Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2017-04-24T18:20:13Z No. of bitstreams: 1 AntonioDeAnchietaCamaraJunior_DISSERT.pdf: 21070528 bytes, checksum: bc9c34ff6fd37e4d09b586b82e55c977 (MD5) / Approved for entry into archive by Monica Paiva (monicalpaiva@hotmail.com) on 2017-04-24T18:29:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 AntonioDeAnchietaCamaraJunior_DISSERT.pdf: 21070528 bytes, checksum: bc9c34ff6fd37e4d09b586b82e55c977 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-24T18:29:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AntonioDeAnchietaCamaraJunior_DISSERT.pdf: 21070528 bytes, checksum: bc9c34ff6fd37e4d09b586b82e55c977 (MD5) Previous issue date: 2014-10-07 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico (CNPq) / Mol?culas bioativas tais como flavonoides, antioxidantes e vitaminas podem ser incorporadas a produtos aliment?cios com apelo funcional. No entanto, flavonoides lipossol?veis como a fisetina possuem biodisponibilidade reduzida quando submetidos ao pH do trato gastrointestinal humano. Nesse caso, a microencapsula??o desse tipo de bioativo em c?lulas de levedura Saccharomyces cerevisiae atrav?s de choque osm?tico ? uma estrat?gia promissora para proteger e transportar essas subst?ncias in vivo. Contudo, at? o presente n?o havia sido relatado estudo quantitativo sobre esse processo. Desse modo, este trabalho avaliou a efici?ncia do processo de encapsula??o (EE) e o teor de fisetina internalizada (FI) nas c?lulas da levedura atrav?s de dois m?todos de quantifica??o: (1) cromatografia l?quida de alta efici?ncia (CLAE) e (2) espectrofotometria UV-Vis?vel. Os par?metros operacionais foram determinados por meio do delineamento composto central rotacional 23. As vari?veis analisadas foram a concentra??o de fisetina (C), a press?o osm?tica de desidrata??o (P) e a temperatura do processo (T). A caracteriza??o das c?lulas foi realizada atrav?s de microscopia confocal a laser (MCL), microscopia eletr?nica de varredura (MEV) e viabilidade celular. Os melhores resultados foram obtidos pelo m?todo 2 nas condi??es dos pontos centrais (C = 2,00 mg.mL-1, P = 30 MPa e T = 25 ?C), onde a EE = 33,30 % e teor de FI = 1,20 mg. Os ensaios de MCL mostraram que a etapa de lavagem com etanol, indispens?vel no m?todo 1, influenciou negativamente a EE e o teor de FI. As imagens em alta resolu??o capturadas pela MEV mostraram que o choque osm?tico n?o afetou a estrutura encapsulante do envelope celular da levedura. A manuten??o das c?lulas em solu??es com P ? 30 MPa reduziu ligeiramente a viabilidade celular (84 % vi?veis) e a compara??o com a amostra controle n?o mostrou diferen?a significativa (p.< 0,05). Os resultados encontrados demonstram o forte potencial do uso das leveduras como matrizes encapsulantes para componentes bioativos sens?veis. Estes resultados demonstram que essa t?cnica pode ser aplicada com sucesso na produ??o de produtos aliment?cios com alto teor de compostos bioativos. / Mol?culas bioativas tais como flavonoides, antioxidantes e vitaminas podem ser incorporadas a produtos aliment?cios com apelo funcional. No entanto, flavonoides lipossol?veis como a fisetina possuem biodisponibilidade reduzida quando submetidos ao pH do trato gastrointestinal humano. Nesse caso, a microencapsula??o desse tipo de bioativo em c?lulas de levedura Saccharomyces cerevisiae atrav?s de choque osm?tico ? uma estrat?gia promissora para proteger e transportar essas subst?ncias in vivo. Contudo, at? o presente n?o havia sido relatado estudo quantitativo sobre esse processo. Desse modo, este trabalho avaliou a efici?ncia do processo de encapsula??o (EE) e o teor de fisetina internalizada (FI) nas c?lulas da levedura atrav?s de dois m?todos de quantifica??o: (1) cromatografia l?quida de alta efici?ncia (CLAE) e (2) espectrofotometria UV-Vis?vel. Os par?metros operacionais foram determinados por meio do delineamento composto central rotacional 23. As vari?veis analisadas foram a concentra??o de fisetina (C), a press?o osm?tica de desidrata??o (P) e a temperatura do processo (T). A caracteriza??o das c?lulas foi realizada atrav?s de microscopia confocal a laser (MCL), microscopia eletr?nica de varredura (MEV) e viabilidade celular. Os melhores resultados foram obtidos pelo m?todo 2 nas condi??es dos pontos centrais (C = 2,00 mg.mL-1, P = 30 MPa e T = 25 ?C), onde a EE = 33,30 % e teor de FI = 1,20 mg. Os ensaios de MCL mostraram que a etapa de lavagem com etanol, indispens?vel no m?todo 1, influenciou negativamente a EE e o teor de FI. As imagens em alta resolu??o capturadas pela MEV mostraram que o choque osm?tico n?o afetou a estrutura encapsulante do envelope celular da levedura. A manuten??o das c?lulas em solu??es com P ? 30 MPa reduziu ligeiramente a viabilidade celular (84 % vi?veis) e a compara??o com a amostra controle n?o mostrou diferen?a significativa (p.< 0,05). Os resultados encontrados demonstram o forte potencial do uso das leveduras como matrizes encapsulantes para componentes bioativos sens?veis. Estes resultados demonstram que essa t?cnica pode ser aplicada com sucesso na produ??o de produtos aliment?cios com alto teor de compostos bioativos.

Submitted by Cássia Santos (cassia.bcufg@gmail.com) on 2016-08-12T11:00:29Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Maysa Paula da Costa - 2012.pdf: 1943875 bytes, checksum: b80f4f02efcb888e3b6b59c7d58f6bc8 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-08-12T14:06:08Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Maysa Paula da Costa - 2012.pdf: 1943875 bytes, checksum: b80f4f02efcb888e3b6b59c7d58f6bc8 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-12T14:06:08Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Maysa Paula da Costa - 2012.pdf: 1943875 bytes, checksum: b80f4f02efcb888e3b6b59c7d58f6bc8 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Increases in antimicrobial resistance and the side effects of available antifungal drugs have increased the need to develop new and more effective antifungal agents. Among the compounds extracted from plants, flavonoids have been considered to be possible sources of new therapeutics for fungal, bacterial and viral infections. The antifungal mechanism of action and toxicity of fisetin, flavonoid with antifungal activity previously established for the Cryptococcus neoformans species complex and dermatophytes were determined. The action of this flavonoid was evaluated by quantitation of ergosterol, cell viability by flow cytometry and by changes in fungal morphology visualized by scanning electron microscopy. The fisetin toxicity was determined in vitro through the evaluation of hemolytic and myelotoxic potential and in vivo by acute oral toxicity. Hepatotoxicity of this flavonoid in hepatocellular carcinoma cell line (Hepg2) was performed by determination of mitochondrial viability using the MTT reduction method, evaluation of cellular and nuclear morphology by staining with May-Grunwald-Giemsa and Hoechst 33342 and analysis of viability and death cell by method of phosphatidylserine externalization. The obtained results have allowed to verify that the yeast subjected to the action of the fisetin showed a content ergosterol reduction, changes in cellular metabolism viewed in flow cytometry. Fungal cells treated with fisetin and observed by scanning electron microscopy showed in the analysis of yeast C. neoformans complex, retraction in the cell cytoplasm and in the dermatophytes there have been changes in hyphae and sharp reduction of conidia. The toxicological analysis of fisetin, observed a low potential hemolytic and an absence of damage on the granulocyte-macrophage progenitors cells. Animals treated with fisetin did not show behavioral changes, with liver and kidneys macroscopically normal. The cytotoxicity assessment observed on HepG2 cells in different concentrations of the compound showed cell viability with a range of 65.9% to 18.5% at concentrations from 3.12 to 400 μg/mL fisetin, suggesting that the action this flavonoid on the HepG2 cell line is concentration-dependent. Rare cellular and nuclear morphological changes, with few cells in apoptosis were observed in HepG2 cells in the presence of fisetin. In conclusion, although many cytotoxicity assays and mechanism of action must be made to introduce fisetin as a new drug, the present results show a favorable profile to conduct the study and development of this substance in the treatment of cryptococcosis and dermatophytosis. / O aumento na resistência aos antibióticos e os efeitos colaterais dos antifúngicos disponíveis têm aumentado a necessidade de desenvolver novos e mais eficazes agentes antifúngicos. Entre os compostos extraídos de plantas, os flavonóides são considerados como possíveis fontes de novos agentes terapêuticos para infecções fúngicas, bacterianas e virais. O mecanismo de ação antifúngica e a toxicidade de fisetina, flavonóide com atividade antifúngica previamente estabelecida para o complexo de espécies Cryptococcus neoformans e dermatófitos, foram determinados. A ação deste flavonóide foi avaliada pelo doseamento de ergosterol, pela viabilidade celular por citometria de fluxo e por alterações na morfologia fúngica visualizadas por microscopia eletrônica de varredura. A toxicidade de fisetina foi determinada in vitro através da avaliação do potencial hemolítico e mielotóxico e in vivo pela toxicidade oral aguda. A hepatotoxicidade deste flavonóide, em células da linhagem de carcinoma hepatocelular HepG2, foi realizada pela determinação da viabilidade mitocondrial usando o método de redução de MTT, avaliação da morfologia celular e nuclear por coloração com May-Grunwald-Giemsa e Hoechst 33342 e análise da viabilidade e morte celular pelo método de externalização da fosfatidilserina. Os resultados obtidos permitiram verificar que as leveduras submetidas à ação de fisetina apresentaram redução do conteúdo de ergosterol, alteração no metabolismo celular visualizadas na citometria de fluxo. As células fúngicas tratadas com fisetina e observadas por microscopia eletrônica de varredura apresentaram, na análise de leveduras do complexo C. neoformans, retração no citoplasma celular e nos dermatófitos verificaram-se modificações nas hifas e redução acentuada de conídios. Na análise toxicológica de fisetina, observou-se baixo potencial hemolítico e ausência de danos nas células progenitoras de granulócitos e macrófagos. Animais tratados com fisetina não apresentaram alterações de comportamento, com fígado e rins macroscopicamente normais. A avaliação de citotoxicidade verificada sobre células HepG2 em diferentes concentrações do composto mostrou viabilidade celular com uma variação de 65,9% a 18,5% em concentrações de 3,12 a 400 μg/mL de fisetina, sugerindo que a ação deste flavonóide sobre a linhagem celular HepG2 é concentração-dependente. Raras alterações morfológicas celulares e nucleares, com poucas células em apoptose foram observadas em HepG2 na presença de fisetina. Concluindo, embora vários outros testes de citotoxicidade e mecanismo de ação devam ser realizados para a introdução de fisetina como um novo fármaco, os resultados apresentados mostram um perfil favorável para conduzir ao estudo e desenvolvimento desta substância no tratamento de criptococose e dermatofitose.