Submitted by Regina Correa (rehecorrea@gmail.com) on 2016-10-03T13:40:14Z No. of bitstreams: 1 TeseTBG.pdf: 3746339 bytes, checksum: 9615be9a8eb8f2cee714310f4d54e952 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-10T14:05:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseTBG.pdf: 3746339 bytes, checksum: 9615be9a8eb8f2cee714310f4d54e952 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-10T14:06:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseTBG.pdf: 3746339 bytes, checksum: 9615be9a8eb8f2cee714310f4d54e952 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-10T14:06:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseTBG.pdf: 3746339 bytes, checksum: 9615be9a8eb8f2cee714310f4d54e952 (MD5) Previous issue date: 2015-11-13 / Não recebi financiamento / In this work, a photometer/fluorometer micro-controlled (P2FM) multifunctional, portable, communicated by USB 2.0, robust, easy handling and with low consumption of energy was developed. The P2FM was built using a micro-controlled (PIC-18F2455) as central unit of process (CPU), two tricolors LEDs (470, 528, 621 nm) as source of radiation, a multichannel sensor (TCS3200) and the management program wrote in Visual Studio. One of the two LED was used as radiation source for photometric mode. The TCS-3200 is a multichannel sensor with four photosensitive tracks: 480, 540, 750 e 830 nm, being that selection of track is performed by program controlled. The management program operates sending functions for microcontroller, record of dates and storage of signal (*.txt) through of USB port 2.0 (5.0 VCC, 300 mA). The P2FM is compact, with 3.5 cm × 7.0 cm × 8.5 cm size and 159.4 g of weight, considered as a portable device. In the program is selected of function mode: photometer or fluorimeter. In the analytic performance test by photometric mode, were used three solutions amaranth (AM), blue light (AB) and tartrazine (TT). The detection limits obtained were 1.6 × 10−7, 5.4 × 10−7 e 1.9 × 10−6 mol L−1 for AM, AB and TT, respectively. The quantification limits obtained were 4.8 × 10−7, 1.6 × 10−6 e 5.9 × 10−6 mol L−1 for AM, AB and TT, respectively. The correlation coefficients were AM = 0.997, AB = 0.975 and TT = 0.994. The analytic performance for fluorometric mode was carried using in both fluorescein (FL) and Rodamine 6G (R6G) solutions, were obtained a detection limit of 8.3 × 10−8 and 4.79 × 10−8 mol L−1, respectively for FL and R6G. The correlations coefficients were 0.997 for FL and 0.999 for R6G. Also, the proposed device was successfully used to sulphite determination in drinks, total hardness in water, determination of stability constant and study of stoichiometry of a chromogenic complex, aiming to show any applications of photometer/fluorimeter. The constant of formation obtained was 5.04 × 1018 is concordant with that presented in previous reports 6.2 × 1018. In sulphite determinations on eight samples of drinks, the paired studen’s t-test showed that reference method and photometric method using P2FM was 0.66 times smaller than critic value (2.36, α = 0.05). The total hardness in water was determined by fluorometric method, being that the P2FM showed best sensibility 8.94 × 106 that a determination using the RF5301/PC spectrofluorometer. The paired studen’s t-test (α = 0.05) no showed significant differences, calculated t (0.36) small than tabulated t (2.01). / Um fotômetro/fluorímetro microcontrolado (P2FM) multifuncional, portátil, comunicado via USB 2.0, robusto, de fácil operação e com baixo consumo de energia foi desenvolvido neste trabalho. O P2FM foi construído utilizando-se um microcontrolador (PIC-18F2455) como unidade central de processamento (CPU), dois LEDs tricolores (470, 528, 621 nm) como fonte de radiação, um sensor multicanal (TCS3200), e o programa de gerenciamento escrito em Visual Studio. Um dos LED foi utilizado como fonte de radiação para o modo fotométrico e o outro para o modo fluorimétrico. O TCS-3200 é um sensor multicanal com quatro faixas fotossensíveis: 480, 540, 750 e 830 nm, sendo que a seleção da faixa é realizada via programa de controle. O programa de gerenciamento atua no envio de funções para o microcontrolador, registro de dados e armazenamento do sinal (*.txt) através da porta USB 2.0 (5,0 VCC, 300 mA). O P2FM é compacto, com dimensões de 3,5 cm × 7,0 cm × 8,5 cm e massa de 159,4 g, configurando-se um instrumento portátil. No programa é selecionado o modo de funcionamento: fotométrico ou fluorimétrico. Nos testes de desempenho analítico no modo fotométrico foram empregadas soluções dos corantes amaranto (AM), azul brilhante (AB) e tartrazina (TT). Os limites de detecção obtidos foram 1,6 × 10, 5,4 × 107 e 1,9 × 106 mol L1 para AM, AB e TT, respectivamente. Os limites de quantificação obtidos foram 4,8 × 107, 1,6 × 10 e 5,9 × 106 mol L1 para AM, AB e TT, respectivamente. Os coeficientes de correlação foram: AM = 0,997, AB = 0,975 e TT = 0,994. O desempenho analítico no modo fluorimétrico foram realizados empregando-se soluções de fluoresceína (FL) e Rodamina 6G (R6G), sendo obtidos um limite de detecção de 8,3 × 108 e 4,79 × 108 mol L1, respectivamente para FL e R6G. Os coeficientes de correlação foram 0,997 para FL e 0,999 para R6G. Ademais, o instrumento proposto foi aplicado com sucesso na determinação de sulfito em bebidas, dureza total em água e determinação da constante de estabilidade e estequiometria de um complexo cromogênico, objetivando mostrar algumas aplicações do fotômetro/fluorímetro. A constante de formação obtida (5,04 × 1018) está em consonância com aquela apresentada na literatura, 6,2 × 1018. Na determinação de sulfito em oito amostras de bebidas, o teste t-pareado mostrou que método de referência e o método fotométrico usando P2FM foi de 0,66 menor do que o valor crítico (2,36, α = 0,05). A dureza da água foi determinada empregando-se o método fluorimétrico, sendo que o P2FM apresentou melhor sensibilidade 8,94 × 106 que a determinada empregandose o espectrofluorímetro (RF5301/PC). O teste t-pareado (α = 0,05) mostrou que não há diferença significativa, t critico (0,36) menor que o t crítico (2,01).

O estresse oxidativo é prejudicial a diversas características espermáticas, como motilidade e integridade das membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial, podendo levar a redução da fertilidade, inclusive no sêmen refrigerado. Poucos estudos foram realizados utilizando-se a melatonina com o intuito de melhorar as características espermáticas em equinos. O mioinositol e o ácido ferúlico, por sua vez, nunca foram utilizados nessa espécie. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a influência desses compostos nas características do sêmen equino refrigerado. Para isso, foram utilizadas quatro ejaculados, de quatro animais conhecidamente férteis, com idade entre 4 e 8 anos. Após a coleta, o sêmen foi distribuído entre os quatro tratamentos, sendo eles, melatonina, ácido ferúlico, mioinositol e controle, utilizando-se diluidor á base de leite desnatado, na concentração de 25 milhões de espermatozoides por mL. As amostras foram refrigeradas à 5°C, sob uma curva de refrigeração de 0,09°C/min e avaliadas com 0, 4 e 8 horas de refrigeração, quanto às características de motilidade (CASA), integridade das membranas plasmática, acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial (utilizando-se as sondas fluorescentes PI, H342, FITC-PSA e JC-1, por microscopia de epifluorescência), e quantificação da produção de espécies reativas de oxigênio (utilizando-se a sonda fluorescente DCFH-DA, por fluorímetria). Os dados obtidos foram analisados pelo programa SAS, versão 9.3 (SAS, 2011). As características de motilidade não foram afetadas pelos tratamentos, com exceção da Amplitude Lateral de Cabeça (ALH, µm/s), que foi maior nas amostras tratadas com mioinositol (8,34± 0,21), em relação ao grupo controle (7,87 ± 0,20). Foi observado efeito de interação entre tempo e tratamento para a variável Velocidade de Trajeto (VAP; P<0,05). Quanto à integridade das membranas, todas as variáveis sofreram efeito dos tratamentos, com exceção da porcentagem de células com membrana plasmática intacta (MPI). A porcentagem de células com membranas íntegras (membrana plasmática intacta, acrossomo intacto e alto potencial de mitocôndria; PIAIA), foi maior nos grupos tratados com melatonina (78,07 ± 2,02) e com ácido ferúlico (78,78 ± 1,66), em comparação ao grupo controle (73,75 ± 2,01). A porcentagem de células com alto potencial de mitocôndria (APM), também foi maior nos grupos tratados com melatonina (80,11± 1,85) e com ácido ferúlico (81,01 ± 1,50), em relação ao grupo controle (76,56 ± 1,99). Já a porcentagem de membrana acrossomal intacta (MAI), foi maior no grupo tratado com melatonina (99,69± 0,07), em relação a todos os outros grupos (99,41 ± 0,09; 99,33 ± 0,09; 99,39 ± 0,09; mioinositol, acido ferúlico e controle, respectivamente). A fluorescência emitida, relativa à quantidade de espécies reativas de oxigênio presentes na amostra não foi alterada pelos tratamentos, em nenhum dos tempos. Com isso conclui-se que a adição de melatonina e ácido ferúlico aumenta a porcentagem de células com alto potencial de mitocôndria, sugerindo a adição desses compostos ao diluidor visando maior manutenção da viabilidade por até 8 horas de refrigeração. / Oxidative stress is detrimental to several sperm characteristics such as motility, plasma, acrosomal and mitochondrial membrane integrity, and can lead to reduced fertility, also in cooled semen. Few studies were performed using melatonin intending an improvement in equine sperm characteristics. Para isso, foram utilizadas quatro ejaculados, de quatro animais conhecidamente férteis, com idade entre 4 e 8 anos. Myoinositol and ferulic acid, in turn, were never used in this species. The objective of the present study was to evaluate the influence of these compounds in equine cooled semen characteristics. Four collections from four stallions of known fertility aged between 4 and 8 years old were used. After collection, semen was distributed in one of the four treatments, melatonin, ferulic acid, myoinositol and control. A skim milk based extender was used and semen was diluted to a final concentration of 25 million sperm per mL. Samples were cooled at 5°C, at a cooling rate of 0.09°C/min and evaluated at 0, 4 and 8 hoours of cooling. CHaracteristics anlyzed were motility (CASA), plasma and acrosomal membrane integrity mytochondrial membrane potential (using florescente probes PI, H342, FITC-PSA e JC-1, using epifluorescence microscopy), and reactive oxygen species production quantification (using DCFH-DA fluorescente probe, by fluorimetry. Data obtained were analyzed using SAS program, 9.3 version (SAS, 2011). Motility characteristics were not affected by treatments, with the exception of average of lateral head displacement (ALH, µm/s), which was greater in myoinositol treated samples (8.34± 0,21), in comparison to the control group (7.87 ± 0.20). An interaction effect was detected between time and treatment for the velocity of the average path (VAP; P<0.05). Regarding membrane integrity, all variables were affected by treatments, with the exception of the percentage of intact plasma membrane cells (IPM). The percentage of cells with intact membranes (intact plasma membrane, intact acrosome, high mytochondrial potential; IPIAH) was greater for the groups treated with melatonin (78.07 ± 2.02) and ferulic acid (78.78 ± 1.66), comparing to the control group (73.75 ± 2.01). The percentage of cells with high mytochondrial potential (HMP) was also greater in melatonina treated group (80.11± 1.85) and ferulic acid (81.01 ± 1.50) comparing to the control group (76.56 ± 1.99). Percentage of cells with intact acrosomal membrane (IAM) was higher in melatonin treated group (99.69± 0.07) than all the other groups (99.41 ± 0.09; 99.33 ± 0.09; 99.39 ± 0.09; myoinositol, ferulic acid and control, respectively). Concerning reactive oxygen species in the sample, emitted fluorescence was not altered by treatments at any moment evaluated. It can be concluded that the addition of melatonin and ferulic acid the percentage of high mitochondrial potential cells, suggesting a beneficial utilization of these coumpounds in the extender for a greater maintenance of viability up to 8 hours of cooling.

O estresse oxidativo é prejudicial a diversas características espermáticas, como motilidade e integridade das membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial, podendo levar a redução da fertilidade, inclusive no sêmen refrigerado. Poucos estudos foram realizados utilizando-se a melatonina com o intuito de melhorar as características espermáticas em equinos. O mioinositol e o ácido ferúlico, por sua vez, nunca foram utilizados nessa espécie. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a influência desses compostos nas características do sêmen equino refrigerado. Para isso, foram utilizadas quatro ejaculados, de quatro animais conhecidamente férteis, com idade entre 4 e 8 anos. Após a coleta, o sêmen foi distribuído entre os quatro tratamentos, sendo eles, melatonina, ácido ferúlico, mioinositol e controle, utilizando-se diluidor á base de leite desnatado, na concentração de 25 milhões de espermatozoides por mL. As amostras foram refrigeradas à 5°C, sob uma curva de refrigeração de 0,09°C/min e avaliadas com 0, 4 e 8 horas de refrigeração, quanto às características de motilidade (CASA), integridade das membranas plasmática, acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial (utilizando-se as sondas fluorescentes PI, H342, FITC-PSA e JC-1, por microscopia de epifluorescência), e quantificação da produção de espécies reativas de oxigênio (utilizando-se a sonda fluorescente DCFH-DA, por fluorímetria). Os dados obtidos foram analisados pelo programa SAS, versão 9.3 (SAS, 2011). As características de motilidade não foram afetadas pelos tratamentos, com exceção da Amplitude Lateral de Cabeça (ALH, µm/s), que foi maior nas amostras tratadas com mioinositol (8,34± 0,21), em relação ao grupo controle (7,87 ± 0,20). Foi observado efeito de interação entre tempo e tratamento para a variável Velocidade de Trajeto (VAP; P<0,05). Quanto à integridade das membranas, todas as variáveis sofreram efeito dos tratamentos, com exceção da porcentagem de células com membrana plasmática intacta (MPI). A porcentagem de células com membranas íntegras (membrana plasmática intacta, acrossomo intacto e alto potencial de mitocôndria; PIAIA), foi maior nos grupos tratados com melatonina (78,07 ± 2,02) e com ácido ferúlico (78,78 ± 1,66), em comparação ao grupo controle (73,75 ± 2,01). A porcentagem de células com alto potencial de mitocôndria (APM), também foi maior nos grupos tratados com melatonina (80,11± 1,85) e com ácido ferúlico (81,01 ± 1,50), em relação ao grupo controle (76,56 ± 1,99). Já a porcentagem de membrana acrossomal intacta (MAI), foi maior no grupo tratado com melatonina (99,69± 0,07), em relação a todos os outros grupos (99,41 ± 0,09; 99,33 ± 0,09; 99,39 ± 0,09; mioinositol, acido ferúlico e controle, respectivamente). A fluorescência emitida, relativa à quantidade de espécies reativas de oxigênio presentes na amostra não foi alterada pelos tratamentos, em nenhum dos tempos. Com isso conclui-se que a adição de melatonina e ácido ferúlico aumenta a porcentagem de células com alto potencial de mitocôndria, sugerindo a adição desses compostos ao diluidor visando maior manutenção da viabilidade por até 8 horas de refrigeração. / Oxidative stress is detrimental to several sperm characteristics such as motility, plasma, acrosomal and mitochondrial membrane integrity, and can lead to reduced fertility, also in cooled semen. Few studies were performed using melatonin intending an improvement in equine sperm characteristics. Para isso, foram utilizadas quatro ejaculados, de quatro animais conhecidamente férteis, com idade entre 4 e 8 anos. Myoinositol and ferulic acid, in turn, were never used in this species. The objective of the present study was to evaluate the influence of these compounds in equine cooled semen characteristics. Four collections from four stallions of known fertility aged between 4 and 8 years old were used. After collection, semen was distributed in one of the four treatments, melatonin, ferulic acid, myoinositol and control. A skim milk based extender was used and semen was diluted to a final concentration of 25 million sperm per mL. Samples were cooled at 5°C, at a cooling rate of 0.09°C/min and evaluated at 0, 4 and 8 hoours of cooling. CHaracteristics anlyzed were motility (CASA), plasma and acrosomal membrane integrity mytochondrial membrane potential (using florescente probes PI, H342, FITC-PSA e JC-1, using epifluorescence microscopy), and reactive oxygen species production quantification (using DCFH-DA fluorescente probe, by fluorimetry. Data obtained were analyzed using SAS program, 9.3 version (SAS, 2011). Motility characteristics were not affected by treatments, with the exception of average of lateral head displacement (ALH, µm/s), which was greater in myoinositol treated samples (8.34± 0,21), in comparison to the control group (7.87 ± 0.20). An interaction effect was detected between time and treatment for the velocity of the average path (VAP; P<0.05). Regarding membrane integrity, all variables were affected by treatments, with the exception of the percentage of intact plasma membrane cells (IPM). The percentage of cells with intact membranes (intact plasma membrane, intact acrosome, high mytochondrial potential; IPIAH) was greater for the groups treated with melatonin (78.07 ± 2.02) and ferulic acid (78.78 ± 1.66), comparing to the control group (73.75 ± 2.01). The percentage of cells with high mytochondrial potential (HMP) was also greater in melatonina treated group (80.11± 1.85) and ferulic acid (81.01 ± 1.50) comparing to the control group (76.56 ± 1.99). Percentage of cells with intact acrosomal membrane (IAM) was higher in melatonin treated group (99.69± 0.07) than all the other groups (99.41 ± 0.09; 99.33 ± 0.09; 99.39 ± 0.09; myoinositol, ferulic acid and control, respectively). Concerning reactive oxygen species in the sample, emitted fluorescence was not altered by treatments at any moment evaluated. It can be concluded that the addition of melatonin and ferulic acid the percentage of high mitochondrial potential cells, suggesting a beneficial utilization of these coumpounds in the extender for a greater maintenance of viability up to 8 hours of cooling.