distance of 28.11%. Based on the genetic distances, three groups were formed: one containing Preto 60 dias (andean), the other containing Rudá (“carioca-type”, mesoamerican) and the last one including all the other cultivars (black-seeded, mesoamerican). For the introgression of the resistance genes, the F 1 plants of the cross Diamante Negro x Rudá “R” were backcrossed with Diamante Negro, producing 394 plants. By serial inoculations with the three pathogens, 32 plants resistant to the three diseases were selected. The DNA of these 32 plants was amplified with the markers 1), and SCAR SCAR Y20 830a (Co-4), F10 1050a and SCAR SCAR AZ20 940a (Co-6), SCAR H13 490a (Phg- BA08 560a (Ur-?). Twenty-one plants were selected harboring at least four markers of the markers. Four of these plants presented all five markers. The relative genetic distances between these RC 1 F 1 plants and Diamante Negro varied from 37 to 65%. All 21 RC 1 F 1 plants were included in the second backcrossing, giving rise to 231 RC 2 F 1 plants. The DNA amplification of these plants with the SCAR markers led to the selection of 18 plants with at least four markers. Six among them presented the five markers. Relative genetic distances between the selected plants and Diamante Negro ranged between 32 and 48%. The 18 selected plants were used for a third backcross. The ultimate goal of this work is to select black-seeded lines with resistance to anthracnose, rust, angular lea spot, common leaf blight and common mosaic with a promising yield potential.

A soja [Glycine max (L.) Merrill] é uma espécie da família Fabaceae que possui grande importância econômica mundial. A ferrugem asiática (ASR), causada pelo fungo Phakopsora pachyrhizi Sydow, tornou-se nos últimos anos uma das maiores ameaças às lavouras de soja ao redor do mundo. Cinco genes dominantes relacionados à resistência à ASR foram identificados. Entretanto, até o momento, nenhuma cultivar com resistência efetiva ao ataque pelo patógeno foi obtida, uma vez que todos os loci avaliados tiveram sua resistência quebrada por ao menos um isolado do fungo. A identificação de diversas fontes de resistência que possibilitem a construção de um “arsenal” contra a ASR no germoplasma comercial de soja, além do entendimento ao nível molecular dos mecanismos de defesa desta espécie contra P. pachyrhizi, podem contribuir significativamente no combate ao patógeno. Os fatores de transcrição WRKY são membros de uma superfamília com ampla distribuição no Reino Vegetal; embora suas funções regulatórias ainda não estejam bem definidas, inúmeros estudos realizados ao longo dos últimos anos têm reunido evidências de seu envolvimento nas respostas a ataques por patógenos. Estas requerem uma ampla reprogramação transcricional na célula vegetal, na qual fatores de transcrição WRKY parecem desempenhar um papel crucial no “ajuste-fino” da expressão de genes de defesa. O objetivo deste trabalho é caracterizar a função de dois genes da família WRKY em soja, envolvidos nas respostas ao ataque pelo fungo P. pachyrhizi, através de estratégias de genética reversa e estudos de expressão gênica. As seqüências genômicas e codificantes completas desses genes foram isoladas e identificadas respectivamente como GmWRKY20 e GmWRKY46. Vetores para sua superexpressão e silenciamento em soja foram construídos e os processos de transformação genética desta espécie foram realizados por bombardeamento ou via sistema integrado “bombardeamento/Agrobacterium”, nos quais embriões somáticos foram utilizados como tecido alvo. Além disso, a análise do perfil de expressão desses genes foi realizada em diversos tecidos, fases do desenvolvimento, condições de estresse salino e em resposta à infecção por P. pachyrhizi. / Soybean [Glycine max (L.) Merrill] is one of the most important legume crop worldwide. In the past few years, Asian Soybean Rust (ASR), caused by Phakopsora pachyrhizi Sydow, has become one of the major threats affecting the main soybean producers. Even though five dominant genes related to ASR resistance have been identified, there has been no report of a soybean variety presenting effectiveness towards the pathogen’s attack, since the resistance ruled by every single one of these genes has already been overcome by at least one isolate around the world. The identification of resistance sources allowing the construction of an arsenal against ASR in commercial soybean germplasm, as well as the understanding of soybean’s defense mechanisms against P. pachyrhizi at the molecular level, may therefore be extremely helpful regarding the pathogen’s eradication. WRKY proteins belong to a superfamily of transcription factors with wide distribution amongst plants. Although their regulatory function is not yet clear, there have been several studies in the past few years raising evidences towards their involvement in pathogen’s attack responses. These responses usually require a wide transcriptional reprogramming in the plant cell, at which WRKY proteins seem to play a central role fine-tuning the expression of defense related genes. The purpose of this study is to functionally characterize two soybean WRKY proteinencoding genes involved in soybean defense against P. pachyrhizi, by combining reverse genetics strategies with gene expression tools. Their genomic and complete coding sequences (cds) were isolated and the genes were identified as GmWRKY20 and GmWRKY46, respectively. Besides, vectors for their silencing and overexpression in soybean were constructed and this plant species was genetically transformed by particle bombardment or by an integrated bombardment/Agrobacterium transformation system. Soybean somatic embryos were used as target tissue at both processes. In addition, an expression profile analysis of both GmWRKY20 and GmWRKY46 in several plant tissues and developmental stages as well as under salt stress and in response to P. pachyrhizi infection was accomplished.

A soja [Glycine max (L.) Merrill] é uma espécie da família Fabaceae que possui grande importância econômica mundial. A ferrugem asiática (ASR), causada pelo fungo Phakopsora pachyrhizi Sydow, tornou-se nos últimos anos uma das maiores ameaças às lavouras de soja ao redor do mundo. Cinco genes dominantes relacionados à resistência à ASR foram identificados. Entretanto, até o momento, nenhuma cultivar com resistência efetiva ao ataque pelo patógeno foi obtida, uma vez que todos os loci avaliados tiveram sua resistência quebrada por ao menos um isolado do fungo. A identificação de diversas fontes de resistência que possibilitem a construção de um “arsenal” contra a ASR no germoplasma comercial de soja, além do entendimento ao nível molecular dos mecanismos de defesa desta espécie contra P. pachyrhizi, podem contribuir significativamente no combate ao patógeno. Os fatores de transcrição WRKY são membros de uma superfamília com ampla distribuição no Reino Vegetal; embora suas funções regulatórias ainda não estejam bem definidas, inúmeros estudos realizados ao longo dos últimos anos têm reunido evidências de seu envolvimento nas respostas a ataques por patógenos. Estas requerem uma ampla reprogramação transcricional na célula vegetal, na qual fatores de transcrição WRKY parecem desempenhar um papel crucial no “ajuste-fino” da expressão de genes de defesa. O objetivo deste trabalho é caracterizar a função de dois genes da família WRKY em soja, envolvidos nas respostas ao ataque pelo fungo P. pachyrhizi, através de estratégias de genética reversa e estudos de expressão gênica. As seqüências genômicas e codificantes completas desses genes foram isoladas e identificadas respectivamente como GmWRKY20 e GmWRKY46. Vetores para sua superexpressão e silenciamento em soja foram construídos e os processos de transformação genética desta espécie foram realizados por bombardeamento ou via sistema integrado “bombardeamento/Agrobacterium”, nos quais embriões somáticos foram utilizados como tecido alvo. Além disso, a análise do perfil de expressão desses genes foi realizada em diversos tecidos, fases do desenvolvimento, condições de estresse salino e em resposta à infecção por P. pachyrhizi. / Soybean [Glycine max (L.) Merrill] is one of the most important legume crop worldwide. In the past few years, Asian Soybean Rust (ASR), caused by Phakopsora pachyrhizi Sydow, has become one of the major threats affecting the main soybean producers. Even though five dominant genes related to ASR resistance have been identified, there has been no report of a soybean variety presenting effectiveness towards the pathogen’s attack, since the resistance ruled by every single one of these genes has already been overcome by at least one isolate around the world. The identification of resistance sources allowing the construction of an arsenal against ASR in commercial soybean germplasm, as well as the understanding of soybean’s defense mechanisms against P. pachyrhizi at the molecular level, may therefore be extremely helpful regarding the pathogen’s eradication. WRKY proteins belong to a superfamily of transcription factors with wide distribution amongst plants. Although their regulatory function is not yet clear, there have been several studies in the past few years raising evidences towards their involvement in pathogen’s attack responses. These responses usually require a wide transcriptional reprogramming in the plant cell, at which WRKY proteins seem to play a central role fine-tuning the expression of defense related genes. The purpose of this study is to functionally characterize two soybean WRKY proteinencoding genes involved in soybean defense against P. pachyrhizi, by combining reverse genetics strategies with gene expression tools. Their genomic and complete coding sequences (cds) were isolated and the genes were identified as GmWRKY20 and GmWRKY46, respectively. Besides, vectors for their silencing and overexpression in soybean were constructed and this plant species was genetically transformed by particle bombardment or by an integrated bombardment/Agrobacterium transformation system. Soybean somatic embryos were used as target tissue at both processes. In addition, an expression profile analysis of both GmWRKY20 and GmWRKY46 in several plant tissues and developmental stages as well as under salt stress and in response to P. pachyrhizi infection was accomplished.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós-graduação em Agronomia, 2015. / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2016-01-19T15:08:05Z No. of bitstreams: 1 2015_CarlosRenatoEchevestedaRosa.pdf: 2968825 bytes, checksum: b7a0b9b6185f76bd3c85da5dcdf8aebe (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2016-01-26T12:05:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_CarlosRenatoEchevestedaRosa.pdf: 2968825 bytes, checksum: b7a0b9b6185f76bd3c85da5dcdf8aebe (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-26T12:05:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_CarlosRenatoEchevestedaRosa.pdf: 2968825 bytes, checksum: b7a0b9b6185f76bd3c85da5dcdf8aebe (MD5) / A ferrugem asiática da soja (Phakopsora pachyrhizi) caracteriza-se como a doença foliar mais destrutiva da soja. No entanto, devido à limitada disponibilidade de variedades resistentes adaptadas, os fungicidas ainda são a principal ferramenta de manejo disponível. Assim, a transferência de genes de resistência, assistida por marcadores moleculares, é uma estratégia promissora para o desenvolvimento de variedades resistentes em programas de melhoramento. Os objetivos deste trabalho foram estudar a virulência de isolados de ferrugem frente a diferentes genes de resistência e identificar marcadores moleculares SNP (Single Nucleotide Polymorphism) associados a genes de resistência. Para isso, foram caracterizados isolados de P. pachyrhizi frente a genótipos portadores de diferentes genes de resistências. Também foram identificados marcadores moleculares foi realizada através do estudo de populações segregantes, geradas a partir do cruzamento entre genótipos resistentes e suscetíveis. Os resultados deste trabalho sugerem a ocorrência de variação na virulência de isolados de ferrugem asiática aos diferentes genes de resistência conhecidos, e a existência de marcador molecular SNP associado ao gene de resistência Rpp4 no cromossomo 18 da soja. / The Asian soybean rust (Phakopsora pachyrhizi) is characterized as the most destructive foliar disease of soybean. Due the limited availability of resistant varieties fungicides are still the main available management tool. Thus, the transfer of resistance genes, by marker assisted selection in breeding programs, is a promising strategy for the development of resistant varieties. Our objectives were to study the virulence of rust isolates against different resistance genes and identify SNP (Single Nucleotide Polymorphism) molecular markers associated with resistance genes. To this, isolates of P. pachyrhizi were characterized against genotypes carrying different resistance genes. A SNP molecular markers were also identified through the study of segregating populations. The populations were generated from crosses between resistant and susceptible genotypes. The results of this research suggest the occurrence of variation in the virulence of Asian rust, and the presence of a SNP molecular marker associated to Rpp4 resistance gene on chromosome 18 of soybean.

A ferrugem da folha, causada por Puccinia coronata Corda. f. sp. avenae Eriksson, é a moléstia mais danosa para a cultura da aveia (Avena sativa L.). O uso de cultivares resistentes tem sido limitado devido à extrema diversidade genética presente nas populações de P. coronata. Geralmente a superação dos genes de resistência acaba ocorrendo em um curto intervalo de tempo. Desta forma a busca por uma resistência eficiente e durável é o objetivo dos programas de melhoramento deste cereal. Com o objetivo de compreender alguns aspectos da resistência genética a Puccinia coronata em aveia, este trabalho abordou dois aspectos distintos. No ano de 2005, o experimento avaliou o comportamento da resistência quantitativa em uma população F6:11 resultante do cruzamento entre as cultivares UFRGS910906 e UFRGS7. Este ano caracterizou-se por ser extremamente favorável à doença, sendo que a maioria das linhagens apresentou uma ASCPD maior que o genitor suscetível. Uma análise avaliando os valores de ASCPD do período de 1998 a 2005 demonstrou que este tipo de resistência é altamente influenciado pelo ambiente, portanto em condições muito favoráveis ao fungo não é indicado selecionar genótipos com resistência parcial. Em 2006, as análises realizadas focaram na resistência do tipo qualitativa, buscando a identificação de marcadores do tipo AFLP para o gene de resistência Pc68, e ampliação do mapa genético da população de linhagens recombinantes em F6 oriundas do cruzamento entre os genótipos Pc68/5*Starter e UFRGS8, contrastantes quanto à presença deste gene. Um total de 78 marcadores polimórficos que segregaram na taxa esperada, formaram um mapa composto por 12 grupos de ligação, totalizando 409,4 cM do genoma de Avena sativa. Quanto às análises de ligação entre o gene Pc68 e os marcadores AFLP, foram detectados dois marcadores em repulsão: U8PM22 e U8PM25, os quais encontram-se flanqueando o gene a uma distância de 18,60 e 18,83 cM respectivamente. / Crown rust, caused by Puccinia coronata Corda. f. sp. avenae Eriksson, is the most damaging disease of cultivated oat (Avena sativa L.). Use of resistant genotypes is limited by P. coronata extremely high genetic diversity. In general, the pathogen races overcome single resistance genes in a short period of time. Oat breeding programs are continuously in searching for an efficient and durable host resistance. This work involved two distinct studies on oat crown rust resistance. In the first study quantitative resistance was evaluated in a F6:11 inbred line population derived from the cross UFRGS910906 X UFRGS7. Expression of host resistance was very dependent of environmental conditions as demonstrated by the comparison among AUDPC values from 1998 to 2005. The environment in 2005 was very favorable for disease development, and a large number of lines showed an AUDPC higher than the susceptible genitor one’s. Under conditions that favor disease, genetic selection for partial host resistance is not recommended. The second study was related to qualitative host resistance aiming to identify AFLP markers linked to the resistance gene Pc68, and amplify the F6 genetic map from Pc68/5*Starter X UFRGS8. Seventy-eight markers with normal segregation were discovered and distributed in 12 linkage groups. The map covered 409.4 cM of the Avena sativa genome. Two AFLP markers were linked in repulsion to Pc68: U8PM22 and U8PM25, which are flanking the gene at 18.60 and 18.83 cM respectively.

A ferrugem da folha, causada por Puccinia coronata Corda. f. sp. avenae Eriksson, é a moléstia mais danosa para a cultura da aveia (Avena sativa L.). O uso de cultivares resistentes tem sido limitado devido à extrema diversidade genética presente nas populações de P. coronata. Geralmente a superação dos genes de resistência acaba ocorrendo em um curto intervalo de tempo. Desta forma a busca por uma resistência eficiente e durável é o objetivo dos programas de melhoramento deste cereal. Com o objetivo de compreender alguns aspectos da resistência genética a Puccinia coronata em aveia, este trabalho abordou dois aspectos distintos. No ano de 2005, o experimento avaliou o comportamento da resistência quantitativa em uma população F6:11 resultante do cruzamento entre as cultivares UFRGS910906 e UFRGS7. Este ano caracterizou-se por ser extremamente favorável à doença, sendo que a maioria das linhagens apresentou uma ASCPD maior que o genitor suscetível. Uma análise avaliando os valores de ASCPD do período de 1998 a 2005 demonstrou que este tipo de resistência é altamente influenciado pelo ambiente, portanto em condições muito favoráveis ao fungo não é indicado selecionar genótipos com resistência parcial. Em 2006, as análises realizadas focaram na resistência do tipo qualitativa, buscando a identificação de marcadores do tipo AFLP para o gene de resistência Pc68, e ampliação do mapa genético da população de linhagens recombinantes em F6 oriundas do cruzamento entre os genótipos Pc68/5*Starter e UFRGS8, contrastantes quanto à presença deste gene. Um total de 78 marcadores polimórficos que segregaram na taxa esperada, formaram um mapa composto por 12 grupos de ligação, totalizando 409,4 cM do genoma de Avena sativa. Quanto às análises de ligação entre o gene Pc68 e os marcadores AFLP, foram detectados dois marcadores em repulsão: U8PM22 e U8PM25, os quais encontram-se flanqueando o gene a uma distância de 18,60 e 18,83 cM respectivamente. / Crown rust, caused by Puccinia coronata Corda. f. sp. avenae Eriksson, is the most damaging disease of cultivated oat (Avena sativa L.). Use of resistant genotypes is limited by P. coronata extremely high genetic diversity. In general, the pathogen races overcome single resistance genes in a short period of time. Oat breeding programs are continuously in searching for an efficient and durable host resistance. This work involved two distinct studies on oat crown rust resistance. In the first study quantitative resistance was evaluated in a F6:11 inbred line population derived from the cross UFRGS910906 X UFRGS7. Expression of host resistance was very dependent of environmental conditions as demonstrated by the comparison among AUDPC values from 1998 to 2005. The environment in 2005 was very favorable for disease development, and a large number of lines showed an AUDPC higher than the susceptible genitor one’s. Under conditions that favor disease, genetic selection for partial host resistance is not recommended. The second study was related to qualitative host resistance aiming to identify AFLP markers linked to the resistance gene Pc68, and amplify the F6 genetic map from Pc68/5*Starter X UFRGS8. Seventy-eight markers with normal segregation were discovered and distributed in 12 linkage groups. The map covered 409.4 cM of the Avena sativa genome. Two AFLP markers were linked in repulsion to Pc68: U8PM22 and U8PM25, which are flanking the gene at 18.60 and 18.83 cM respectively.