Le domaine de la microscopie de fluorescence a connu une réelle révolution ces dernières années, permettant d'atteindre des résolutions nanométriques, bien en dessous de la limite de diffraction prédite par Abbe il y a plus d’un siècle. Les techniques basées sur la localisation de molécules individuelles telles que le PALM (Photo-Activation Light Microscopy) ou le (d)STORM (direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) permettent la reconstruction d’images d’échantillons biologiques en 2 et 3 dimensions, avec des résolutions quasi-moléculaires. Néanmoins, même si ces techniques nécessitent une instrumentation relativement simple, elles requièrent des traitements informatiques conséquents, limitant leur utilisation en routine. En effet, plusieurs dizaines de milliers d’images brutes contenant plus d’un million de molécules doivent être acquises et analysées pour reconstruire une seule image. La plupart des outils disponibles nécessitent une analyse post-acquisition, alourdissant considérablement le processus d’acquisition. Par ailleurs la quantification de l’organisation, de la dynamique mais aussi de la stœchiométrie des complexes moléculaires à des échelles nanométriques peut constituer une clé déterminante pour élucider l’origine de certaines maladies. Ces nouvelles techniques offrent de telles capacités, mais les méthodes d’analyse pour y parvenir restent à développer. Afin d’accompagner cette nouvelle vague de microscopie de localisation et de la rendre utilisable en routine par des expérimentateurs non experts, il est primordial de développer des méthodes de localisation et d’analyse efficaces, simples d’emploi et quantitatives. Dans le cadre de ce travail de thèse, nous avons développé dans un premier temps une nouvelle technique de localisation et reconstruction en temps réel basée sur la décomposition en ondelettes et l‘utilisation des cartes GPU pour la microscopie de super-résolution en 2 et 3 dimensions. Dans un second temps, nous avons mis au point une méthode quantitative basée sur la visualisation et la photophysique des fluorophores organiques pour la mesure de la stœchiométrie des récepteurs AMPA dans les synapses à l’échelle nanométrique. / The field of fluorescence microscopy has witnessed a real revolution these last few years, allowing nanometric spatial resolutions, well below the diffraction limit predicted by Abe more than a century ago. Single molecule-based super-resolution techniques such as PALM (Photo-Activation Light Microscopy) or (d)STORM (direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) allow the image reconstruction of biological samples in 2 and 3 dimensions, with close to molecular resolution. However, while they require a quite straightforward instrumentation, they need heavy computation, limiting their use in routine. In practice, few tens of thousands of raw images with more than one million molecules must be acquired and analyzed to reconstruct a single super-resolution image. Most of the available tools require post-acquisition processing, making the acquisition protocol much heavier. In addition, the quantification of the organization, dynamics but also the stoichiometry of biomolecular complexes at nanometer scales can be a key determinant to elucidate the origin of certain diseases. Novel localization microscopy techniques offer such capabilities, but dedicated analysis methods still have to be developed. In order to democratize this new generation of localization microscopy techniques and make them usable in routine by non-experts, it is essential to develop simple and easy to use localization and quantitative analysis methods. During this PhD thesis, we first developed a new technique for real-time localization and reconstruction based on wavelet decomposition and the use of GPU cards for super-resolution microscopy in 2 and 3 dimensions. Second, we have proposed a quantitative method based on the visualization and the photophysics of organic fluorophores for measuring the stoichiometry of AMPA receptors in synapses at the molecular scale.

[ES] La presente tesis doctoral titulada "Nuevas sondas, portadores y pro-fármacos dirigidos a células senescentes in vivo" se centra en el diseño, preparación, caracterización y evaluación de sondas basadas en fluoróforos funcionalizados o en nanopartículas, así como en el desarrollo de profármacos, aplicadas al campo de la senescencia celular. En el primer capítulo se introducen, a nivel general, los diferentes conceptos relacionados con el reconocimiento molecular y la detección de biomarcadores. Seguidamente se introducen conceptos básicos de senescencia celular y envejecimiento, así como el papel que juegan las células senescentes a nivel fisiológico, en enfermedades asociadas al envejecimiento celular y en el cáncer. Por último, se aborda también la creciente necesidad de desarrollar nuevas herramientas de diagnóstico y terapias centradas en la detección y tratamiento de dichas enfermedades. En el segundo capítulo se exponen los objetivos generales de la presente tesis doctoral, así como los objetivos concretos que son abordados en los diferentes capítulos experimentales. En el tercer capítulo se describe una nueva sonda molecular para la detección de senescencia in vivo. En concreto, se describe el diseño de una sonda de dos fotones basada en un fluoróforo de naftalimida conectada, mediante un éster metílico de L-histidina, con una galactosa acetilada que esta unida a uno de los átomos de nitrógeno aromático de la L-histidina a través de un enlace N-glicosídico hidrolizable (AHGa). La sonda inicial presenta una baja emsión pero en células senescentes se transforma en un fluoróforo con alto rendimiento cuantico que permite visualizar estas células debido a la hidrólisis del enlace N-glicosidico por la enzima ¿-galactosidasa sobreexpresada en este tipo de células. La sonda es capaz de detectar in vitro células de melanoma humano SK-Mel-103 tratadas con quimioterapia inductora de senescencia frente a células control. Adicionalmente, se validó la detección in vivo de senescencia en ratones con xenoinjertos tumorales tratados con quimioterapia inductora de senescencia. Basándonos en los resultados obtenidos en el capítulo tres, en el capítulo cuatro se describe un sistema similar cuyas características confieren al fluoróforo una mayor longitud de onda de excitación (HeckGal). La nueva sonda es capaz de detectar células senescentes debido a la sobreexpresión de la enzima ¿-galactosidasa asociada a senescencia en gran variedad de líneas celulares con diversos métodos de inducción de senescencia. Esta sonda se validó también in vivo en un modelo ortotópico de cáncer de mama de ratón tratado con quimioterapia inductora de senescencia, y en un modelo de ratón de fibrosis renal. Seguidamente, el capítulo cinco, se centra en un nuevo concepto de sondas moleculares no invasivas, que proporcionan una señal fácilmente legible a través de simples medidas de fluorescencia de la orina. Esta idea se llevó a cabo mediante la funcionalización de una sonda con grupos que le confieren características diuréticas (rápida eliminación renal) y el concepto se aplicó al diseño de una sonda para a la detección en orina de la carga senescente en diversos modelos. La sonda (Cy7Gal) está basada en la cianina-7 que es hidrolizada por la enzima ¿-galactosidasa en un fluoróforo altamente emisivo Cy7. Cy7Gal y Cy7 contienen restos de ácido sulfónico que aumentan su solubilidad en agua y desencadenan su rápida excreción por el sistema urinario. El grado de senescencia se cuantificó por medición directa de fluorescencia en orina en tres modelos de senescencia en ratones: (i) un modelo ortotópico de cáncer de mama en ratones BALB/cByJ con senescencia inducida por quimioterapia; (ii) ratones BALB / cByJ envejecidos de forma natural; y (iii) ratones con senescencia acelerada (SAMP8, del inglés Senescence Accelerated Mouse-Prone 8). Además, las imágenes IVIS ex vivo permite / [CA] La tesi doctoral titulada "Noves sondes, portadors i profàrmacs dirigits a cèl·lules senescents in vivo" se centra en el desenvolupament i avaluació de sondes basades en fluoròfors funcionalitzats o en nanopartícules, així com en el desenvolupament de profàrmacs, aplicades a el camp de la senescència cel·lular. Primer s'introdueixen els diferents conceptes relacionats amb el sensing i amb la sescencia cel·lular, abordant la necessitat de noves eines diagnòstiques i terapèutiques d'aquestes malalties. En els capítols 3:04 es descriuen una nova sonda molecular dos fotons per a la detecció de senescència in vivo en ratolins amb xenoempelts tumorals tractats amb quimioteràpia inductora de senescència, una altra sonda per a la detecció in vivo en un model ortotòpic de càncer de mama de ratolí tractat amb quimioteràpia inductora de senescència, i en un model de ratolí de fibrosi renal. El capítol 5, se centra en un nou concepte de sondes moleculars no invasives, que proporcionen un senyal fàcilment llegible a través de simples mesures de fluorescència de l'orina. Finalment, pel que fa a detecció de senescència cel·lular es refereix, es presenta en el capítol sis la detecció in vivo de senescència cel·lular mitjançant l'alliberament controlat de Nile Blue en nanopartícules de sílice mesoporoses funcionalitzades amb un galactohexasacárido. Un cop assolits els objectius planificats pel que fa a la diagnosi, en el capítol set es va abordar la millora d'un dels senolíticos més potents i àmpliament conegut en el camp de la senescència cel·lular que existeix a dia d'avui al mercat: el Navitoclax. / [EN] The doctoral thesis entitled "New probes, carriers and pro-drugs directed to senescent cells in vivo" focuses on the development and evaluation of probes based on functionalized fluorophores or nanoparticles, as well as on the development of prodrugs, applied to the field of cellular senescence. First, the different concepts related to sensing and cell sescence are introduced, addressing the need for new diagnostic and therapeutic tools for these diseases. Chapters three and four describe a new two-photon molecular probe for in vivo senescence detection in mice with tumor xenografts treated with senescence-inducing chemotherapy, another probe for in vivo detection in an orthotopic mouse breast cancer model. treated with senescence-inducing chemotherapy, and in a mouse model of renal fibrosis. Chapter five focuses on a new concept of non-invasive molecular probes, which provide an easily readable signal through simple measurements of urine fluorescence. Finally, regarding the detection of cellular senescence, chapter six presents the in vivo detection of cellular senescence through the controlled release of Nile Blue in mesoporous silica nanoparticles functionalized with a galactohexasaccharide. Once the planned objectives with regard to diagnosis had been achieved, chapter seven addressed the improvement of one of the most powerful and widely known senolytics in the field of cellular senescence that exists on the market today: Navitoclax. / The authors thank the financial support from the Spanish Government (projects MAT2015-64139-C4-1-R and AGL2015-70235-C2-2-R) and the Generalitat Valenciana (project PROMETEOII/2014/047). R.M laboratory members thank the financial support from the Spanish Government (project RTI2018-100910-B-C41) and the Generalitat Valenciana (project PROMETEO 2018/024). B.L-T. is grateful to the Spanish Ministry of Economy for their PhD grants (FPU15/02707). Work in the laboratory of MS was funded by the IRB and by grants from the Spanish Ministry of Economy co-funded by the European Regional Development Fund (ERDF) (SAF2013-48256-R), the European Research Council (ERC-2014-AdG/669622), and the “laCaixa” Foundation. D.M.-E. laboratory is supported by the Cancer Research UK (CRUK) Cambridge Centre Early Detection Programme, by a CRUK Early Detection OHSU Project Award (C62187/A26989), by a Medical Research Council (MRC) New Investigators Research Grant (NIRG, MR/R000530/1). Work in the laboratory of I.F. is supported by grants from the Spanish Government (SAF2017-86690-R), Instituto de Salud Carlos III (CIBERNED and RETIC Tercel), and Generalitat Valenciana (Prometeo 2017/030). / Lozano Torres, B. (2021). Novel probes, carriers and prodrugs to target senescent cells in vivo [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/172175 / TESIS

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