RESUMO As fosfatases alcalinas sao enzimas que participam da atividade catalitica na hidrolise de ésteres fosfóricos. Nesta Dissertação, investigou-se a sua adsorção em monocamadas de Langmuir e também em filmes do tipo Langmuir-Blodgett (LB) de fosfolipídios em diferentes temperaturas. Esses sistemas são considerados como modelos para membranas biológicas. O efeito de um dissacarídeo (trealose), bem como as impurezas contidas na amostra do açúcar, foi testado na subfase que suporta a monocamada,. Constatou-se que a trealose nao purificada altera a isoterma superficial de monocamadas do sal de sódio do acido dimiristoilglicerofosfatidico, DMPA, e atua como um bom agente de ligação entre camadas sucessivas do fosfolipídio para a obtenção de filmes LB. Já para trealose purificada nao se observaram esses efeitos. A caracterização das impurezas foi realizada por espectroscopia na região do infravermelho e por absorção atômica, detectando-se a presença de moléculas anfifílicas e de íons metálicos (Na+, K+, Ca2+, Mg2+), respectivamente. Dois tipos de fosfatases alcalinas foram usadas: uma purificada de placa óssea de ratos por extração com tensoativo nâo-iônico, chamada de DSAP e outra purificada de conídia de Neurospora crassa, denominada CNCAP. As interações com o fosfolipídio foram estudas por meio das mudanças nas curvas -A e a adsorção em filmes LB de DMPA/Zn2+ e DMPA/trealose, por meio da técnica de microbalança a cristal de quartzo (QCM). A presença das enzimas nos filmes foi também comprovada pela detecção de suas atividades catalíticas na hidrolise do PNPP (p-nitrofenilfosfato). Para a DSAP, a melhor atividade foi obtida quando a imobilização da proteína ocorreu a baixa temperatura (10º C). / ABSTRACT Alkaline phosphatases (AP) are unspecific enzymes that hydrolyze phosphate esthers. In this Dissertation we have studied the adsorption of two forms of AP in phospholipid Langmuir monolayers and Langmuir-Blodgett films, considered as biomembrane models, at different temperatures. Further, the effect of the presence of a disaccharide, trehalose, as well as some impurities present in its commercial form, in the subphase of the monolayers was tested. We concluded that the use of trehalose without further purification alters the surface pressure-area (Pi-A) curves of the monolayers. In addition, it acts as a good linking agent between successive layers in the Langmuir-Blodgett films of the sodium salt of 1,2-dimirystoyl-sn-glicero-3-phosphate acid, DMPA. In the presence of purified trehalose instead, these effects were not observed. No difference was noticed in the Pi-A curves of DMPA for trehalose concentrations between 10-3 mmol L-1 to 0.1 mmol L-1. The characterization of the impurities by atomic absorption and infrared spectroscopy reveal the presence of amphiphilic compounds as well as electrolytes such as: sodium, magnesium, calcium and potassium Two forms of AP were used: one purified from rat osseous plates using detergent solubilization, named DSAP, and the other from Neurospora crassa conidia, CNCAP. Enzyme interaction with phospholipids was followed by changes in Pi-A curves, and their adsorption on DMPA/Zn2+ or DMPA/trehalose LB films using the quartz crystal microbalance technique, QCM. Their presence within the films was also monitored by catalytic activity assays, using PNPP (p-nitrophenylphosphate) as hydrolysis substrate. For DSAP, the highest enzymatic activity was observed when the immobilization was carried out at low temperature (10o C).

RESUMO As fosfatases alcalinas sao enzimas que participam da atividade catalitica na hidrolise de ésteres fosfóricos. Nesta Dissertação, investigou-se a sua adsorção em monocamadas de Langmuir e também em filmes do tipo Langmuir-Blodgett (LB) de fosfolipídios em diferentes temperaturas. Esses sistemas são considerados como modelos para membranas biológicas. O efeito de um dissacarídeo (trealose), bem como as impurezas contidas na amostra do açúcar, foi testado na subfase que suporta a monocamada,. Constatou-se que a trealose nao purificada altera a isoterma superficial de monocamadas do sal de sódio do acido dimiristoilglicerofosfatidico, DMPA, e atua como um bom agente de ligação entre camadas sucessivas do fosfolipídio para a obtenção de filmes LB. Já para trealose purificada nao se observaram esses efeitos. A caracterização das impurezas foi realizada por espectroscopia na região do infravermelho e por absorção atômica, detectando-se a presença de moléculas anfifílicas e de íons metálicos (Na+, K+, Ca2+, Mg2+), respectivamente. Dois tipos de fosfatases alcalinas foram usadas: uma purificada de placa óssea de ratos por extração com tensoativo nâo-iônico, chamada de DSAP e outra purificada de conídia de Neurospora crassa, denominada CNCAP. As interações com o fosfolipídio foram estudas por meio das mudanças nas curvas -A e a adsorção em filmes LB de DMPA/Zn2+ e DMPA/trealose, por meio da técnica de microbalança a cristal de quartzo (QCM). A presença das enzimas nos filmes foi também comprovada pela detecção de suas atividades catalíticas na hidrolise do PNPP (p-nitrofenilfosfato). Para a DSAP, a melhor atividade foi obtida quando a imobilização da proteína ocorreu a baixa temperatura (10º C). / ABSTRACT Alkaline phosphatases (AP) are unspecific enzymes that hydrolyze phosphate esthers. In this Dissertation we have studied the adsorption of two forms of AP in phospholipid Langmuir monolayers and Langmuir-Blodgett films, considered as biomembrane models, at different temperatures. Further, the effect of the presence of a disaccharide, trehalose, as well as some impurities present in its commercial form, in the subphase of the monolayers was tested. We concluded that the use of trehalose without further purification alters the surface pressure-area (Pi-A) curves of the monolayers. In addition, it acts as a good linking agent between successive layers in the Langmuir-Blodgett films of the sodium salt of 1,2-dimirystoyl-sn-glicero-3-phosphate acid, DMPA. In the presence of purified trehalose instead, these effects were not observed. No difference was noticed in the Pi-A curves of DMPA for trehalose concentrations between 10-3 mmol L-1 to 0.1 mmol L-1. The characterization of the impurities by atomic absorption and infrared spectroscopy reveal the presence of amphiphilic compounds as well as electrolytes such as: sodium, magnesium, calcium and potassium Two forms of AP were used: one purified from rat osseous plates using detergent solubilization, named DSAP, and the other from Neurospora crassa conidia, CNCAP. Enzyme interaction with phospholipids was followed by changes in Pi-A curves, and their adsorption on DMPA/Zn2+ or DMPA/trehalose LB films using the quartz crystal microbalance technique, QCM. Their presence within the films was also monitored by catalytic activity assays, using PNPP (p-nitrophenylphosphate) as hydrolysis substrate. For DSAP, the highest enzymatic activity was observed when the immobilization was carried out at low temperature (10o C).

Made available in DSpace on 2017-07-24T19:38:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bianca Sandrino.pdf: 3843951 bytes, checksum: 505fe1db6a6c07decee103402e3a2a3d (MD5) Previous issue date: 2010-03-05 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The synthesis of biphosphine complex, specifically containing the unit “[RuCln(dppb)]” (dppb = 1,4-bis(diphenylphosphino) butane), has attracted considerable interest due to applications in catalysis for hydrogenation of organic compounds and more recently in biological activities and modified electrodes due to its stability and promising redox property. Within this perspective, in this work the complex mer-[RuCl3(dppb)(VPy)] (VPy = 4-vinylpyridine), RuVPy was synthesized from the replacement of the aqua ligand of the complex mer-[RuCl3(dppb)H2O] by ligand 4-vinylpyridine in the ratio 1:1.1 (complex / ligand). Spectroscopic results indicated that the incorporation of the ligands dppb and VPy yielded bands at 435, 516, 1002, 1087, 1433 and 1484 cm-1, 262, 390, 450, 530 nm coincident with spectra of the serie complex mer-[RuCl3(dppb)(L)] (N-heterocyclic). Values of g tensor (g1 = 2.40, g2 = 2.00 and g3 = 1.69) confirmed the meridional arrangement of chloride ligands around the octahedral complex geometry. An interesting voltammetric profile was observed for RuVPy solution due to the presence of three peaks with oxidation potential values of 0.07, 0.42 and 0.54 V (vs. Ag/AgCl) that emerged after the reduction of core metallic -0.07 V, attributed to redox processes of complexes [Ru2Cl5(dppb)2], [RuCl2(dppb)(4-VPy)2] and [Ru2Cl4(dppb)2(4-VPy)] formed in solution. Immobilization the RuVPy on different surfaces (LB films, casted film, dip-coated film and carbon paste) revealed only one electrochemical process around 0.55 V (vs. Ag/AgCl) assigned to the redox couple RuII/RuIII. Also, was found that the nature of the nanostructured LB films of RuVpy compared to thick films without structural organization due to the higher peak current compared to the films casted films, dip-coated electrode and carbon paste. The versatility of the RuVpy complex was demonstrated by the conversion of 82.5% of cyclohexene in cyclohexane in the hydrogenation catalysis and the conversion of 91% of cyclooctene in epoxide in the oxidation catalysis. Finally, preliminary catalytic tests showed a lower conversion (67%) in the oxidation of cyclooctene when RuVPy is immobilized on silica. / A síntese de complexos bifosfínicos metálicos, mais especificamente contendo a unidade “[RuCln(dppb)]” (dppb= 1,4-bis(difenilfosfina)butano), tem atraído considerável interesse devido às aplicações em catálise de hidrogenação de compostos orgânicos e mais recentemente em atividades biológicas e eletrodos modificados devido a sua estabilidade e promissora propriedade redox. Dentro desta perspectiva neste trabalho sintetizou-se o complexo mer-[RuCl3(dppb)(VPy)] (VPy= 4-vinilpiridina), RuVPy, a partir da substituição do ligante aqua do complexo mer-[RuCl3(dppb)H2O] pelo ligante 4-vinilpiridina na proporção 1:1,1 (complexo/ligante). Resultados espectroscópicos indicaram que houve a incorporação dos ligantes Vpy e dppb, a partir das bandas em 435, 516, 1002, 1087, 1433 e 1484 cm-1, e 262, 390, 450, 530 nm coincidentes com espectros da série de complexos mer-[RuCl3(dppb)L] (N-heterocíclico). Valores de tensor g (g1= 2,40, g2= 2,00 e g3= 1,69) confirmaram a disposição meridional dos ligantes cloretos ao redor da geometria octaédrica do complexo. Um interessante perfil voltamétrico foi observado para o RuVPy em solução, devido à presença de três picos de oxidação com valores de potenciais em 0,07, 0,42 e 0,54 V (vs Ag/AgCl) que surgiram após a redução do centro metálico em -0,07 V, atribuídos aos processos redox dos complexos [Ru2Cl5(dppb)2], [RuCl2(dppb)(4-VPy)2] e [Ru2Cl4(dppb)2(4-VPy)] formados em solução. Ao imobilizar o RuVPy em diferentes superfícies eletródicas (filmes LB, casted, dip-coated e pasta de carbono) observou-se somente um processo em torno de 0,55 V (vs Ag/AgCl) atribuído ao par redox RuII/RuIII. Além disto, constatou-se a natureza nanoestruturada dos filmes LB do RuVpy em função da maior corrente de pico em relação aos filmes casted, dip-coated e do eletrodo de pasta de carbono. A versatilidade do complexo RuVpy foi demonstrada pela conversão de 82,5% de cicloexeno em cicloexano em catálise de hidrogenação, bem como pela conversão de 91% do cicloocteno em epóxido na catálise de oxidação. Por fim, em testes catalíticos preliminares constatou-se menor conversão (67%) na oxidação do cicloocteno quando o RuVPy é imobilizado em sílica.