Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-07-19T13:40:35Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 4542523 bytes, checksum: c68041abd5ef22ab9466db888a2ebc85 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-19T13:40:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 4542523 bytes, checksum: c68041abd5ef22ab9466db888a2ebc85 (MD5) Previous issue date: 2001-11-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Um complexo viral causando mosaico dourado e deformação (rugosidade) foliar em tomateiros na região do Triângulo Mineiro, MG, Brasil, foi obtido por meio de moscas brancas virulíferas, e denominado TGV-Ub1. Os vírus presentes neste complexo viral foram transmitidos via extrato vegetal tamponado (EVT) a partir de folhas de tomateiro para plantas de Nicotiana benthamiana. A análise via PCR utilizando oligonucleotídeos universais para o gênero Begomovirus indicou a amplificação de dois fragmentos distintos para o componente A e para o componente B, sugerindo que o complexo viral TGV-Ub1 é composto por dois vírus distintos. De fato, dois geminivírus foram purificados biologicamente a partir do complexo viral TGV-Ub1, e causaram em tomateiro sintomas de mosaico dourado suave, sem rugosidade. O complexo viral TGV--Ub1 infectou apenas plantas da família Solanaceae, incluindo várias espécies de Nicotiana e Solanum tuberosum, e excluindo S. melongena, S. gilo, Capsicum annuum e C. frutescens. Obtiveram-se 87 clones com cerca de 2.600 nucleotídeos a partir de folhas de tomateiro infectado pelo complexo viral TGV-Ub1. A comparação das seqüências completas de nucleotídeos dos clones pUb1-49 (DNA-A), pUb1-62 e pUb1-81 (ambos DNA-B) indicou que esses componentes pertencem a novos begomovírus. Com base em análise filogenética, esses componentes foram classificados como pertencente a um begomovírus do hemisfério ocidental. Os clones pUb1-49 e -81 possuem regiões comuns idênticas. Este vírus foi denominado Tomato rugose mosaic virus (TRMV). O clone pUb1-62 possui região comum distinta do TRMV e de todos os demais geminivírus descritos. O DNA-A cognato de pUb1-62 não foi encontrado. Clones contendo 1,5 cópia dos componentes genômicos clonados em pUb1-49, -62 e -81 foram construídos. A análise da infectividade desses clones em Santa Clara e em N. benthamiana, por meio de bombardeamento de partículas, demonstrou que a combinação dos clones correspondentes ao genoma do TRMV causou sintomas sistêmicos nos dois hospedeiros, semelhantes àqueles causados pelos isolados puros obtidos neste trabalho. A combinação dos clones pUb1-49 e -62 não resultou em infecção sistêmica, indicando que esses dois componentes não formam pseudo-recombinantes viáveis. O TRMV foi transmitido via EVT a partir de folhas de N. benthamiana para N. benthamiana, e, por enxertia para S. tuberosum e Datura stramonium. Amostras de tomateiro apresentando sintomas semelhantes a mosaico dourado foram coletadas em três municípios da região do Triângulo Mineiro. Análise via PCR indicou que 148 das 170 amostras coletadas estavam infectadas por begomovírus. Das amostras infectadas, apenas uma hibridizou a 68°C com sonda para o componente A do TRMV, 109 hibridizaram a 58°C com esta sonda e 39 não hibridizaram com esta sonda em nenhuma das duas temperaturas, indicando que a maioria das amostras continha geminivírus geneticamente relacionado ao TRMV. Os componentes TRMV-A e TRMV-B foram detectados, respectivamente, em plantas de Nicandra physaloides (joá de capote) e Phaseolus vulgaris (feijão comum) coletadas em lavouras de tomateiro. Análise genética baseada em PCR-RFLP de fragmentos amplificados a partir das amostras coletadas indicou a existência de um alto grau de diversidade genética de begomovírus em tomateiros da região do Triângulo Mineiro. / A viral complex causing golden mosaic and leaf distortion (rugosity) in tomato plants in the Triângulo Mineiro region, Minas Gerais, Brasil, was obtained from viruliferous whiteflies, and named TGV-Ub1. This viral complex was sap-transmitted from tomato leaves to Nicotiana benthamiana plants. PCR amplification using universal primers for the genus Begomovirus yielded two distinct fragments for the A and B components of the viral genome. This suggested that the TGV-Ub1 complex was composed of two distinct viruses. Indeed, two geminiviruses were biologically purified from the TGV-Ub1 complex, and shown to cause symptoms of mild golden mosaic with no rugosity on tomato plants. The TGV-Ub1 complex infected only plants in the Solanaceae, including several Nicotiana species and Solanum tuberosum, but excluding S. melongena, S. gilo, Capsicum annuum and C. frutescens. Eighty-seven clones corresponding to full-length (~2.600 nucleotides) viral genomes were obtained from tomato leaves infected with TGV-Ub1. Comparisons of the complete nucleotide sequences of clones pUb1-49 (DNA-A), pUb1-62 and pUb1-81 (both DNA-B) indicated that they comprise new begomoviruses. By phylogenetic analysis, these components were identified as belonging to a begomovirus from the western hemisphere. Clones pUb1-49 and -81 showed identical common regions. This virus was named Tomato rugose mosaic virus (TRMV). Clone pUb1-62 has a distinct common region from TRMV and all other known geminiviruses. A cognate DNA-A for pUb1-62 was not found. Clones containing 1.5 copies of the genomic components cloned in pUb1-49, -62 and -81 were constructed. Infectivity analysis of these clones in Santa Clara and N. benthamiana plants using particle bombardment demonstrated that the combination of clones corresponding to the TRMV genome resulted in systemic symptoms in both hosts. These symptoms were analogous to those observed when using the pure isolates obtained in this study. The combination of pUb1-49 and -62 did not result in systemic infection, indicating that these two components do not form viable pseudo-recombinants. TRMV was sap-transmitted from N. benthamiana leaves to N. benthamiana plants, and by grafting to S. tuberosum and Datura stramonium. Samples from tomato plants showing symptoms similar to golden mosaic were collected in three different municipal districts in the region of Triângulo Mineiro. PCR analysis indicated that 148 out of 170 collected samples were infected with a begomovirus. From these infected samples, only one hybridized at 68°C to a specific probe for the DNA-A of TRMV. However, 109 samples hybridized at 58°C to the same probe. Thirty- nine samples did not hybridize to this probe at either temperature. These results indicated that most of the samples contained geminiviruses genetically related to TRMV. TRMV-A and TRMV-B were detected, respectively, in plants of Nicandra physaloides and Phaseolus vulgaris growing naturally nearby tomato fields. A genetic analysis based on PCR-RFLP from fragments obtained from collected samples demonstrated the existence of a high degree of genetic diversity of begomoviruses in tomato plants cultivated in the region of Triângulo Mineiro.

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2017-03-27T12:03:26Z No. of bitstreams: 1 Paula Radaelli.pdf: 1280329 bytes, checksum: 00e048f01119106e351e005b652d1b99 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-27T12:03:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Paula Radaelli.pdf: 1280329 bytes, checksum: 00e048f01119106e351e005b652d1b99 (MD5) Previous issue date: 2009-03-09 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The vegetative propagation of the grapevine (Vitis spp.) facilitates the dissemination of pathogens, such as viruses, favoring the appearance of complex diseases, by accumulation of different virus species in the same plant. Among the diseases that affect the grapevine, those caused by viruses are the most difficult to control because the dissemination and the accumulation of viruses are favored by the transport and use of infected propagative material. Due to advanced studies with molecular biology, evidences suggest that some grapevine viruses, as Rupestris stem pitting-associated virus (RSPaV), Grapevine leafroll-associated virus 2 (GLRaV-2) and Grapevine fanleaf virus (GFLV) frequently present polymorphic sequences, as well as mixing infections with other viruses, making difficult to define the biological properties of the different virus variants. Therefore, one objective of this work was to evaluate the variability of these three important viruses of grapevine using the molecular characterization of the coat protein (CP) gene. Fragments comprising the complete CP genes of RSPaV, GLRaV-2 and of GFLV isolates were amplifiedby RT-PCR, using primers for specific regions of each viral species, allowing the separation of the isolate groups by phylogenetic analyses of the sequences. The isolates of each viral species here studied were additionally detected by non-radioactive probes with digoxigenin, allowing unambiguous identification of infected samples, independently of the isolate used as template for probe synthesis. The methods of diagnosis of the grapevine virus diseases can be divided in three categories. The two traditional ones include the biological tests and the serologic diagnosis. Recently, the molecular methods of diagnosis have been developed, comprising the tests RT-PCR, IC-RT-PCR and real time RT-PCR. This last one is the most advanced technique of diagnose and quantification of nucleic acids, accomplishing amplifications in precisely way and with higher reproducibility, allowing the detention of more than one virus in a single reaction. Considering the difficulties to detect virus in grapevine, and the high cost of the diagnosis methods it was considered the production ofantisera against isolates of GLRaV-2 and Grapevine virus B (GVB), developed from CPs expressed in Escherichia coli and to test the possibility of using themfor detecting these two viruses in infected grapevines. The CP genes were amplified by RT-PCR, cloned, sequenced and later subcloned, where the recombinant plasmids were employed in the transformation of E. coli and in the expression of CPs. The proteins were purified, their identities confirmed by SDS-PAGE and Western blot and used for immunizing rabbit. The antisera produced against these proteins were capable to recognize corresponding recombinant proteins in Western blot and to detect GLRaV-2 and GVB in infected grapevines by indirect ELISA, as well as discriminating healthy and infected grapevines. Many viruses that infect grapevine occur in concentrations under the limit of detention of the diagnostic tests commonly used. Considering this fact, another objective of the present work was to detect important viruses of the genera Closterovirus (GLRaV-2) and Ampelovirus (Grapevine leafroll-associated virus 1 - GLRaV-1 and Grapevine leafroll-associated virus 3- GLRaV-3), family Closteroviridae, as well as the viruses of the genera Foveavirus (RSPaV) and Vitivirus (Grapevine virus A (GVA) and the GVB),family Flexiviridae, by real time RT-PCR (TaqMan®). For ampelovirus, with degenerate primers and specific probes GLRaV-1 and GLRaV-3 were detected in isolates and/or cultivars tested. For closterovirus with degenerate primers and specific probes GLRaV-2 was detected in all cultivars tested and in Nicotiana benthamiana. The members of the family Flexiviridae GVA, GVB and RSPaV were detected by multiplex RT-PCR (TaqMan®), demonstrating that RT-PCR TaqMan® is a fast method for molecular diagnosis, quantitative, reliable, sensitive and applicable for detecting more than one virus in the same reaction. / A videira (Vitis spp.), por ser propagada vegetativamente, facilita a disseminação de patógenos, como os vírus, favorecendo o aparecimento de doenças complexas, pelo acúmulo de diferentes espécies virais numa mesma planta. Entre as doenças que afetam a videira, as viroses são as mais difíceis de controlar, pois a disseminação e o acúmulo de vírus são favorecidos pelo transporte e emprego de material propagativo infectado. Devido a avançados estudos por meio da biologia molecular, evidências sugerem que alguns vírus em videira, como Rupestris stem pitting-associated virus (RSPaV), Grapevine leafroll-associated virus 2 (GLRaV-2) e Grapevine fanleaf virus (GFLV) frequentemente apresentam muitas seqüências variáveis, bem como infecções mistas com outros vírus, dificultando a definição das propriedades biológicas das diferentes variantes deste vírus. Um dos objetivos do presente trabalho foiavaliar a variabilidade genética destes três importantes vírus da videira através da caracterização molecular do gene da proteína capsidial (CP). Foram amplificados fragmentos que compreendem os genes completos da CP de isolados de RSPaV, GLRaV-2 e de GFLV por RT-PCR, utilizando-se primers específicos para cada espécie viral, permitindo a separação em grupos dos isolados estudados por análise filogenética das seqüências obtidas. Os diferentes isolados das três espécies virais estudadas também foram detectados utilizando-se hibridização com sondas não radioativas, marcadas com digoxigenina, possibilitando identificar de forma inequívoca as amostras infectadas, independentemente dos isolados virais empregados para síntese das sondas. Os métodos de diagnóstico das viroses da videira podem ser divididos em três categorias. As duas tradicionais incluem os testes biológicos e o diagnóstico sorológico. Mais recentemente, desenvolveram-se os métodos de diagnóstico molecular, com os testes RT-PCR, IC-RT-PCR e RT-PCR em tempo real. Este último é o mais avançado para diagnose e quantificação deácidos nucléicos, pois realiza amplificações de maneira precisa e com maior reprodutibilidade, além de permitir a detecção de mais de um vírus em uma só reação. Devido às dificuldades em detectar vírus em videira, além do custo elevado dos métodos de diagnose, propôs-se a produção de antissorosespecíficos contra isolados de GLRaV-2 e Grapevine virus B (GVB), desenvolvidos a partir da proteína capsidial expressa em Escherichia coli, e testar seu possível uso para a detecção destes dois vírus, em videiras infectadas. Os genes das CPs foram amplificados via RT-PCR, clonados, seqüenciados e posteriormente subclonados, onde os plasmídeos recombinantes foram empregados na transformação de E. coli e na expressão das proteínas capsidiais. Estas foram purificadas, suas identidades confirmadas em SDS-PAGE e “Western blot”, utilizadas para imunizar coelho. Os antissoros produzidos contra estas proteínas foram capazes de reconhecer as proteínas recombinantes correspondentes em “Western blot” e detectar GLRaV-2 e GVB em tecidos infectados de videiras pelo ELISA indireto, bem como discriminar videiras sadias e infectadas. Muitos vírus que infectam a videira ocorrem em concentrações abaixo do limite de detecção dos testes diagnósticos comumente utilizados. Com isso, um outro objetivo deste trabalho foi detectar importantes vírus dos gêneros Closterovirus (GLRaV-2) eAmpelovirus (Grapevine leafroll-associated virus 1- GLRaV-1 e Grapevine leafroll-associated virus 3 - GLRaV-3), família Closteroviridae, bem como os vírus dos gêneros Foveavirus (RSPaV) e Vitivirus (Grapevine virus A (GVA) e GVB), família Flexiviridae, através de RT-PCR em tempo real (TaqMan®). Para ampelovírus, com primers degenerados e sondas específicas, foram detectados GLRaV-1 e GLRaV-3 nos isolados e /ou cultivares testados. Para closterovírus, com primers degenerados e sonda específica, detectou-se GLRaV-2 em todas as cultivares testadas e em Nicotiana benthamiana. Os membros da família Flexiviridae GVA, GVB e RSPaV foram detectados através de multiplex RT-PCR (TaqMan®), demonstrando-se assim, que a RT-PCR TaqMan® é um método de diagnóstico molecular rápido, quantitativo, confiável, sensível e capaz de detectar mais de um vírus na mesma reação.