La fonction des canaux ioniques est finement régulée par des changements structuraux de sites clés contrôlant l’ouverture du pore. Ces modulations structurales découlent de l’interaction du canal avec l’environnement local, puisque certains domaines peuvent être suffisamment sensibles à des propriétés physico-chimiques spécifiques. Les mouvements engendrés dans la structure sont notamment perceptibles fonctionnellement lorsque le canal ouvre un passage à certains ions, générant ainsi un courant ionique mesurable selon le potentiel électrochimique. Une description détaillée de ces relations structure-fonction est cependant difficile à obtenir à partir de mesures sur des ensembles de canaux identiques, puisque les fluctuations et les distributions de différentes propriétés individuelles demeurent cachées dans une moyenne. Pour distinguer ces propriétés, des mesures à l’échelle de la molécule unique sont nécessaires. Le but principal de la présente thèse est d’étudier la structure et les mécanismes moléculaires de canaux ioniques par mesures de spectroscopie de fluorescence à l’échelle de la molécule unique. Les études sont particulièrement dirigées vers le développement de nouvelles méthodes ou leur amélioration. Une classe de toxine formeuse de pores a servi de premier modèle d’étude. La fluorescence à l’échelle de la molécule unique a aussi été utilisée pour l’étude d’un récepteur glutamate, d’un récepteur à la glycine et d’un canal potassique procaryote. Le premier volet porte sur l’étude de la stœchiométrie par mesures de photoblanchiment en temps résolu. Cette méthode permet de déterminer directement le nombre de monomères fluorescents dans un complexe isolé par le décompte des sauts discrets de fluorescence suivant les événements de photoblanchiment. Nous présentons ici la première description, à notre connaissance, de l’assemblage dynamique d’une protéine membranaire dans un environnement lipidique. La toxine monomérique purifiée Cry1Aa s’assemble à d’autres monomères selon la concentration et sature en conformation tétramérique. Un programme automatique est ensuite développé pour déterminer la stœchiométrie de protéines membranaires fusionnées à GFP et exprimées à la surface de cellules mammifères. Bien que ce système d’expression soit approprié pour l’étude de protéines d’origine mammifère, le bruit de fluorescence y est particulièrement important et augmente significativement le risque d’erreur dans le décompte manuel des monomères fluorescents. La méthode présentée permet une analyse rapide et automatique basée sur des critères fixes. L’algorithme chargé d’effectuer le décompte des monomères fluorescents a été optimisé à partir de simulations et ajuste ses paramètres de détection automatiquement selon la trace de fluorescence. La composition de deux canaux ioniques a été vérifiée avec succès par ce programme. Finalement, la fluorescence à l’échelle de la molécule unique est mesurée conjointement au courant ionique de canaux potassiques KcsA avec un système de fluorométrie en voltage imposé. Ces enregistrements combinés permettent de décrire la fonction de canaux ioniques simultanément à leur position et densité alors qu’ils diffusent dans une membrane lipidique dont la composition est choisie. Nous avons observé le regroupement de canaux KcsA pour différentes compositions lipidiques. Ce regroupement ne paraît pas être causé par des interactions protéine-protéine, mais plutôt par des microdomaines induits par la forme des canaux reconstitués dans la membrane. Il semble que des canaux regroupés puissent ensuite devenir couplés, se traduisant en ouvertures et fermetures simultanées où les niveaux de conductance sont un multiple de la conductance « normale » d’un canal isolé. De plus, contrairement à ce qui est actuellement suggéré, KcsA ne requiert pas de phospholipide chargé négativement pour sa fonction. Plusieurs mesures indiquent plutôt que des lipides de forme conique dans la phase cristalline liquide sont suffisants pour permettre l’ouverture de canaux KcsA isolés. Des canaux regroupés peuvent quant à eux surmonter la barrière d’énergie pour s’ouvrir de manière coopérative dans des lipides non chargés de forme cylindrique. / The function of ion channels is finely regulated by structural changes of key domains controlling the pore opening. These structural modulations arise from interactions with the local environment, since several domains can be sensitive to specific physico-chemical properties. Movements generated in the structure become notably perceptible when channels open a passage for some ions, thus generating a measurable ionic current according to the electrochemical potential. A detailed description of these structure-function relationships is however difficult to obtain from measurements involving a set of identical channels, since the fluctuations and distributions of different individual properties remain hidden in an average. To differentiate these properties, single-molecule recordings are required. The main purpose of this thesis is to study the structural aspects and molecular mechanisms of ion channels using fluorescence spectroscopy at the single-molecule level. Studies are oriented towards the development or improvement of new methods. A class of pore-forming toxin served as a first study model. Single-molecule fluorescence was also used to study an ionotropic glutamate receptor, a glycine receptor and a prokaryotic potassium channel. The first part focuses on the study of stoichiometry using fluorescent subunit counting. This method allows a direct measure of the number of fluorescent monomers within a single complex by counting the number of step-wise fluorescence intensity decrease following photobleaching events. Here we present the first description, to our knowledge, of the dynamic assembly of a membrane protein in a lipid environment. The purified monomeric Cry1Aa toxin clusters with other monomers depending on the concentration and saturates in a tetrameric conformation. An automated method has been developed to determine the stoichiometry of GFP-tagged membrane proteins expressed on mammalian cell surface. Although this expression system is suitable for the study of proteins of mammalian origin, background fluorescence is particularly important and significantly increases the risk of error in the manual counting process. The presented method allows a fast and automated analysis based on fixed criteria. The algorithm responsible for counting fluorescent monomers was optimized from simulations and adjusts its detection parameters automatically according to the fluorescence trace recording. The composition of two ion channels was successfully verified using this program. Finally, single-molecule fluorescence is measured together with ionic current of KcsA channels using a voltage-clamp fluorometry setup. These combined recordings allowed us to describe the function of ion channels simultaneously to their position and density as they diffuse in a lipid membrane of defined composition. We observed clustering of KcsA channels for various lipid compositions. Clustering does not appear to be caused by protein-protein interaction, but rather by microdomains induced by the shape of reconstructed channels in the lipid bilayer. It seems that clustered KcsA channels could then become coupled, resulting in cooperative gating events with conductance levels multiple to the “normal” unitary channel conductance. Moreover, as opposed to what is currently suggested, KcsA does not require a negatively charged phospholipid for its function. Several of our recordings rather suggest that conically shaped lipids in the lamellar liquid crystalline phase are sufficient to allow single channel opening. Clustered channels can on the other hand overcome the energy barrier to open cooperatively in uncharged cylindrical lipids.

Les canaux potassiques voltage-dépendants forment des tétramères dont chaque sous-unité comporte six segments transmembranaires (S1 à S6). Le pore, formé des segments S5-S6 de chaque sous-unité, est entouré de quatre domaines responsables de la sensibilité au potentiel membranaire, les senseurs de voltage (VS; S1-S4). Lors d’une dépolarisation membranaire, le mouvement des résidus chargés situés dans le VS entraine un mouvement de charges détectable en électrophysiologie, le courant de « gating ». L’activation du VS conduit à l'ouverture du pore, qui se traduit par un changement de conformation en C-terminal du segment S6. Pour élucider les principes qui sous-tendent le couplage électromécanique entre ces deux domaines, nous avons étudié deux régions présumées responsables du couplage chez les canaux de type Shaker K+, soit la région carboxy-terminale du segment S6 et le lien peptidique reliant les segments transmembranaire S4-S5 (S4-5L). Avec la technique du « cut-open voltage clamp fluorometry » (COVCF), nous avons pu déterminer que l’interaction inter-sous-unitaire RELY, formée par des acides aminés situés sur le lien S4-5L et S6 de deux sous-unités voisines, est impliquée dans le développement de la composante lente observée lors du retour des charges de « gating » vers leur état de repos, le « OFF-gating ». Nous avons observé que l’introduction de mutations dans la région RELY module la force de ces interactions moléculaires et élimine l’asymétrie observée dans les courants de « gating » de type sauvage. D’ailleurs, nous démontrons que ce couplage inter-sous-unitaire est responsable de la stabilisation du pore dans l’état ouvert. Nous avons également identifié une interaction intra-sous-unitaire entre les résidus I384 situé sur le lien S4-5L et F484 sur le segment S6 d’une même sous-unité. La déstabilisation de cette interaction hydrophobique découple complètement le mouvement des senseurs de voltage et l'ouverture du pore. Sans cette interaction, l’énergie nécessaire pour activer les VS est moindre en raison de l’absence du poids mécanique appliqué par le pore. De plus, l’abolition du couplage électromécanique élimine également le « mode shift », soit le déplacement de la dépendance au voltage des charges de transfert (QV) vers des potentiels hyperpolarisants. Ceci indique que le poids mécanique du pore imposé au VS entraine le « mode shift », en modulant la conformation intrinsèque du VS par un processus allostérique. / Voltage-gated potassium channels are tetramers and each subunit is formed of six transmembrane segments (S1 to S6). The pore, formed by the S5-S6 segments of each subunit, is surrounded by four modules responsible for sensitivity to the membrane potential, the voltage sensors (VS, S1-S4). During membrane depolarization, the movement of charged residues located in the VS causes a detectable charge movement called the gating current. The activation of the VS led to the opening of the pore, resulting in a conformational change in the C-terminal segment of S6. To elucidate the principles underlying the electromechanical coupling between these two domains, we examined two regions presumed responsible for the coupling among channels of the Shaker K + family: the carboxy-terminal region of S6 and the peptide bond linking the transmembrane segments S4-S5 (S4-5L). Using the cut-open voltage clamp fluorometry (COVCF), we have determined that the RELY inter-subunit interaction, formed by amino acids located on the S4-5L linker and S6 of two neighboring subunits, is involved in the development of the slow component observed during the return of the gating charges (OFF-gating) to their resting state. The introduction of mutations in the RELY region modulates the strength of these molecular interactions and eliminates the asymmetry observed in the wild type gating currents. Moreover, we demonstrate that this inter-subunit coupling is responsible for stabilizing the pore in the open state. We have also identified an intra-subunit interaction between residues I384 located on the S4-5L linker and F484 on the S6 segment of the same subunit. The destabilization of this hydrophobic interaction uncouples completely the movement of voltage sensors from pore opening. Without this interaction, the energy required to activate the VS is diminished due to the absence of mechanical weight applied by the pore. Furthermore, this uncoupling also eliminates the "mode shift", defined as an amplified shift of the voltage dependence of gating charge (QV) to hyperpolarizing potentials during prolonged depolarization, thus indicating that the mechanical load of the pore influences the entry of the VS into this shifted mode by modulating the conformation of the VS threw an intrinsic allosteric process.

Les canaux potassiques voltage-dépendants forment des tétramères dont chaque sous-unité comporte six segments transmembranaires (S1 à S6). Le pore, formé des segments S5-S6 de chaque sous-unité, est entouré de quatre domaines responsables de la sensibilité au potentiel membranaire, les senseurs de voltage (VS; S1-S4). Lors d’une dépolarisation membranaire, le mouvement des résidus chargés situés dans le VS entraine un mouvement de charges détectable en électrophysiologie, le courant de « gating ». L’activation du VS conduit à l'ouverture du pore, qui se traduit par un changement de conformation en C-terminal du segment S6. Pour élucider les principes qui sous-tendent le couplage électromécanique entre ces deux domaines, nous avons étudié deux régions présumées responsables du couplage chez les canaux de type Shaker K+, soit la région carboxy-terminale du segment S6 et le lien peptidique reliant les segments transmembranaire S4-S5 (S4-5L). Avec la technique du « cut-open voltage clamp fluorometry » (COVCF), nous avons pu déterminer que l’interaction inter-sous-unitaire RELY, formée par des acides aminés situés sur le lien S4-5L et S6 de deux sous-unités voisines, est impliquée dans le développement de la composante lente observée lors du retour des charges de « gating » vers leur état de repos, le « OFF-gating ». Nous avons observé que l’introduction de mutations dans la région RELY module la force de ces interactions moléculaires et élimine l’asymétrie observée dans les courants de « gating » de type sauvage. D’ailleurs, nous démontrons que ce couplage inter-sous-unitaire est responsable de la stabilisation du pore dans l’état ouvert. Nous avons également identifié une interaction intra-sous-unitaire entre les résidus I384 situé sur le lien S4-5L et F484 sur le segment S6 d’une même sous-unité. La déstabilisation de cette interaction hydrophobique découple complètement le mouvement des senseurs de voltage et l'ouverture du pore. Sans cette interaction, l’énergie nécessaire pour activer les VS est moindre en raison de l’absence du poids mécanique appliqué par le pore. De plus, l’abolition du couplage électromécanique élimine également le « mode shift », soit le déplacement de la dépendance au voltage des charges de transfert (QV) vers des potentiels hyperpolarisants. Ceci indique que le poids mécanique du pore imposé au VS entraine le « mode shift », en modulant la conformation intrinsèque du VS par un processus allostérique. / Voltage-gated potassium channels are tetramers and each subunit is formed of six transmembrane segments (S1 to S6). The pore, formed by the S5-S6 segments of each subunit, is surrounded by four modules responsible for sensitivity to the membrane potential, the voltage sensors (VS, S1-S4). During membrane depolarization, the movement of charged residues located in the VS causes a detectable charge movement called the gating current. The activation of the VS led to the opening of the pore, resulting in a conformational change in the C-terminal segment of S6. To elucidate the principles underlying the electromechanical coupling between these two domains, we examined two regions presumed responsible for the coupling among channels of the Shaker K + family: the carboxy-terminal region of S6 and the peptide bond linking the transmembrane segments S4-S5 (S4-5L). Using the cut-open voltage clamp fluorometry (COVCF), we have determined that the RELY inter-subunit interaction, formed by amino acids located on the S4-5L linker and S6 of two neighboring subunits, is involved in the development of the slow component observed during the return of the gating charges (OFF-gating) to their resting state. The introduction of mutations in the RELY region modulates the strength of these molecular interactions and eliminates the asymmetry observed in the wild type gating currents. Moreover, we demonstrate that this inter-subunit coupling is responsible for stabilizing the pore in the open state. We have also identified an intra-subunit interaction between residues I384 located on the S4-5L linker and F484 on the S6 segment of the same subunit. The destabilization of this hydrophobic interaction uncouples completely the movement of voltage sensors from pore opening. Without this interaction, the energy required to activate the VS is diminished due to the absence of mechanical weight applied by the pore. Furthermore, this uncoupling also eliminates the "mode shift", defined as an amplified shift of the voltage dependence of gating charge (QV) to hyperpolarizing potentials during prolonged depolarization, thus indicating that the mechanical load of the pore influences the entry of the VS into this shifted mode by modulating the conformation of the VS threw an intrinsic allosteric process.

Les canaux ioniques sont des complexes macromoléculaires clés exprimés dans tous les types de cellules et sont impliqués dans divers processus physiologiques, y compris la génération et la propagation de potentiels d'action. Des canaux défectueux conduisent à des maladies graves, notamment l'épilepsie, des arythmies et des syndromes douloureux, ce qui en fait une cible potentielle intéressante pour le développement de médicaments. Pour améliorer notre compréhension de ces assemblages biologiques et éventuellement trouver des traitements spécifiques pour les canalopathies, il est crucial d'étudier la structure et la fonction des canaux ioniques. L'objectif principal de cette thèse a été d'étudier ce type de détails structurels et fonctionnels pour trois canaux ioniques associés aux domaines des capteurs de douleur et des canaux potassiques voltage-dépendants en utilisant des techniques de fluorescence et d'électrophysiologie. Dans le premier projet, nous avons étudié la stœchiométrie des canaux hétéromères Kv2.1 / 6.4 (chapitre trois). La technique du décompte de sous-unités isolées (single subunit counting :ssc) permet de compter les sous-unités marquées par fluorescence d’un complexe isolé en déterminant le nombre d'événements de photoblanchiment, qui apparaissent en sauts irréversibles vers le bas sur les traces de fluorescence. Pour désigner la stœchiométrie la plus probable, nous avons utilisé des calculs de probabilités pondérées et avons constaté que les canaux Kv2.1 / 6.4 s'expriment dans un arrangement 2 : 2. Plus précisément, les études fonctionnelles des canaux concatémériques montrent que les sous-unités Kv6.4 et 2.1 doivent être disposées de manière alternée. Le deuxième projet était également basé sur des expériences de SSC et visait à déterminer l'état oligomérique du nouveau canal ionique TACAN (chapitre quatre). Nous avons trouvé une portion significative de canaux intracellulaires, ce qui a provoqué une fluorescence de fond dans les expériences de SSC traditionnelles réalisées avec les cellules mammifères. Pour améliorer le rapport du signal sur bruit de fond, nous avons effectué des expériences de SSC sur des canaux purifiés qui ont été immobilisés sur des lamelles de verre fonctionnalisées Ni-NTA. En utilisant la méthode de calcul décrite dans le premier projet, nous avons trouvé différents états oligomériques et proposons que les canaux TACAN natifs s'assemblent en tétramères qui sont instables lorsqu'ils sont solubilisés dans un détergent. Dans le dernier projet, nous avons étudié la relation structure-fonction de la sous-unité auxiliaire DPP6 pour les canaux Kv4.2 (chapitre cinq). Ici, nous avons progressivement tronqué le grand domaine extracellulaire de 700 acides aminés de DPP6 et étudié son effet sur les courants macroscopiques en utilisant la technique du cut-open voltage clamp. Nous avons constaté que les sous-unités DPP6 avec un domaine extracellulaire court ne parviennent pas à moduler les propriétés du canal aussi efficacement que la DPP6 pleine longueur. Plus précisément, la seconde moitié du domaine extracellulaire b-propeller de DPP6 est responsable d'une inactivation du canal considérablement accélérée. Sur la base de la structure cristalline du domaine extracellulaire, nous avons proposé qu'un domaine b-propeller stable et possiblement la formation de dimères DPP6 sont responsables de la déstabilisation efficace de l'état du canal ouvert. / Ion channels are key macromolecular complexes expressed in all cell types and are involved in various physiological processes including the generation and propagation of action potentials. Defective channels lead to severe diseases including epilepsy, arrhythmias and pain syndromes making them an interesting potential drug target. To improve our understanding of these biological assemblies and eventually find specific treatments for channelopathies, it is crucial to study the structure and function of ion channels. The main purpose of this thesis has been to investigate such structural and functional details of three ion channel complexes from the field of pain sensors and voltage-gated potassium channels using fluorescence and electrophysiological techniques. In the first project, we studied the stoichiometry of heteromeric Kv2.1/6.4 channel complexes (chapter three). Single subunit counting (SSC) allows to directly count the number of fluorescently labeled subunits by determining the number of irreversible, step-wise photobleaching events. To determine the most probable stoichiometry, we used weighted likelihood calculations and found that Kv2.1/6.4 channels express in a 2:2 arrangement. More precisely, functional studies of concatemeric channels (performed by our collaborators) illustrate that Kv6.4 and 2.1 subunits need to be arranged in an alternating fashion. The second project was also based on SSC experiments and aimed at determining the oligomeric state of the novel ion channel TACAN (chapter four). We found a significant amount of channels in the intracellular which caused background fluorescence in traditional SSC experiments performed in cells. To improve the signal to background ratio, we performed SSC experiments on purified channels that were immobilized on Ni-NTA functionalized glass coverslips. Using the model selection method described in the first project, we found different oligomeric states and propose that native TACAN channels assemble as tetramers which are unstable when solubilized in detergent. In the last project, we investigated the structure-function relation of the auxiliary DPP6 subunit in Kv4.2 channel complexes (chapter five). Here, we progressively truncated DPP6’s 700 amino acids long extracellular domain and studied its effect on macroscopic currents using the cut-open voltage clamp technique. We found that DPP6 subunits with a short extracellular domain fail to modulate the channel properties as efficiently as the full length DPP6. More precisely, the second half of the extracellular b-propeller domain of DPP6 is responsible for drastically accelerated channel inactivation. Based on the crystal structure of the extracellular domain, we proposed that a stable b-propeller domain and possibly DPP6 dimer formation is responsible for destabilizing the open channel state efficiently.