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Charakterisierung und Modifizierung poröser Cellulosepartikel für die flüssige Hochleistungs-Chromatographie und ihr Einsatz zur Untersuchung von Protein-Wechselwirkungen

Wieland, Christoph 01 March 2010 (has links)
Perlcellulose stellt ein interessantes Material für den Einsatz in der wässrigen Größenausschlusschromatgraphie (SEC) dar. Sie ist aufgrund ihrer guten Modifizierbarkeit zudem ein perfektes Ausgangsmaterial für Protein-Aggregationsuntersuchungen. Ein Protein von besonderem praktischem Interesse ist Insulin. Dessen Fehlfaltung und Aggregation verursacht eine Reihe von schwerwiegenden Problemen (z.B. in Drug-Delivery-Systemen). Hierbei erfolgt eine Umwandlung von alpha-Helix- in beta-Faltblatt-Strukturen wobei sich unlösliche Fibrillen bilden. Deren Rückfaltung mit Hilfe fluorierter Alkohole sowie mit fluorierten Nanopartikeln wurde in der Literatur beschrieben. Der Ansatzpunkt dieser Arbeit war es zu untersuchen, ob Fluor auf Oberflächen mit hohem Anteil von Hydroxygruppen eine Rückfaltung von Proteinen wie Insulin bewirken kann. Das Ziel war es, schaltbare stationäre Phasen zu erhalten, mit denen sowohl eine Rückfaltung als auch die Trennung von Proteinen durchgeführt werden können. Zunächst erfolgte die Charakterisierung geeigneter Perlcellulosen, wobei erstmals eine Kombination der „klassischen“ Porosimetrie (Hg-Intrusion, N2-Sorption) mit SAXS und Inverser SEC zur Untersuchung der Porenstruktur von Cellulose angewandt wurde. Es konnte die reversible Schrumpfung der Poren während der Trockungsprozesse beschrieben werden. Die Immobilisierung von Fluor auf der Oberfläche von Cellulosepartikeln erfolgte u.a. durch Pfropfung von fluorierten Acrylaten mittels Cer(IV)-Redoxinitiierung. Es gelang eine homopolymerfreie Pfropfung, wobei es zu keiner Veränderung der Porenstruktur kam. Die Kontrolle der Proteinadsorption auf der modifizierten Oberfläche mittels chemischer Stimuli konnte beschrieben werden. Aggregationsuntersuchungen mittels SEC, DLS und SAXS ergaben, dass fluormodifizierte Perlcellulose keine Verzögerung der Insulinaggregation bewirkt. Jedoch zeigte sich, dass unmodifizierte Perlcellulose eine signifikante Verzögerung der Aggregation bewirken kann. / Porous bead cellulose is an interesting material for the application in aqueous size exclusion chromatography (SEC). Its good modifiability makes it furthermore to a perfect starting material for protein aggregation studies. A protein with huge practical importance is insulin. Misfolding and aggregation of insulin creates serious problems e.g. in drug delivery systems. Thereby it undergoes a change from alpha-helix to beta-sheet structure and forms insoluble fibrils. A back-folding with (toxic) fluorinated alcohols and fluorinated nanoparticles was already shown in literature. The approach for this work was that fluorine (CF3-) on a surface with high hydroxyl-content can induce the back folding of proteins like insulin. The purpose was to get stationary phases that can induce back folding and separation of proteins on a single column. At first a characterization of suitable cellulose beads with focus on different porosimetry methods was done. For the first time a combination of “classical” porosimetry methods (Hg-Intrusion; N2-Sorption) with SAXS and inverse SEC was applied for porous cellulose particles. A reversible shrinking of pores during drying process was shown. Immobilization of fluorine on the surface of cellulose beads was done by grafting of fluorinated acrylates via cer(IV)-redox-initiation and by polymer analogous reaction with fluorinated iodo alkanes. Homopolymer free graft-copolymerization was achieved, whereas no effect on pore structure was observed. The control of protein adsorption on surface by chemical stimuli was shown. Aggregation studies using SEC, DLS and SAXS showed that fluoro-modified cellulose beads do not delay insulin-aggregation due to strong adsorption effects. Though a significant aggregation delay for insulin with unmodified cellulose beads was discovered.
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Establishment, validation and application of immunological and LC-MS/MS-based detection methods to study the role of human aromatic L-amino acid decarboxylase as an enzyme potentially involved in thyronamine biosynthesis

Höfig, Carolin 18 December 2012 (has links)
Thyronamine (TAM) sind eine neue Molekülklasse, die endokrinologische und metabolische Prozesse miteinander vereinen. Der biologisch aktive Metabolit 3-Iod-L-Thyronamin (3-T1AM) wird durch eine kombinierte Deiodierung und Decarboxylierung von Schilddrüsenhormonen (TH) gebildet. Existierende Methoden zum Nachweis und zur Quantifizierung von 3-T1AM im menschlichen Serum sind immer noch umstritten. Auch die an der Biosynthese vermutlich beteiligte TH-Decarboxylase konnte noch nicht identifiziert werden. Für die Identifizierung und Quantifizierung von TH und TAM Profilen wurde die Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) verwendet. In der bisherigen präanalytischen Aufarbeitung liefern weder Flüssig-Flüssig- noch Festphasenextraktionen reproduzierbare Ergebnisse des 3-T1AM-Gehalts im Serum. Mit der Entwicklung eines spezifischen Extraktionsverfahrens und nachfolgender Detektion mittels LC-MS/MS gelang der gleichzeitige Nachweis der häufigsten TH im humanen Serum. Parallel dazu wurden monoklonale Antikörper gegen 3-T1AM entwickelt, auf deren Basis ein quantitativer 3-T1AM Chemilumineszenz-Immunoassay entstand. Ergebnisse aus klinischen Kollektiven zeigen, dass 3-T1AM im Serum im nM Konzentrationsbereich vorkommt und dass 3-T1AM bei Patienten außerhalb der Schilddrüse produziert wird. Viele Forscher gehen davon aus, dass die aromatische L-Aminosäure Decarboxylase (AADC) die Synthese von TAM über Decarboxylierung von TH katalysiert. Diese Hypothese wurde durch Inkubation von rekombinanter humaner AADC mit TH getestet. In keinem der Experimente konnte AADC die Decarboxylierung von TH katalysieren. Zusammenfassend ist die Bestimmung von 3-T1AM im Serum mittels LC-MS/MS aufgrund der nicht reproduzierbaren präanalytischen Probenaufbereitung problematisch. In dieser Arbeit wird der erste MAb-basierte 3-T1AM assay vorgestellt, der 3-T1AM zuverlässig in humanem Serum quantifiziert. Die AADC ist wahrscheinlich nicht an der Biosynthese von TAM beteiligt. / Thyronamines (TAM) are a new class of molecules linking endocrinology and metabolism. Combined deiodination and decarboxylation of thyroid hormones (TH) generates a biologically active ‘cooling’ metabolite, 3-iodo-L-thyronamine (3-T1AM).. It remains controversial, which methods are able or not to reliably detect 3-T1AM in human serum, and the presumed TH decarboxylase is still elusive. Liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) was used for the simultane-ous identification and quantification of TH and TAM profiles in biological samples. Several preanalytical methods were tested for complete extraction of 3-T1AM in human serum. Thus far, neither liquid-liquid nor solid-phase extraction methods allowed reproducible extraction of 3-T1AM from human serum samples in the preanalytical sample workup. Nevertheless, a rapid and sensitive extraction procedure was developed for detection of the major TH by LC-MS/MS in a single human serum sample. In parallel, monoclonal antibodies (MAb) targeting 3-T1AM were developed and characterized, and a highly specific quantitative 3-T1AM MAb-based chemiluminescence immunoassay was developed. Studies in clinical cohorts provide evidence that 3-T1AM is present in human serum in the nM concentration range and that 3-T1AM is produced extrathyroidally. Many researchers have reasoned that the aromatic L-amino acid decarboxylase (AADC) mediates TAM synthesis via decarboxylation of TH. This hypothesis was tested by incubating recombinant human AADC with several TH. In all tested conditions, AADC failed to catalyze the decarboxylation of TH. These in vitro observations are supported by the finding that 3-T1AM is also present in plasma samples of patients with AADC deficiency. In summary, 3-T1AM detection in serum using LC-MS/MS encounters preanalytical problems. The first MAb-based 3-T1AM CLIA is presented, which reliably quantifies 3-T1AM in human serum. AADC is likely not involved in TAM biosynthesis.
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Aufbau und Anwendung einer Methode zur Identifizierung und Quantifizierung von Giften und deren Metaboliten in Blut und Haaren in der Systematischen Toxikologischen Analyse mittels Flüssigchromatographie-Quadrupol-Flugzeitmassenspektrometrie-Kopplung (LC-QTOF-MS)

Broecker, Sebastian 15 February 2012 (has links)
Die Systematische Toxikologische Analyse (STA) stellt auf Grund der großen Vielfalt und der ständigen Zunahme an toxikologisch relevanten Substanzen eine der größten Herausforderungen in der chemischen Analyse dar. In der vorliegenden Arbeit wurde daher die Eignung der Flüssigchromatographie in Kombination mit der Hybrid-Quadrupol-Flugzeitmassenspektrometrie (LC-QTOF-MS) für diesen Zweck untersucht. Dazu wurden eine Datenbank mit über 7360 und eine CID-Spektrenbibliothek mit mehr als 2720 toxikologisch relevanten Substanzen erstellt und geeignete Probenvorbereitungsmethoden entwickelt. Die Erprobung der Methoden erfolgte an dotierten Blut- und Haarproben. Hierbei zeigte sich, dass die Analyse im Auto-MS/MS-Modus (Messzyklen von MS- und MS/MS-Spektren) eine Identifizierung basischer Substanzen mittels CID-Spektren zwischen 0,5 und 2 ng/ml im Blut ermöglichte. Die Nachweisgrenzen der für 24 Wirkstoffe validierten Methode in Haaren lagen bei 3 bis 15 pg/mg. Die Eignung der LC-QTOF-MS zur STA von Haarproben wurde an 30 Drogentodesfällen und 60 Todesfällen mit bekannter chronischer Medikamenteneinnahme zu Lebzeiten sowie an 77 Blutproben nachgewiesen. Für die Suche nach Metaboliten wurde ein Metaboliten-Tool entwickelt. In der praktischen Anwendung auf Datenfiles von Blut- und Haarproben erwies sich das Tool als wertvolles Hilfsmittel zur Identifizierung unbekannter Peaks und zur Bestätigung von Suchergebnissen in der Datenbank. Zur automatischen Konzentrationsabschätzung identifizierter Substanzen wurde ein Tool „Estimate Concentration“ geschaffen. Die Überprüfung des Verfahrens an realen Blut- und Haarproben durch Vergleich mit HPLC-DAD- und GC-MS-Ergebnissen wies eine gute Übereinstimmung der Konzentrationen auf. Insgesamt zeigten die Untersuchungen, dass die LC-QTOF-MS zurzeit die am besten geeignete Methode für die STA darstellt. Auch bei einem erst später aufkommenden Verdacht kann eine gezielte Suche in dem bereits gemessenen Datenfile durchgeführt werden. / Due to the large variety and the steady increase of toxicologically relevant substances, systematic toxicological analysis (STA) is one of the most difficult tasks in analytical chemistry and, therefore, a steady topic of research and methodical improvement. For this reason, the suitability of liquid chromatography in combination with hybrid quadrupole time-of-flight mass spectrometry (LC-QTOF-MS) for STA was investigated. For this purpose, a database of more than 7360 and a CID spectra library of more than 2720 toxicologically relevant substances and suitable methods for sample preparation were developed. The application was evaluated at spiked blood and hair samples. It was found that the analysis in Auto-MS/MS mode (alternating measurement cycles of MS and MS/MS spectra) allowed substance identification in blood using CID spectra between 0.5 and 2 ng/ml for basic substances. The detection limits of the validated method in hair ranged from 3 to 15 pg/mg for 24 drugs. The suitability of LC-QTOF-MS for STA was tested for hair samples from 30 drug-related death cases and from 60 death cases with known chronic medication as well as for 77 blood samples. For the search of metabolites, a metabolite tool was developed. In the practical application to data files from blood and hair samples, the tool proved to be very helpful for identification of unknown peaks and for confirmation of results obtained only from the database without CID spectra. A tool "Estimate Concentration" was created for automatic estimation of concentrations of identified substances. The application to real blood and hair samples and the comparison of the concentrations with results from HPLC-DAD and GC-MS showed good agreement. Overall, these investigations showed that LC-QTOF-MS is currently the most favorable method for STA. Because of the comprehensive registration of all substances in a sample, the data files can be checked for the presence of certain poisons even later without new measurements.

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