Le béryllium (Be) est rencontré lors de multiples usages industriels grâce à ses propriétés uniques, toutefois il représente un risque pour la santé des travailleurs qui y sont exposés. La bérylliose chronique est une maladie professionnelle liée à l'exposition au Be. La norme québécoise de 0,15 ug/m3 de Be dans l'air pour une valeur d'exposition moyenne pondérée, nécessite l'utilisation une méthode analytique ayant une faible limite de détection. L'IRSST utilise déjà une méthode permettant d'atteindre une telle limite. Toutefois, la méthode est réalisée à l'aide d'un ICP-MS, un appareil coûteux et peu disponible. Afin de rendre accessible une méthode pouvant être implantée dans les milieux de travail où les contrôles sur la présence de béryllium sont fréquents, la technique de fluorescence moléculaire a été envisagée. La fluorescence est une technique très sensible et des appareils portables sont disponibles commercialement. La détermination du béryllium en fluorescence par la formation d'un complexe avec Je 10-hydroxybenzo[h]quinoline-7-sulfonate a permis d'atteindre une limite de détection aussi basse que 0,0002 ug/échantillon. Les coefficients de variation de moins de 4 % obtenus pour la réplicabilité et la répétabilité de cette méthode assurent une bonne précision des résultats. De plus, cette méthode rencontre peu d'interférences à l'exception du fer. La dissolution de l'oxyde de béryllium, une espèce pratiquement insoluble, avec le 1% NH4HF2 a permis d'atteindre des taux de récupération de près de 96 %. Le NH4HF2 est également compatible avec le réactif. La méthode d'analyse en fluorescence pour la détermination du béryllium est applicable à la méthode d'échantillonnage dans l'air actuellement utilisée par l'IRSST. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : béryllium, fluorescence, 10-hydroxybenzo[h]quinoline-7-sulfonate, ultra-trace, dissolution.

Ces dernières années, un besoin instrumental s'est développé au sein de notre laboratoire afin d'approfondir la caractérisation temporelle des propriétés photochimiques ainsi que photophysiques de divers systèmes fluorescents (fluorophores, structures inorganiques marquées, sondes d'ADN, structures micellaires, etc.). A partir de la mesure du temps d'émission de fluorescence, il est possible d'effectuer l'étude de la dynamique de relaxation d'un fluorophore lors de différentes circonstances (inhibition de la fluorescence, relaxation avec le solvant, anisotropie, FRET, etc.) sur une période oscillant entre quelques nanosecondes jusqu'à quelques picosecondes. Parmi les techniques disponibles pour effectuer de telles mesures, deux ont été sélectionnées et implantées dans notre laboratoire, soit la fluorimetrie de phase et de modulation dans le domaine frequentici ainsi que la fluorimetrie impulsionnelle dans le domaine temporel. Cet ouvrage porte uniquement sur la fluorimetrie impulsionnelle, dont la principale méthode est le comptage de photon unique corrélé au temps (Time-Correlated Single Photon Couniing, TCSPC). En somme, nous avons conçu un système TCSPC en géométrie confocale à partir d'une diode laser émettant à 405 nm et d'une photodiode avalanche à comptage de photons que nous avons caractérisée temporellement à l'aide de fluorophores organiques couramment utilisés (coumarin 153, érythrosine B, fluorescéine, rhodamine B, lucifer yellow). Certaines études sur des échantillons plus complexes (micelles inverses, nanoparticules de silice avec un coeur d'argent) ont aussi été entamées.

Pathogenic nucleic acid detection, in aiming to diagnose infectious diseases and thus better provide a better treatment for them is a very important goal for human health. Moreover, as more and more links are discovered between hereditary diseases and DNA mutations, their diagnostic based on DNA mutation detection is increasingly important. Throughout this Ph. D. project, we developed a fluorometric method for nucleic acid detection based on a water-soluble cationic polymer able to transduce DNA hybridization. We demonstrated the applicability of this method to detect DNA oligonucleotides of different lengths as well as single stranded RNA extracted from the flu virus. With the use of optimized experimental conditions and a custom-built fluorimeter, we demonstrated the ability to detect as little as 220 target DNA copies in the probed volume. Since DNA is present in its double stranded form in most organisms, we also developed an experimental method allowing double stranded DNA detection with the polymeric transducer. Furthermore, we modified our DNA detection process by using fluorescence resonance energy transfer. This process, named fluorescence chain reaction and discovered by Dr. Hoang-Anh Ho, is based on a fluorescence signal amplification mechanism and allows the detection of as few as 20 copies of target DNA. With this method, it was possible to detect a single base mutation responsible for type 1 hereditary tyrosinemia in unpurified genomic DNA extracted from patient blood. Subsequently, we concentrated our efforts on the characterization of this fluorescence signal amplification mechanism. Thus, we established that the fluorescence chain reaction happens in rod-like micellar aggregates of 400 nm in length containing between 4000 and 5000 polymer-tagged DNA probe complexes. This aggregated structure maintains the fluorescent donors near the acceptors, thus greatly helping the fluorescence resonance energy transfer mechanism. Moreover, the conjugated structure of the polymeric transducer allows efficient energy transportation along its chain, accelerating the energy transfer mechanism. / Pathogenic nucleic acid detection, in aiming to diagnose infectious diseases and thus better provide a better treatment for them is a very important goal for human health. Moreover, as more and more links are discovered between hereditary diseases and DNA mutations, their diagnostic based on DNA mutation detection is increasingly important. Throughout this Ph. D. project, we developed a fluorometric method for nucleic acid detection based on a water-soluble cationic polymer able to transduce DNA hybridization. We demonstrated the applicability of this method to detect DNA oligonucleotides of different lengths as well as single stranded RNA extracted from the flu virus. With the use of optimized experimental conditions and a custom-built fluorimeter, we demonstrated the ability to detect as little as 220 target DNA copies in the probed volume. Since DNA is present in its double stranded form in most organisms, we also developed an experimental method allowing double stranded DNA detection with the polymeric transducer. Furthermore, we modified our DNA detection process by using fluorescence resonance energy transfer. This process, named fluorescence chain reaction and discovered by Dr. Hoang-Anh Ho, is based on a fluorescence signal amplification mechanism and allows the detection of as few as 20 copies of target DNA. With this method, it was possible to detect a single base mutation responsible for type 1 hereditary tyrosinemia in unpurified genomic DNA extracted from patient blood. Subsequently, we concentrated our efforts on the characterization of this fluorescence signal amplification mechanism. Thus, we established that the fluorescence chain reaction happens in rod-like micellar aggregates of 400 nm in length containing between 4000 and 5000 polymer-tagged DNA probe complexes. This aggregated structure maintains the fluorescent donors near the acceptors, thus greatly helping the fluorescence resonance energy transfer mechanism. Moreover, the conjugated structure of the polymeric transducer allows efficient energy transportation along its chain, accelerating the energy transfer mechanism. / La détection d'acides nucléiques pathogènes afin de faire le diagnostic de maladies infectieuses et ainsi mieux diriger leur traitement est un enjeu très important pour la santé humaine. Aussi, comme les mutations responsables des maladies génétiques sont de mieux en mieux connues, leur détection est maintenant possible. Au cours de ce projet de doctorat, nous avons élaboré une méthode de détection d'acides nucléiques basée sur un polymère cationique soluble dans l'eau capable de traduire la réaction d'hybridation de l'ADN en un signal optique. Nous avons démontré l'applicabilité de cette méthode pour faire la détection par fluorescence d'oligonucléotides d'ADN de différentes longueurs ainsi que d'ARN viral. Avec l'utilisation de conditions expérimentales optimisées et d'un fluorimètre conçu spécialement pour cette application, nous avons pu détecter aussi peu que 220 copies d'ADN. Par la suite, comme l'ADN est présent chez la majorité des organismes vivants sous la forme de double hélice, nous avons élaboré une méthode expérimentale originale permettant la détection directe de cette forme d'ADN. Par la suite, nous avons modifié notre méthode pour augmenter sa sensibilité en utilisant le transfert énergétique résonnant de fluorescence. Un mécanisme d'amplification du signal de fluorescence a ainsi été découvert par le Dr. Hoang-Anh Ho. Cette méthode que nous avons nommée superallumage, nous a permis de faire la détection d'aussi peu que 5 copies d'ADN cible. Avec cette méthode il a été possible de faire la détection d'une seule mutation génétique responsable de la tyrosinémie héréditaire de type 1 dans des échantillons d'ADN génomique non purifiés. Finalement, nous avons concentré nos efforts sur l'étude du phénomène d'amplification de la fluorescence menant au superallumage. Ainsi, nous avons établi que le superallumage se produit dans des agrégats micellaires ayant la forme d'un bâtonnet mesurant 400 nm de long et contenant entre 4000 et 5000 complexes polymère-sonde d'ADN marquée. Cette structure agrégée maintient les fluorophores donneurs très près des accepteurs de fluorescence, ce qui favorise grandement le processus de transfert énergétique résonnant. De plus, la structure conjuguée du polymère transducteur permet un transport efficace de l'énergie le long de sa chaîne, ce qui accélère le transfert énergétique résonnant.

Le formaldéhyde (HCHO) est un polluant majeur de l’air intérieur. L’objectif de cette thèse est de réaliser les avancées scientifiques et technologiques nécessaires à l’obtention d’une méthode analytique basée sur un dispositif microfluidique de mesure du formaldéhyde dans l’air associant précision, sélectivité, rapidité d’analyse avec pour objectif majeur une autonomie suffisante sur de longues durées, typiquement un mois. Le principe de la méthode reposait initialement sur trois étapes clés, à savoir le piégeage du formaldéhyde gazeux en solution, la réaction du formaldéhyde avec un agent dérivatif, puis la détection du produit de dérivation par colorimétrie ou fluorimétrie. La méthode a finalement évolué vers seulement deux étapes distinctes grâce à l’utilisation d’un dispositif microfluidique innovant dans lequel le piégeage et la réaction ont lieu simultanément. L’étude des performances analytiques du dispositif a permis de valider la méthode développée pendant cette thèse. / Formaldehyde (HCHO) is a major pollutant in indoor air. The objective of this work is to realize the scientific and technological advances required to obtain an analytical method based on a microfluidic device to measure air formaldehyde combining precision, selectivity, analysis speed with for major objective a sufficient autonomy on a long time, typically one month. The principle of the method was initially based on three key steps, the gaseous formaldehyde uptake in solution, the formaldehyde derivatization reaction, then the detection of reaction product by colorimetry or fluorimetry. The method has finally advanced toward only two definite steps thanks to the use of an innovative microfluidic device in which uptake and reaction take place simultaneously. The study of analytical performances of the device allows to validate the method developedduring this work.

De nombreuses bactéries se déplacent en faisant tourner des flagelles rigides ancrés dans leur membrane. À la base de chaque flagelle se trouve un moteur rotatif de quelques dizaines de nanometres de diamètre : le moteur flagellaire bactérien. L'objectif de ces travaux de maîtrise fut de développer de nouveaux marqueurs pour visualiser et mesurer la rotation du moteur flagellaire en l'affectant le moins possible. Trois types de nanoparticules furent étudiés : les points quantiques, les nanoparticules d'or et les nanoparticules Janus. L'intensité du signal et la résistance au photoblanchiment des points quantiques furent comparées à celles de fluorophores "Alexa Fluor". Aussi, différentes méthodes pour attacher spécifiquement ces nanoparticules aux flagelles furent testées. L'utilisation d'anticorps s'est révélée préférable à l'emploi de micelles de phospholipides ou de liens maléimide-cystéine. Après avoir développé la méthode de marquage sur les filaments des bactéries, nous avons ensuite réussi à visualiser des crochets, une structure beaucoup plus petite (55 nm de long). Une première tentative pour mesurer la vitesse de rotation de crochets s'est révélée infructueuse mais informative.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

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Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Le microphytobenthos (MPB) des latitudes tempérées est dominé par les diatomées. Deux grands groupes se distinguent, les épipéliques (mobiles) des sédiments vaseux, et les épipsammiques (fixées) des sédiments sablo-vaseux. Afin de mieux comprendre la production des vasières, le MPB a été étudié par des approches du niveau physiologique au niveau écologique. Dans un premier temps, l’étude s’est focalisée sur des expérimentations en laboratoire. La réponse des différents groupes à la lumière a montré que la forme de vie et la mobilité sont en lien étroit avec la capacité de photoprotection physiologique. Ainsi, les diatomées non-mobiles présentent une meilleure photoprotection physiologique que les diatomées mobiles qui peuvent fuir les excès de lumière. Dans une deuxième partie, le travail s’est effectué sur des échantillons ramenés en laboratoire. Des profils de migrations ont été réalisés par mesure continue de la fluorescence. Il a été établi que le MPB présente un rythme de migration interne pouvant être modulé par la lumière. De plus la qualité de la lumière modifie les profils de migration. Il est communément admis que les phases de division cellulaire se dérouleraient en profondeur. La cytométrie en flux permet de vérifier cette hypothèse. Finalement les mesures effectuées en laboratoire ont été comparées à des mesures effectuées directement sur le terrain à l’échelle de la communauté. Il a ainsi pu être vérifié que la photoprotection sous lumière fluctuante est fonction de la population. Pour les populations épipéliques, la photoprotection physiologique ne varie pas au cours des fluctuations lumineuses, laissant supposer que la migration module ces fluctuations. Les populations épipsammiques, quant à elles, modifient leur réponse physiologique en fonction des fluctuations lumineuses. / Microphytobentos (MPB) from temperate latitude is mainly composed of diatoms. Those microorganisms can be separated in two groups: the epipelic one from muddy sediments (composed of mobile diatoms) and the epipsammic one from sandy-muddy sediments (composed of diatoms living attached to their substrate). In order to investigate mudflats’ primary production, the MPB compartment was studied through diverse approaches from the physiological level to the ecological one. In the first place, laboratory experiments (in vitro experiments), focusing on light reaction of epipelic and epipsammic diatoms, showed that their life form and their mobility were strongly connected to their physiological photoprotection ability. Thereby, the motionless diatoms were characterized by higher physiological photoprotection abilities than the mobile ones, which could avoid excess of light. In the second place, the fluorescence of collected samples (in vivo experiments) was measured to acquire diatoms’ migration profiles. The results pointed out an internal and light-regulated migration pattern of the MPB and furthermore highlighted the effect of light quality on migration profiles. Besides, the commonly accepted hypothesis of deep cell division phases was tested and confirmed through flow cytometry experiments. Eventually, laboratory measurements were compared to in situ ones realized at the scale of the whole community. These comparisons revealed that diatoms photoprotection in fluctuating light depended on the targeted populations. Epipelic organisms were indeed characterized by an unvarying photoprotection, diatoms migration regulating alone the effect of light fluctuations. On the contrary, motionless epipsammic populations required a light-regulated photoprotection.

Les levures Candida sont des pathogènes opportunistes responsables d’infections graves chez les patients immunodéprimés. Au cours de ce travail, nous avons développé un modèle cellulaire in vitro pour la caractérisation multiparamétrique des phénotypes d’interaction entre les levures Candida et les macrophages et les neutrophiles, principaux effecteurs de la défense anti-Candida. Il repose sur l’utilisation de marqueurs fluorescents pour le suivi quantitatif de l’interaction en cytométrie en flux et en fluorimétrie. Ce modèle a été validé par la comparaison de l’interaction de trois espèces de levures, C. albicans, C. glabrata et C. lusitaniae, avec des macrophages murins et des neutrophiles humains. Deux stratégies principales de survie des levures à la phagocytose ont été mises en évidence : par la résistance à la phagolyse et la multiplication des levures à l’intérieur des phagocytes jusqu’à leur éclatement, ou par l’évitement de la phagocytose et la multiplication des levures à l’extérieur des phagocytes. L’interprétation des données quantitatives a été confirmée par microscopie à fluorescence et vidéo-microscopie. Afin de mieux comprendre les interactions Candida-phagocytes, nous avons mis au point des outils pour l’analyse fonctionnelle de gènes chez C. lusitaniae. Une stratégie de PCR chevauchante a été développée pour l’obtention de mutants nuls de C. lusitaniae, sans étape de clonage. C’est ainsi que le gène OLE2, codant une Δ9 désaturase d’acides gras potentiellement impliquée dans la biosynthèse de la prostaglandine PGE2, a été invalidé. Le mutant ole2Δ présentait de très nets défauts de filamentation et de reproduction sexuée. Par rapport à une souche sauvage, le mutant ole2∆ était massivement phagocyté par les macrophages, et la survie des phagocytes était plus importante, ce qui suggère un rôle important des lipides insaturés et des oxylipides dans la signalisation cellulaire au cours de l’interaction Candida-phagocytes. Dans la dernière partie de notre travail, nous avons construit une banque de 10 000 mutants de C. lusitaniae par l’intégration aléatoire d’un marqueur dans le génome. Le criblage de cette banque à travers notre modèle cellulaire d’interaction permettra d’identifier de nouveaux gènes impliqués dans l’interaction avec les phagocytes afin de mieux comprendre la physiopathologie des candidoses et de trouver de nouvelles pistes thérapeutiques. / Candida species are opportunistic pathogens causing severe infectious diseases in immunocompromised patients. In this work, we developed a tool for a multi-parameter characterization of the cell interactions between the yeasts Candida and both macrophages and neutrophils, which constitute the main defense against candidiasis. It relies on the labelling of each population with specific fluorescent markers, and on the use of fluorimetry and flow cytometry to assess interactions. The tool has been validated by comparing the interactions of three yeast species C. albicans, C. glabrata and C. lusitaniae, with murine macrophages and human neutrophils. We found that yeasts use two main ways for escaping phagocytosis, which has been confirmed using video-microscopy: either (1) by surviving to phagolysis and dividing into the phagosome until phagocytes burst, or (2) by avoiding phagocytosis and dividing outside phagocytes. In order to better understand the cellular and molecular mechanisms involved in Candida-phagocytes interactions, we developed new molecular tools for the functional analysis of genes in C. lusitaniae, notably a two-step cloning-free PCR-based method for the deletion of genes. This method was successfully used for the deletion of OLE2, a gene encoding a Δ9-desaturase of fatty acids, possibly implicated in prostaglandin PGE2 biosynthesis. The ole2Δ mutant exhibited strong defects in both pseudofilamention and sexual mating. During macrophages infection, ole2Δ yeast cells were massively internalized and triggered less phagocytes cell death than the wild type strain, suggesting that unsaturated fatty acids and/or oxylipids could play a role during interaction with phagocytes. Lastly, a bank of 10,000 mutants was constructed in C. lusitaniae by the random integration of a genetic marker in the genome. The screening of this bank through our tool to analyse cellular interactions will be undertaken to gain insights into understanding of the early stages of the infectious process.