Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2007. / Titre de l'écran-titre (visionné le 5 mai 2008). Bibliogr.

Le champignon Pseudozyma flocculosa a été particulièrement étudié pour son activité biologique contre le blanc (Érysiphales). Par génie génétique, un glycolipide à activité antifongique, la flocculosine, a été isolé et caractérisé. Bien que le spectre d'activité de cette molécule ait été identifié, les conditions in vitro et in vivo dans lesquelles ce composé est synthétisé ne sont pas encore élucidées. La première partie de ce travail consistait à déterminer les besoins nutritionnels de P. flocculosa ainsi que les paramètres jouant un rôle primordial dans la synthèse de la flocculosine. Suite à cette étude, nous avons pu atteindre une productivité de 15 g/1 de flocculosine et définir certains éléments influençant la synthèse de la molécule. En bref, la disponibilité d'une source de carbone et l'ajout de l'extrait de levure sont apparus comme les deux principaux facteurs ayant un impact majeur sur la synthèse du glycolipide. Dans la deuxième partie de ce projet, nous nous sommes intéressés à l'investigation des changements métaboliques corrélés à la synthèse de la flocculosine. Pour ce faire, nous avons effectué une étude protéomique dans deux conditions de production différentes (inductrice et répressive). La comparaison des deux profils protéomiques a montré une diminution drastique du nombre total des protéines suggérant que le champignon produit cette molécule pour contourner le déséquilibre métabolique provoqué par la condition de stress. Enfin, nous avons tenté de déterminer le rôle exact de la flocculosine dans le cadre de la relation tritrophique plante-agent pathogène-P. flocculosa. Nous avons suivi en particulier l'expression du gène cypl, impliqué dans la synthèse de cette molécule, lorsque P. flocculosa était soumis à différentes conditions environnementales. Cette étude nous a permis de conclure que P. flocculosa synthétisait la flocculosine in vivo en réponse aux disponibilités variables des substrats à la surface de la feuille.

Le champignon Pseudozyma flocculosa a été particulièrement étudié pour son activité de lutte biologique contre le blanc. Par génie génétique, une molécule à activité antifongique, la flocculosine, a été isolée et caractérisée. Suite à ces travaux, l'utilisation des champignons du genre Pseudozyma pour la production de protéines recombinantes a présenté un nouvel axe de recherche. Toutefois, la variété des outils moléculaires disponibles pour l'étude des Pseudozyma spp. est limitée aux séquences régulatrices (promoteur, terminateur) du gène HSP70 d'un champignon voisin, Ustilago maydis. Les objectifs de notre recherche étaient donc les suivants : 1) obtenir des séquences promotrices de P. flocculosa; 2) comparer l'activité de ces séquences promotrices avec le promoteur HSP70; et 3) démontrer l'utilité de ces outils moléculaires dans le contexte d'une nouvelle approche d'étude de l'écologie de P. flocculosa. Dans un premier temps, un promoteur spécifique a été ciblé, soit le promoteur du gène d'actine car celui-ci est reconnu comme étant fort et constitutif chez d'autres champignons. En parallèle, un promoteur dont les transcrits étaient parmi les plus abondants dans des conditions de cultures déterminées a été identifié et cloné. Le gène codant pour la glycéraldéhyde 3-phosphate-déshydrogénase (GPD), une enzyme importante du métabolisme carboné de la cellule, a donc pu être cloné et séquencé. Nous avons ainsi obtenu 1133 pb de la séquence promotrice du gène d'actine et 1139 pb du gène GPD de P. flocculosa. Dans un deuxième temps, la comparaison de la force de ces deux promoteurs avec celle du promoteur HSP70 a permis d'établir que les promoteurs d'actine et de GPD présentaient une activité forte chez P. flocculosa et comparable à celle de HSP70 chez P. antarctica. Enfin, le développement d'une souche de P. flocculosa (Act4) exprimant de façon constitutive la GFP a permis son observation in situ pendant l'interaction tritrophique plante-agent pathogène-agent de lutte biologique. Il a ainsi été possible de montrer que P. flocculosa ne présentait pas de croissance remarquable en absence du blanc sur la feuille et ce, quelle que soit la plante-hôte utilisée. Néanmoins, en présence des structures du champignon pathogène, le développement de la souche Act4 était clairement stimulé.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2008. / Bibliogr. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Ce projet de recherche avait pour but d'identifier les facteurs favorisant l'activité de Pseudozyma flocculosa, un agent de lutte biologique contre le blanc des cultures agricoles. Pour réaliser cette identification, nous avons d'abord analysé le développement de P. flocculosa en présence d'extrait de levure (YNB), reconnu pour reproduire le comportement de P. flocculosa en conditions naturelles d'antagonisme du blanc. Les objectifs de l'étude étaient: 1) évaluer l'activité des différentes fractions de l'extrait de levure sur la croissance et la morphologie de P. flocculosa; 2) caractériser la nature de la (des) molécule(s) dans la fraction active et 3) déterminer la relation entre la (les) molécule(s) provenant de l'extrait de levure et celle(s) exsudée(s) par le blanc au contact de P. flocculosa. Les expériences ont démontré que le zinc et le manganèse étaient responsables de la stimulation du métabolisme de croissance et production de conidies de P. flocculosa. Ces deux oligoéléments permettent d'obtenir les mêmes effets que ceux obtenus avec l'extrait de levure. Pour valider ces résultats in vivo, une solution de zinc et manganèse a été vaporisée sur des feuilles de tomates saines sur lesquelles P. flocculosa a ensuite été appliqué. Les observations en microscopie électronique à balayage ont confirmé que P. flocculosa se développait de façon abondante sur la feuille en association avec la solution de zinc et manganèse, résultat qui laisse supposer que le champignon extrait ces minéraux essentiels à sa croissance à partir des colonies de blanc et exerce ainsi son effet délétère sur cet agent pathogène. Le zinc et le manganèse jouent donc un rôle clé dans la transition morphologique de P. flocculosa, lui conférant son activité de lutte biologique et sa spécificité à l'égard des colonies des Érysiphales.

La lutte aux maladies des cultures est une bataille de tous les instants. Au cours du XXe siècle, l’essor de l’industrie chimique a mené à la création de nombreux produits phytosanitaires d’une grande efficacité qui a permis d’accroître de manière substantielle la productivité des cultures. Aujourd’hui, l’utilisation intensive de certains de ces produits est reconnue comme entrainant de fâcheuses conséquences sur la santé humaine ou celle des écosystèmes. À la suite de cette prise de conscience, plusieurs initiatives visant à réduire la dépendance des systèmes agricoles aux pesticides les plus nocifs ont vu le jour. Une des approches préconisées, celle de la lutte biologique, consiste à tirer profit de l’antagonisme naturel qui caractérise la relation qu’entretiennent certains organismes entre eux. La découverte de l’agent de lutte biologique (ALB) Pseudozyma flocculosa et les efforts de recherche qui en ont découlé s’inscrivent directement dans cette mouvance. Depuis 1987, les découvertes concernant ce champignon n’ont cessé d’étonner et d’entretenir de grands espoirs quant à l’élaboration d’un biofongicide efficace et écologique pour la lutte contre la maladie du blanc (oïdium) qui affecte plusieurs espèces végétales. La présente thèse constitue la somme des découvertes les plus récentes concernant P. flocculosa. En effet, l’avènement des technologies de séquençage a créé de nouvelles opportunités de recherche qui ont mené à de nombreuses découvertes d’une importance capitale. D’une part, il a été possible de caractériser avec précision la batterie de gènes associée à la synthèse de la flocculosine. Pour ce faire, l’utilisation d’un système d’expression hétérologue basé sur la transformation génétique de l’espèce Ustilago maydis a été nécessaire pour déterminer la fonction de certains gènes. D’autre part, une analyse comparative en profondeur du génome de l’ALB et de ceux d’Ustilaginales apparentées a permis de mieux comprendre l’évolution de l’organisme tout en générant un ensemble d’informations de haute qualité et de grande valeur. Le développement de nouvelles approches basées sur la biologie d’organismes bénéfiques demande beaucoup d’efforts. Cependant, les retombées potentielles associées à la réduction de l’utilisation de produits nocifs pour l’environnement et la santé humaine dépassent bien souvent les investissements qui y sont consacrés. / Controlling pests is an important part of crop cultivation. The rise of the chemical industry during the XXth century led to the design of efficient molecules for the control of plant diseases that prompted a substantial increase in crop productivity. However, the intensive use of pesticides in agricultural systems quickly raised doubts about sustainablility. In response to those concerns, many initiatives were put in place to reduce the reliance of farmers on synthetic pesticides. Biological control, one of these initiatives, is about favoring the growth and the dispersal of natural antagonists in agricultural systems to fight plant diseases as ecological alternatives to pesticides. The discovery and characterization of the biocontrol agent Pseudozyma flocculosa was part of this trend. Since 1987, the discoveries regarding the biology of the fungus never ceased to amaze, maintaining hopes for the development of an efficicent biofongicide to control powdery mildews in many crops. This thesis presents the most recent work that was accomplished to reveal the most interesting properties associated with the biology of the biocontrol agent. Much of this work was made possible, or at least facilitated, by the access to emerging and powerful DNA sequencing and bioinformatics tools that created opportunities to answer pending questions in new ways. First, we characterized with precision the function and structure of the flocculosin gene cluster. Using the genomic sequences of P. flocculosa, we localized a putative gene cluster for flocculosin and caraterized the function of the most ambiguous genes using Ustilago maydis as a heterologous expression system. Second, we conducted an in-depth comparative analysis of P. flocculosa genome with those of other Ustilaginales species. This work shed a new light on the evolution of the species and that generated a data set of high quality that will be available for future projects. The development of novel alternatives to pesticides based on the biology of beneficial organisms requires time and effort. However, the beneficial impact associated with a reduction in pesticide use often exceeds the investments that lead to such a positive outcome.

La flocculosine est un glycolipide de 854 Da qui a été reconnu responsable de l'activité antagoniste de Pseudozyma flocculosa, un agent de lutte biologique contre le blanc et principe actif du biofongicide Sporodex®. Il a été démontré récemment que cette molécule avait une activité délétère contre plusieurs microorganismes. Or, selon le dernier rapport de l'organisation mondiale de la santé, les maladies infectieuses arrivent toujours au deuxième rang des principales causes de mortalité au monde. De plus, l'apparition croissante de microorganismes résistants aux agents antimicrobiens a considérablement réduit l'efficacité de l'arsenal thérapeutique disponible, ce qui accentue l'urgence du besoin de nouvelles molécules antimicrobiennes. L'objectif général de ce projet était donc d'évaluer le potentiel antimicrobien de la flocculosine afin de préciser son spectre d'activité, d'évaluer sa toxicité, de clarifier son mode d'action et de définir son implication dans l'écologie de P. flocculosa . En conditions acides, la flocculosine a démontré des effets délétères et très rapides contre une vaste gamme d'agents infectieux comprenant levures et bactéries. De plus, la molécule n'a pas été affectée par les divers mécanismes de résistance présents et l'association de la flocculosine avec l'amphotéricine B a révélé un fort synergisme, suggérant son utilisation comme adjuvant afin de réduire la toxicité et de contourner certaines résistances. Par ailleurs, la flocculosine n'a démontré aucune toxicité sur les différentes lignées cellulaires humaines exposées. Il a aussi été démontré que le glycolipide agissait au niveau de la membrane plasmique et que sa spécificité dépendait de la composition de celles-ci. En outre, ces travaux ont permis de révéler un nouveau rôle de la flocculosine dans le pouvoir adaptatif de P. flocculosa, celui de réserve énergétique. Les études de dégradation ont en effet indiqué que le champignon était capable de cataboliser sa toxine à l'aide d'une enzyme dans certaines conditions limitantes. Cela suggère un rôle beaucoup plus étendu que prévu pour la flocculosine; non pas limité à la protection de la niche écologique du champignon mais aussi impliqué au sein de processus énergétiques complexes. Bref, cette étude a démontré le potentiel antimicrobien de la flocculosine tout en jetant un éclairage nouveau sur ses implications biologiques.

Pseudozyma flocculosa is a biological control agent related to anamorphs of the Ustilaginales. Its mode of action against powdery mildew fimgi is antibiosis, and the metabolite flocculosin is believed to be a key factor in its biocontrol properties. In order to identify genes involved in the control of these properties, random insertional mutagenesis had previously been attempted, but a genetic transformation method yielding single genomic insertions was required. To this end, genetic transformation by Agrobacterium tumefaciens was optimized in the related species P. antarctica, in the hope of eventually adapting this method to P. flocculosa. However, the type of genomic insertions obtained in P. antarctica differed from expectations, and thus the emphasis was rather placed on identification of specific genes. To this end, we searched for homologs of genes identified in Ustilago maydis as involved in the biosynthesis of ustilagic acid, a molecule of very similar chemical structure to flocculosin. Homologs of U. maydis cypl, catalyzing the terminal hydroxylation of palmitic acid prior to its incorporation to the cellobiose via a Oglycosidic bond, were isolated and sequenced in P. flocculosa and P. fusiformata. Furthermore, a homolog of U. maydis uatl, involved in acetylation of ustilagic acid, was partially sequenced from P. flocculosa. Ail three newly sequenced genes showed strong séquence similarity to their counterparts in U. maydis. Cypl expression followed a similar pattern of down-regulation when P. flocculosa was actively growing in vitro and in vivo, thereby suggesting that the molecule was preferentially synthesized early in the process of searching for a growth substrate. Also, an attempt was made to generate a P. flocculosa knockout mutant of cypl, although no transformant obtained showed disruption of the cypl genomic locus. This study provides the first évidence of genes potentially involved in the production of flocculosin, a molecule associated with the biocontrol properties of P. flocculosa. / Pseudozyma flocculosa est un agent de lutte biologique contre le blanc des cultures apparenté aux anamorphes des Ustilaginales. Son mode d'action contre le blanc est l'antibiose, et la flocculosine serait la molécule antifongique lui conférant cette action. Dans le but d'identifier des gènes impliqués dans le contrôle de l'antibiose, des essais de mutagenèse insertionnelle aléatoire avaient déjà été entrepris. Afin de faciliter ces travaux, une méthodologie de transformation génétique générant des insertions uniques devait être mise au point. Dans ce but, la transformation génétique par Agrobacterium iumefaciens a été appliquée chez l'espèce voisine P. antarcîica dans le but éventuel de pouvoir l'adapter à P. flocculosa. Toutefois, le type d'insertions obtenues dans le génome ne correspondait pas aux attentes chez P. antarcîica. L'approche a ainsi été redirigée vers l'identification de gènes spécifiques, dont les homologues caractérisés chez Ustilago maydis sont impliqués dans la synthèse de l'acide ustilagique, une molécule dont la structure chimique est très similaire à celle de la flocculosine. Des homologues du gène cypl d'U. maydis, dont le produit serait impliqué dans l'hydroxylation terminale de l'acide palmitique avant son incorporation au cellobioside via un lien O-glycoside, ont été isolés et séquences chez P. flocculosa et P. fusiformata. De plus, un homologue du gène uatl d'U. maydis, dont le produit serait impliqué dans l'acétylation de la molécule, a été partiellement séquence chez P. flocculosa. L'expression de cypl a montré un patron de sous-expression similaire lorsque P. flocculosa était en croissance active in vitro et in vivo, suggérant donc que la flocculosine est synthétisée principalement au début du processus de recherche d'un nouveau substrat de croissance. Par ailleurs, un essai de génération d'un mutant de P. flocculosa contenant une délétion du gène cypl a été effectué, mais le locus génomique cypl était intact chez tous les transformants obtenus. Cette étude représente la première découverte de gènes dont les produits sont potentiellement impliqués dans la production de la flocculosine, une molécule associée au potentiel de lutte biologique de P. flocculosa.

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Afin d'améliorer nos pratiques agricoles dans le contexte d'une agriculture durable, plusieurs agents de lutte biologique (ALB) ont été développés, testés et sont maintenant utilisés dans le monde pour combattre les pertes de rendements causées par les maladies. Blumeria graminis f. sp. hordei ( Bgh) est l'agent pathogène responsable du blanc de l'orge et peut réduire les rendements de cette culture jusqu'à 40%. Un champignon épiphyte, Pseudozyma flocculosa, a été découvert et identifié en 1987 en association étroite avec le blanc du trèfle. Les chercheurs ont alors remarqué que ce champignon exhibait une forte activité antagoniste contre le blanc en détruisant les structures de l'agent pathogène. Suite à d'autres travaux, il est apparu que ce comportement antagoniste était dirigé contre tous les membres des Erysiphales et semblait lié à la synthèse d'un glycolipide antifongique soit la flocculosine. Toutefois, on n'est toujours pas parvenus à associer l'efficacité de l'ALB avec la production de ce glycolipide. Ces observations suggèrent que d'autres facteurs seraient impliqués lorsque les deux protagonistes, l'ALB et le blanc, sont en contact. L'objectif principal de ce projet était donc de chercher d'autres mécanismes moléculaires pouvant expliquer l'interaction P. flocculosa-blanc et orge, en faisant une analyse transcriptomique complète des trois protagonistes en même temps. L'interaction tripartite a été échantillonnée à différents temps suivant l'inoculation de P. flocculosa sur des feuilles d'orge présentant déjà une intensité de blanc d'environ 50%. Les échantillons de feuilles prélevés ont ensuite été utilisés pour l'extraction de l'ARN qui ont été ensuite transformés en ADNc pour la préparation des librairies. Cinq répliquats ont été effectués pour chaque temps et le tout a été séquencé à l'aide de séquençage par synthèse Illumina HiSeq. Les séquences obtenues (reads) ont ensuite été analysées à l'aide du logiciel CLC Genomics Workbench. Brièvement, les séquences obtenues ont été cartographiées sur les trois génomes de référence. Suite à la cartographie, les analyses d'expression ont été conduites et les gènes exprimés de façon différentielle ont été recherchés. Cette étape a été conduite en portant une attention particulière aux gènes codant pour un groupe de protéines appelées CSEP pour “candidate secreted effector proteins” qui seraient possiblement impliquées dans l'interaction tripartite. Parmi les protéines exprimées de façon différentielle en présence du blanc ou en absence de ce dernier, nous avons pu constater que certaines CSEP étaient fortement exprimées en présence du blanc. Ces résultats sont prometteurs et nous offrent une piste certaine pour l'élucidation des mécanismes impliqués dans cette interaction tripartite.